כריתת הפטקטומיה חלקית בדגי זברה למבוגרים

Summary

פרוטוקול זה מתאר את ההליך להסרת האונה הגחונית של הכבד בדגי זברה בוגרים כדי לאפשר את המחקר של התחדשות הכבד.

Abstract

אי ספיקת כבד היא אחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם, והתמותה ממחלת כבד כרונית עולה בחדות בארצות הברית. כבדים בריאים מסוגלים להתחדש מנזק רעיל, אך במחלת כבד מתקדמת, היכולת הטבעית של הכבד להתחדש נפגעת. דגי זברה התגלו כמערכת ניסיונית רבת עוצמה לחקר ההתחדשות. הם מודל אידיאלי לחקר התחדשות הכבד מהפטקטומיה החלקית, הליך עם רלוונטיות קלינית ישירה שבה חלק מהכבד מוסר בניתוח, ומשאיר את השאר ללא פגע. אין פרוטוקול סטנדרטי לכריתת הפטי חלקית; מחקרים קודמים המשתמשים במודל זה השתמשו בפרוטוקולים שונים במקצת ודיווחו על תוצאות שונות. מתואר כאן פרוטוקול יעיל, לשחזור לביצוע כריתת hepatectomy חלקית בדגי זברה בוגרים. אנו משתמשים בטכניקה זו כדי להדגים כי דגי זברה מסוגלים להתחדשות אפימורפית של האונה הנתבת. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לחקור עוד יותר את המנגנונים הנדרשים להתחדשות הכבד בדגי זברה.

Introduction

בין האיברים המוצקים בבני אדם, הכבד הוא האיבר היחיד המסוגל התחדשות¹. זה קריטי, כמו הכבד הוא איבר חיוני, אחראי על פונקציות מטבוליות מפתח, אחסון אנרגיה, ניקוי רעלים בדם, הפרשת חלבוני פלזמה, וייצור מרה². Hepatocytes שאבדו עקב נזק רעיל או דלקתי מוחלפים בעיקר באמצעות חלוקה של הפטוציטים הנותרים¹. מודל ניסיוני קלאסי אחד לחקר התחדשות הכבד הוא כריתת כבד חלקית, שבה אונות בודדות של הכבד מוסרות, ומשאירות את האונות הנותרות שלמות³. הליך זה פותח בתחילה בחולדות, שבהן כשני שלישים ממסת הכבד מוסרים. לאחר כריתת הפטקטומיה חלקית ביונקים, התחדשות מפצה מתרחשת באונות הנותרות עד שהכבד משחזר את המסה הראשונית שלו. ראוי לציין כי כבד היונקים אינו מחליף את האונות החסרות.

דג זברה(דניו ריו)מייצג מודל מתיחה לחקר התחדשות איברים למבוגרים^4. כבד דג הזברה, בעודו שונה מבנית מהכבד היונקים, מורכב מאותם סוגי תאים ומשרת את אותה פונקציה כמו ביונקים². הוא מורכב משלוש אונות, עם שתי אונות הגב ואונה גחונית אחת המשטחות לאורך המעי. כריתת הפטקטומיה חלקית בוצעה בעבר בדגי זברה, עם תיאורים סותרים לגבי מצב ההתחדשות המדויק. בדרך כלל, שליש כריתת hepatectomy חלקית מבוצעת על ידי הסרת האונה הגחוני כולו. דיווחים ראשוניים הצביעו על כך שלאחר הסרת האונה הגחונית, הוא התחדש במלואו בתוך שבוע^5,6,7, מה שמצביע על כך שבניגוד לכבד היונקים, כבד דג הזברה מסוגל להתחדשות אפימורפית. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי הסרת האונה הגחונית הביאה להתחדשות מפצה באונות החזיר, ולא להתחדשות האונה הגחונית החסרה, ובסופו של דבר להתאוששות של מסת הכבד בתוך שבוע^8,9. פרופיל תמלול של האונות הגעשיות בעקבות כריתה של האונה הגחונית חשף שינויים משמעותיים הקשורים^{התחדשות מפצה 10}. בהתחשב בכך שמצב התחדשות הכבד יכול להשתנות עם היקף הפציעה⁸, שיערנו כי הפערים בתוצאות עשויים להיות עקב שונות טכנית בפרוטוקול כריתת ההפטיקטומיה החלקית בין קבוצות מחקר.

פרוטוקול זה מתאר הליך לביצוע כריתת הפטיקטומיה חלקית שליש על דגי זברה בוגרים על ידי הסרת האונה הגחונית. טכניקה זו תהיה בעלת ערך להערכת מנגנונים של התחדשות הכבד.

Protocol

דגי זברה גדלו וגדלו על פי הנהלים הרגילים. הניסויים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של בית החולים בריגהם ונשים (2016N000405). דגי זברה בוגרים צמו במשך 24 שעות לפני תחילת הפרוטוקול. מי מערכת מתייחסים למים במיכלי דיור דגי זברה במתקן הימי.

1. הכנה ומרדים

1. הכן 0.016% פתרון Tricaine במי מערכת.
   זהירות: טריקאין הוא מגרה אם הוא בא במגע עם העיניים, העור או דרכי הנשימה.
2. הכן ספוג להחזיק דג זברה מרדים במהלך פרוטוקול הניתוח. חותכים ספוג מלא לרבעים. באמצעות סכין גילוח, להסיר טריז דק של ספוג שפועל במקביל לציר הארוך של רובע הספוג.
   1. החריץ צריך להיות ארוך מספיק כדי להכיל דג בוגר (זה ישתנה בין גדלים שונים של דגים). לדוגמה, עבור דג מבוגר 35 מ"מ אורך, אורך החריץ צריך להיות 20 מ"מ. הראש והגוף מוחזקים בספוג, אבל הזנב עובר את קצה הספוג(איור 1B).
3. השרו את הספוג בתמיסת טריקאין 0.016%.
4. יש למקם דגי זברה בוגרים (זכר או נקבה) ב-625 מ"ל של פתרון טריקאין 0.016%.
5. דגירה במשך 6 דקות או עד שהדגים לא מגיבים למגע.
6. בעזרת מלקחיים, הסירו בזהירות את הדגים ממיכל ה-Tricaine והניחו את צד גחון הדגים למעלה בחריץ הספוג (איור 1A - B).
7. מניחים את הספוג מתחת למיקרוסקופ ניתוח עם תאורה מלמעלה למטה.

2. ניתוח

1. בעזרת מלקחיים עדינים, צבוטו את העור וקשקשו בממצע, רק אחוריים ללב(איור 1B).
2. באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות לחתוך מתחת למלקחיים כדי ליצור חור בחלל הגוף(איור 1C - D). יש להקפיד לא לפגוע בלב או בכלי דם גדול, שכן הדבר יגרום לתמותה מוגברת.
3. באמצעות מספריים קפיץ טעון, לבצע 3-4 מ"מ הפחתת לאורך הבטן, עיבוד אחורי עד ההסתעפות מגיע סנפירי האגן(איור 1D - E). בשלב זה, האונה הגחונה של הכבד עשויה להיות גלויה דרך ההסתה.
4. לסחוט את הצדדים של הספוג ביד אחת כדי לכפות את האיברים הקרביים מתוך חלל הגוף. האונה הגחונה של הכבד תהיה גלויה על גבי המעי(איורים 1F,2A-B). הכבד יופיע כמבנה ורוד או כתום הפרוס על פני המעי החום-זהוב. בעלי חיים המוגדרים כבקרה מזויפת נמצאים בשלב זה.
5. סוחטים את המלקחיים העדינות כך ששני הפחיות נוגעות ללב. תוך שמירה על לחץ על הספוג, החלק את הפחיות של המלקחיים העדינות בין הכבד למעי(איור 1G). יש להקפיד לא לנקב את המעי, שכן זה יגרום לתמותה מוגברת.
6. לאט לאט הלחץ על המלקחיים, כך שהקישוטים מתרחקים זה מזה(איור 1H). פעולת הזזה זו מנתקת את ההחזקות הרבות של וריד הפורטל בין האונה הגחונית למעי (איור 2B), ויש צורך להסיר את האונה הגחונית. חזור על תהליך זה עד שכל קשרי הפורטל בין הכבד למעי נותקו.
7. לקלף את האונה הגחונית מהמעי באמצעות מלקחיים עדינים לחתוך את האונה הגחונית חופשי משאר הכבד(איור 1I).
8. הליך זה גורם לכריתת הפטיקטומיה חלקית שליש (איור 1J).

3. התאוששות

1. בזהירות להסיר את הדג מן הספוג ומניחים אותו במיכל של מים מערכת.
2. מערכת פיפטה מים מעל הזימים במשך כמה דקות עד שהדגים שוחים בכוחות עצמם(איור 1K).
3. יש לנטר דגים במשך 2-4 שעות לפני שתחזיר אותם למערכת. אין להאכיל את הדגים במשך 24 שעות מלאות לאחר הניתוח.
4. נטר דגים מדי יום למשך הניסוי.
5. עם הזמן, ההסתה בקיר הגוף תחלים באופן טבעי ללא צורך בתפרים(איור 1L,2C).

4. ניתוח אורך האונה הגחונית למעי

1. המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.
2. מוציאים את הדג ממי קרח ומניחים אותו בצד הגחון למעלה בחריץ של ספוג.
3. באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן בצעו עוד שני חותכים לאורך הציר הקדמי-אחורי מהחתיכה הראשונה כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).
4. לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).
5. לרכוש תמונות שדה בהיר ופלואורסצנטי של איברי הקרביים באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. שדה ראייה זה יכלול את האזור שבו נפלטה האונה הגחונית. מכיוון שבעלי חיים מורדמים לפני הניתוח, ניתוח מסוג זה מונע הדמיה ארוכת טווח של אותם דגים.

5. ניתוח יחס משקל כבד לגוף

1. המתת חסד כל בעלי החיים המיועדים לניתוח במי קרח במשך 10 דקות עד שכל התנועות האופרקולריות ייפסקו.
2. מניחים דגים בצינור חרוט 50 מ"ל.
3. הוסף 25 מ"ל של 4% paraformaldehyde ב 1x PBS ו 0.3% Tween לצינור.
   זהירות: פורמלדהיד רעיל, ופתרונות המכילים פורמלדהיד תמיד צריכים להיות מעובדים במכסה כימי.
4. אגוזים ל-48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. בצע ארבע כביסות של 10 דקות ב- PBS 1x ו- 0.3% Tween.
6. יש לאחזר דגים עם מלקחיים, ולהכתים יבש על מגבת נייר.
7. תקליט את המשקל של כל הדג.
8. באמצעות מספריים קפיץ טעון, לעשות חותך בקיר הגוף הגחון בעמדה הקדמית-אחורית של הלב. לאחר מכן, לעשות עוד שני חותכים לרוץ לאורך הציר הקדמי-אחורי מן החותך הראשון כל הדרך לסנפירי האגן. (איור 2A).
9. לקלף את העור ואת השריר כדי לחשוף את איברי הקרביים (איור 2A).
10. לרכוש תמונות שדה בהיר של הכבד באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטיות.
11. לנתח את הכבד, מניח את חתיכות הכבד על סירת שקילה.
12. להקליט את המשקל של הכבד.

תוצאות

על מנת לבחון את הפוטנציאל המתחדש של כבד דג הזברה הבוגר, ביצענו כריתת הפטקטומיה חלקית (PHX) בדגי זברה בוגרים. באופן כללי, נבחרו מבוגרים גדולים (30-40 מ"מ אורך) הנעים בין 1.5-2.5 שנים. במסגרת ניסויים בודדים, בעלי חיים נבחרו מאותו טנק, והיו מותאמים לגילם ולגודלם. כבקרה מתאימה, השתמשנו בניתוחים מזויפים ש...

Discussion

ההבדלים האנטומיים בין דגי זברה למודלים של יונקים להתחדשות הכבד מציבים אתגרים ייחודיים לפירוק הכבד. הכבד בדגי זברה נמצא בסמיכות ללב והמעי; פגיעה בשוגג בכל איבר גורמת לתמותה מוגברת. כבד דג הזברה אינו עטוף, מה שמקשה על הנפרדות מהמעי. הכבד מקבל דם עשיר בחומרים מזינים מהמעי דרך ורידים פורטל. בי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500