Hepatectomía parcial en pez cebra adulto

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para eliminar el lóbulo ventral del hígado en el pez cebra adulto para permitir el estudio de la regeneración hepática.

Resumen

La insuficiencia hepática es una de las principales causas de muerte en todo el mundo, y la mortalidad por enfermedad hepática crónica está aumentando bruscamente en los Estados Unidos. Los hígados sanos son capaces de regenerarse a partir de daños tóxicos, pero en la enfermedad hepática avanzada, la capacidad natural del hígado para regenerarse se ve afectada. El pez cebra ha surgido como un poderoso sistema experimental para estudiar la regeneración. Son un modelo ideal para estudiar la regeneración hepática a partir de la hepatectomía parcial, un procedimiento con relevancia clínica directa en el que se extirpa quirúrgicamente parte del hígado, dejando el resto intacto. No existe un protocolo estándar para la hepatectomía parcial; los estudios anteriores que utilizaron este modelo han utilizado protocolos ligeramente diferentes y han reportado resultados dispares. Aquí se describe un protocolo eficiente y reproducible para realizar una hepatectomía parcial en peces cebra adultos. Utilizamos esta técnica para demostrar que los peces cebra son capaces de regeneración epimórfica del lóbulo resecado. Este protocolo se puede utilizar para interrogar más lejos los mecanismos requeridos para la regeneración del hígado en el pez cebra.

Introducción

Entre los órganos sólidos en los seres humanos, el hígado es el único órgano capaz de regeneración¹. Esto es crítico, ya que el hígado es un órgano esencial, responsable de las funciones metabólicas clave, el almacenamiento de energía, la desintoxicación de la sangre, la secreción de proteínas plasmáticas y la producción^{de bilis 2.} Los hepatocitos perdidos debido a daños tóxicos o inflamatorios se reemplazan principalmente a través de la división de los hepatocitos restantes¹. Un modelo experimental clásico para estudiar la regeneración hepática es la hepatectomía parcial, donde se extirpan los lóbulos individuales del hígado, dejando intactos los lóbulos restantes^3. Este procedimiento se desarrolló inicialmente en ratas, en las que se eliminan aproximadamente dos tercios de la masa hepática. Después de la hepatectomía parcial en mamíferos, la regeneración compensatoria se produce en los lóbulos restantes hasta que el hígado recupera su masa inicial. En particular, el hígado de los mamíferos no reemplaza los lóbulos que faltan.

El pez cebra(Danio rerio)representa un modelo manejable para el estudio de la regeneración de órganos adultos^4. El hígado del pez cebra, aunque estructuralmente diferente del hígado de los mamíferos, está formado por los mismos tipos de células y cumple la misma función que en los mamíferos². Se compone de tres lóbulos, con dos lóbulos dorsales y un solo lóbulo ventral que se aplanan a lo largo del intestino. Hepatectomy parcial se ha realizado previamente en el pez cebra, con cuentas contradictorias en cuanto al modo exacto de regeneración. Por lo general, una hepatectomía parcial de un tercio se realiza mediante la extirpación de todo el lóbulo ventral. Los informes iniciales indicaron que después de la eliminación del lóbulo ventral, se regeneró completamente dentro de una semana^5,6,7,lo que sugiere que en contraste con el hígado de mamífero, el hígado de pez cebra es capaz de regeneración epimórfica. Estudios posteriores demostraron que la eliminación del lóbulo ventral dio lugar a la regeneración compensatoria en los lóbulos dorsales, en lugar de la regeneración del lóbulo ventral faltante, y en última instancia la recuperación de la masa hepática en el plazo de una semana^8,9. El perfil transcriptómico de los lóbulos dorsales después de la resección del lóbulo ventral reveló cambios significativos asociados a la regeneración compensatoria¹⁰. Dado que el modo de regeneración hepática puede variar con la extensión de la lesión^8,especulamos que las discrepancias en los resultados pueden deberse a la variación técnica en el protocolo de hepatectomía parcial entre los grupos de investigación.

Este protocolo describe un procedimiento para realizar un tercio de hepatectomía parcial en el pez cebra adulto mediante la eliminación del lóbulo ventral. Esta técnica será valiosa para evaluar los mecanismos de regeneración hepática.

Protocolo

Los peces cebra fueron criados y criados de acuerdo con los procedimientos estándar. Los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). El pez cebra adulto fue ayunado durante 24 h antes del inicio del protocolo. El agua del sistema se refiere al agua en los tanques de alojamiento de pez cebra en la instalación acuática.

1. Preparación y anestesia

1. Preparar solución Tricaine al 0,016% en agua del sistema.
   PRECAUCIÓN: Tricaine es un irritante si entra en contacto con los ojos, la piel o las vías respiratorias.
2. Prepare una esponja para sostener el pez cebra anestesiado durante el protocolo de disección. Cortar una esponja completa en cuartos. Con una cuchilla de afeitar, retire una cuña delgada de esponja que corre paralela al eje largo del cuarto de la esponja.
   1. La rendija debe ser lo suficientemente larga como para acomodar a un pez adulto (esto variará entre los diferentes tamaños de los peces). Por ejemplo, para un pez adulto de 35 mm de longitud, la longitud de la rendija debe ser de 20 mm. La cabeza y el cuerpo se sostienen cómodamente en la esponja, pero la cola corre más allá del borde de la esponja (Figura 1B).
3. Remoje la esponja en solución Tricaine al 0.016%.
4. Colocar el pez cebra adulto (ya sea macho o hembra) en 625 mL de solución tricaína al 0,016%.
5. Incubar durante 6 minutos o hasta que el pescado no responda al tacto.
6. Usando fórceps, retire cuidadosamente el pez del tanque Tricaine y coloque el lado ventral del pez en el surco de la esponja (Figura 1A - B).
7. Coloque la esponja bajo un microscopio de disección con iluminación de arriba hacia abajo.

2. Cirugía

1. Usando fórceps finos, pellizcar la piel y las escamas medialmente, justo después del corazón (Figura 1B).
2. Usando tijeras cargadas de resorte, haga un corte debajo de las fórceps para crear un agujero en la cavidad corporal (Figura 1C - D). Tenga cuidado de no lesionar el corazón o un vaso sanguíneo importante, ya que esto resultará en un aumento de la mortalidad.
3. Usando tijeras con resorte, haga una incisión de 3-4 mm a lo largo del abdomen, procesándolo posteriormente hasta que la incisión llegue a las aletas pélvicas (Figura 1D - E). En este punto, el lóbulo ventral del hígado puede ser visible a través de la incisión.
4. Apriete los lados de la esponja con una mano para forzar los órganos viscerales a salir de la cavidad corporal. El lóbulo ventral del hígado será visible en la parte superior del intestino (Figuras 1F,2A-B). El hígado aparecerá como una estructura rosada o naranja extendida sobre el intestino de color marrón dorado. Los animales designados como controles simulados se recuperan en este punto.
5. Apriete las brocas finas para que los dos dientes se toquen. Mientras mantiene la presión sobre la esponja, deslice los dientes de las fórceps finas entre el hígado y el intestino (Figura 1G). Tenga cuidado de no perforar el intestino, ya que esto resultará en un aumento de la mortalidad.
6. Relaje lentamente la presión sobre las fórceps para que los dientes se alejen unos de otros (Figura 1H). Esta acción de deslizamiento seda los numerosos accesorios de la vena porta entre el lóbulo ventral y el intestino (Figura 2B), y es necesario para eliminar limpiamente el lóbulo ventral. Repita este proceso hasta que se hayan cortado todas las conexiones portales entre el hígado y el intestino.
7. Desprenda el lóbulo ventral del intestino usando fórceps finos y corte el lóbulo ventral libre del resto del hígado (Figura 1I).
8. Este procedimiento da como resultado una hepatectomía parcial de un tercio(Figura 1J).

3. Recuperación

1. Retire cuidadosamente el pez de la esponja y colóquelo en un tanque de agua del sistema.
2. Sistema de pipetas de agua sobre las branquias durante unos minutos hasta que el pez está nadando por su cuenta (Figura 1K).
3. Monitoree los peces durante 2-4 horas antes de colocarlos de nuevo en el sistema. No alimente a los peces durante 24 h después de la cirugía.
4. Monitoree los peces diariamente durante la duración del experimento.
5. Con el tiempo, la incisión en la pared del cuerpo se curará naturalmente sin necesidad de suturas(Figura 1L,2C).

4. Análisis del lóbulo ventral a la longitud del intestino

1. Eutanasiar a todos los animales destinados a ser analysisados en agua helada durante 10 min hasta que cesen todos los movimientos operculares.
2. Retire el pez del agua helada y colóquelo del lado ventral hacia arriba en el surco de una esponja.
3. Usando tijeras con resorte, haga una incisión en la pared del cuerpo ventral en la posición anterior-posterior del corazón. Luego haga dos incisiones más que se ejecutan a lo largo del eje anterior-posterior desde la primera incisión hasta las aletas pélvicas. (Figura 2A).
4. Despegar la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales (Figura 2A).
5. Adquiera imágenes fluorescentes y de campo brillante de los órganos viscerales usando un microscopio de epifluorescencia. Este campo de visión incluirá el área donde se resecaron el lóbulo ventral. Debido a que los animales son eutanasiados antes del análisis, este tipo de análisis impide la obtención de imágenes a largo plazo de los mismos peces.

5. Análisis de la relación hígado/peso corporal

1. Eutanasiar a todos los animales destinados a ser analysisados en agua helada durante 10 min hasta que cesen todos los movimientos operculares.
2. Coloque los peces en un tubo cónico de 50 mL.
3. Añadir 25 mL de paraformadehído al 4% en 1x PBS y 0,3% de interpolación al tubo.
   PRECAUCIÓN: El formaldehído es tóxico, y las soluciones que contienen formaldehído siempre deben procesarse en una campana química.
4. Nutate durante 48 h a 4 °C.
5. Realice cuatro lavados de 10 min en 1x PBS y 0.3% Tween.
6. Recupere el pescado con las pez con las pezón de la fuerza, y seque en una toalla de papel.
7. Registre el peso de todo el pescado.
8. Usando tijeras con resorte, haga una incisión en la pared del cuerpo ventral en la posición anterior-posterior del corazón. Luego, haga dos incisiones más que se ejecuten a lo largo del eje anterior-posterior desde la primera incisión hasta las aletas pélvicas. (Figura 2A).
9. Despegar la piel y el músculo para revelar los órganos viscerales (Figura 2A).
10. Adquiera imágenes de campo brillante del hígado usando un microscopio de epifluorescencia.
11. Diseccione el hígado, colocando los trozos de hígado en un bote de pesaje.
12. Registre el peso del hígado.

Resultados

Con el fin de examinar el potencial regenerativo del hígado de pez cebra adulto, se realizó hepatectomía parcial (PHX) en el pez cebra adulto. En general, se seleccionaron adultos grandes (30-40 mm de longitud), variando de 1,5-2,5 años. Dentro de los experimentos individuales, los animales fueron seleccionados del mismo tanque, y fueron igualados por edad y tamaño. Como control apropiado, utilizamos las cirugías falsas en las cuales anestesiaron y recibieron al animal una incisión grande en la pared ventral del c...

Discusión

Las diferencias anatómicas entre el pez cebra y los modelos de mamíferos para la regeneración hepática presentan desafíos únicos para la resección hepática. El hígado en el pez cebra está muy cerca del corazón y el intestino; inadvertidamente dañando cualquier órgano da lugar a mortalidad creciente. El hígado del pez cebra no está encapsulado, por lo que es más difícil separarse del intestino. El hígado recibe sangre rica en nutrientes del intestino a través de las venas porta. En los mamíferos, las v...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500