Hepatectomia Parcial em Zebrafish Adulto

Resumo

Este protocolo descreve o procedimento para remover o lobo ventral do fígado em zebrafish adulto para permitir o estudo da regeneração hepática.

Resumo

A insuficiência hepática é uma das principais causas de morte em todo o mundo, e a mortalidade por doença hepática crônica está aumentando acentuadamente nos Estados Unidos. Fígados saudáveis são capazes de se regenerar de danos tóxicos, mas em doença hepática avançada, a capacidade natural do fígado de se regenerar é prejudicada. Os zebrafish emergiram como um poderoso sistema experimental para estudar a regeneração. São um modelo ideal para estudar a regeneração hepática a partir da hepatectomia parcial, procedimento com relevância clínica direta em que parte do fígado é removida cirurgicamente, deixando o resto intacto. Não há protocolo padrão para hepatectomia parcial; estudos anteriores utilizando este modelo têm usado protocolos ligeiramente diferentes e relatado resultados diferentes. Descrito aqui é um protocolo eficiente e reprodutível para a realização de uma hepatectomia parcial em zebrafish adulto. Usamos esta técnica para demonstrar que os zebrafish são capazes de regeneração epimórfica do lobo ressecado. Este protocolo pode ser usado para interrogar ainda mais os mecanismos necessários para a regeneração hepática em zebrafish.

Introdução

Entre os órgãos sólidos em humanos, o fígado é o único órgão capaz de regenerar¹. Isso é crítico, pois o fígado é um órgão essencial, responsável pelas principais funções metabólicas, armazenamento de energia, desintoxicação sanguínea, secreção de proteínas plasmáticas e produção de bile². Hepatócitos perdidos devido a danos tóxicos ou inflamatórios são substituídos principalmente por divisão dos hepatócitos restantes¹. Um modelo experimental clássico para estudar a regeneração hepática é a hepatectomia parcial, onde os lobos individuais do fígado são removidos, deixando os lóbulos restantes intactos³. Este procedimento foi inicialmente desenvolvido em ratos, nos quais aproximadamente dois terços da massa hepática é removida. Após hepatectomia parcial em mamíferos, a regeneração compensatória ocorre nos lóbulos restantes até que o fígado recupere sua massa inicial. Notavelmente, o fígado mamífero não substitui os lóbulos perdidos.

O zebrafish (Danio rerio) representa um modelo tratável para estudar a regeneração de órgãos^{adultos 4}. O fígado de zebrafish, embora estruturalmente diferente do fígado mamífero, é composto pelos mesmos tipos de células e serve a mesma função dos mamíferos². É composto por três lóbulos, com dois lobos dorsais e um único lobo ventral que são achatados ao longo do intestino. A hepatectomia parcial já foi realizada anteriormente em zebrafish, com relatos conflitantes quanto ao modo preciso de regeneração. Normalmente, uma hepatectomia parcial de um terço é realizada pela remoção de todo o lobo ventral. Relatórios iniciais indicaram que, após a remoção do lobo ventral, ele foi totalmente regenerado dentro de uma semana^5,6,7, sugerindo que, em contraste com o fígado mamífero, o fígado de zebrafish é capaz de regeneração epimórfica. Estudos subsequentes demonstraram que a remoção do lobo ventral resultou em regeneração compensatória nos lobos dorsais, em vez da regeneração do lobo ventral perdido, e, finalmente, a recuperação da massa hepática dentro de uma semana^8,9. O perfil transcriômico dos lobos dorsais após a ressecção do lobo ventral revelou alterações significativas associadas à regeneração compensatória¹⁰. Dado que o modo de regeneração hepática pode variar com a extensão da lesão^8,especulamos que as discrepâncias nos resultados podem ser devido à variação técnica no protocolo de hepatectomia parcial entre grupos de pesquisa.

Este protocolo descreve um procedimento para a realização de uma hepatectomia parcial de um terço em zebrafish adulto, removendo o lobo ventral. Esta técnica será valiosa para avaliar mecanismos de regeneração hepática.

Protocolo

Os zebrafish foram criados e criados de acordo com os procedimentos padrão. Os experimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Brigham e da Mulher (2016N000405). Os zebrafish adultos foram jejuados por 24 horas antes do início do protocolo. A água do sistema refere-se à água em tanques de carcaça de zebrafish na instalação aquática.

1. Preparação e anestesia

1. Prepare 0,016% solução tricaine em água do sistema.
   ATENÇÃO: Tricaine é um irritante se entrar em contato com os olhos, pele ou trato respiratório.
2. Prepare uma esponja para segurar zebrafish anestesiado durante o protocolo de dissecção. Corte uma esponja completa em moedas. Usando uma lâmina de barbear, remova uma fina cunha de esponja que corre paralelamente ao longo eixo do quarto da esponja.
   1. A fenda deve ser longa o suficiente para acomodar um peixe adulto (isso vai variar entre diferentes tamanhos de peixe). Por exemplo, para um peixe adulto com 35 mm de comprimento, o comprimento da fenda deve ser de 20 mm. A cabeça e o corpo são snugly mantidos na esponja, mas a cauda passa pela borda da esponja(Figura 1B).
3. Mergulhe a esponja em solução tricaine 0,016%.
4. Coloque o zebrafish adulto (masculino ou feminino) em 625 mL de solução tricaine de 0,016%.
5. Incubar por 6 minutos ou até que o peixe não responda ao toque.
6. Usando fórceps, retire cuidadosamente o peixe do tanque Tricaine e coloque o lado ventral do peixe para cima na ranhura da esponja(Figura 1A - B).
7. Coloque a esponja sob um microscópio dissecando com iluminação de cima para baixo.

2. Cirurgia

1. Usando fórceps finos, belisque a pele e escamas mediadamente, apenas posterior ao coração(Figura 1B).
2. Usando uma tesoura carregada de mola, faça um corte sob as fórceps para criar um buraco na cavidade corporal (Figura 1C - D). Tome cuidado para não ferir o coração ou um vaso sanguíneo importante, pois isso resultará em aumento da mortalidade.
3. Utilizando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão de 3-4 mm ao longo do abdômen, processando posteriormente até que a incisão chegue às aletas pélvicas(Figura 1D - E). A essa altura, o lobo ventral do fígado pode ser visível através da incisão.
4. Aperte os lados da esponja com uma mão para forçar os órgãos viscerais a saírem da cavidade corporal. O lobo ventral do fígado será visível em cima do intestino (Figuras 1F,2A-B). O fígado aparecerá como uma estrutura rosa ou laranja espalhada sobre o intestino marrom-dourado. Animais designados como controles falsos são recuperados neste momento.
5. Aperte os fórceps finos para que as duas latas toquem. Mantendo a pressão sobre a esponja, deslize as latas dos fórceps finos entre o fígado e o intestino(Figura 1G). Tome cuidado para não perfurar o intestino, pois isso resultará em aumento da mortalidade.
6. Relaxe lentamente a pressão sobre os fórceps para que as latas se afastem umas das outras(Figura 1H). Esta ação deslizante rompe os numerosos anexos de veia portal entre o lobo ventral e o intestino(Figura 2B),e é necessário remover limpamente o lobo ventral. Repita este processo até que todas as conexões do portal entre o fígado e o intestino tenham sido cortadas.
7. Retire o lobo ventral do intestino usando fórceps finos e corte o lobo ventral livre do resto do fígado(Figura 1I).
8. Este procedimento resulta em uma hepatectomia parcial de um terço (Figura 1J).

3. Recuperação

1. Retire cuidadosamente o peixe da esponja e coloque-o em um tanque de água do sistema.
2. Pipeta sistema água sobre as brânquias por alguns minutos até que o peixe está nadando por conta própria(Figura 1K).
3. Monitore os peixes por 2-4 horas antes de colocá-los de volta no sistema. Não alimente o peixe por 24 horas após a cirurgia.
4. Monitore os peixes diariamente durante a duração do experimento.
5. Com o tempo, a incisão na parede do corpo cicatrizará naturalmente sem a necessidade de suturas (Figura 1L,2C).

4. Lóbulo ventral para análise do comprimento do intestino

1. Eutanize todos os animais destinados à análise em água gelada por 10 minutos até que todos os movimentos operculares cessem.
2. Retire o peixe da água gelada e coloque-o do lado ventral para cima na ranhura de uma esponja.
3. Usando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão na parede do corpo ventral na posição anterior-posterior do coração. Em seguida, faça mais duas incisões que correm ao longo do eixo anterior-posterior desde a primeira incisão até as barbatanas pélvicas. (Figura 2A).
4. Retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais (Figura 2A).
5. Adquira imagens de campo brilhante e fluorescentes dos órgãos viscerais usando um microscópio de epifluorescência. Este campo de visão incluirá a área onde o lobo ventral foi ressecado. Como os animais são eutanizados antes da análise, esse tipo de análise impede a imagem a longo prazo do mesmo peixe.

5. Análise da razão de peso do fígado para o corpo

1. Eutanize todos os animais destinados à análise em água gelada por 10 minutos até que todos os movimentos operculares cessem.
2. Coloque os peixes em um tubo cônico de 50 mL.
3. Adicione 25 mL de paraformaldeído em 1x PBS e 0,3% Tween ao tubo.
   ATENÇÃO: O formaldeído é tóxico, e as soluções que contenham formaldeído devem ser sempre processadas em uma capa química.
4. Nutate por 48 h a 4 °C.
5. Realizar quatro lavagens de 10 min em 1x PBS e 0,3% Tween.
6. Recupere peixes com fórceps, e seque em uma toalha de papel.
7. Grave o peso de todo o peixe.
8. Usando uma tesoura carregada de mola, faça uma incisão na parede do corpo ventral na posição anterior-posterior do coração. Em seguida, faça mais duas incisões que correm ao longo do eixo anterior-posterior desde a primeira incisão até as aletas pélvicas. (Figura 2A).
9. Retire a pele e o músculo para revelar os órgãos viscerais (Figura 2A).
10. Adquira imagens de campo brilhante do fígado usando um microscópio de epifluorescência.
11. Disseque o fígado, colocando os pedaços de fígado em um barco de pesagem.
12. Grave o peso do fígado.

Resultados

Para examinar o potencial regenerativo do fígado de zebrafish adulto, realizamos hepatectomia parcial (PHX) em zebrafish adulto. Em geral, foram selecionados adultos grandes (30-40 mm de comprimento), variando de 1,5 a 2,5 anos. Dentro de experimentos individuais, os animais foram selecionados do mesmo tanque, e tinham idade e tamanho compatível. Como controle adequado, utilizamos cirurgias falsas nas quais o animal foi anestesiado e recebeu uma grande incisão na parede do corpo ventral, mas foi recuperado sem remover...

Discussão

As diferenças anatômicas entre zebrafish e modelos mamíferos para regeneração hepática apresentam desafios únicos à ressecção hepática. O fígado em zebrafish está próximo do coração e do intestino; inadvertidamente danificar qualquer órgão resulta em aumento da mortalidade. O fígado de zebrafish não é encapsulado, tornando mais difícil separar-se do intestino. O fígado recebe sangue rico em nutrientes do intestino através de veias portal. Nos mamíferos, veias que saem do intestino convergem em um...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500