Hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte

Résumé

Ce protocole décrit la procédure pour enlever le lobe ventral du foie dans le poisson zèbre adulte pour permettre l’étude de la régénération de foie.

Résumé

L’insuffisance hépatique est l’une des principales causes de décès dans le monde, et la mortalité due aux maladies chroniques du foie augmente fortement aux États-Unis. Les foies sains sont capables de se régénérer des dommages toxiques, mais dans les maladies hépatiques avancées, la capacité naturelle du foie à se régénérer est altérée. Le poisson zèbre est devenu un puissant système expérimental pour l’étude de la régénération. Ils sont un modèle idéal pour étudier la régénération du foie à partir d’une hépatectomie partielle, une procédure ayant une pertinence clinique directe dans laquelle une partie du foie est enlevée chirurgicalement, laissant le reste intact. Il n’y a aucun protocole standard pour l’hépatectomie partielle; des études antérieures utilisant ce modèle ont utilisé des protocoles légèrement différents et ont rapporté des résultats disparates. Décrit ici est un protocole efficace et reproductible pour effectuer une hépatectomie partielle chez le poisson zèbre adulte. Nous utilisons cette technique pour démontrer que les poissons zèbres sont capables de régénération épimorphe du lobe réséqué. Ce protocole peut être utilisé pour interroger davantage les mécanismes nécessaires à la régénération du foie chez le poisson zèbre.

Introduction

Parmi les organes solides chez l’homme, le foie est le seul organe capable de régénération¹. Ceci est essentiel, car le foie est un organe essentiel, responsable des fonctions métaboliques clés, du stockage de l’énergie, de la désintoxication du sang, de la sécrétion de protéines plasmatiques et de la production de bile². Les hépatocytes perdus en raison de dommages toxiques ou inflammatoires sont remplacés principalement par division des hépatocytes restants¹. Un modèle expérimental classique pour l’étude de la régénération du foie est l’hépatectomie partielle, où les lobes individuels du foie sont enlevés, laissant les lobes restants intacts³. Cette procédure a été initialement développée chez le rat, dans laquelle environ deux tiers de la masse hépatique est enlevée. Après hépatectomie partielle chez les mammifères, une régénération compensatoire se produit dans les lobes restants jusqu’à ce que le foie récupère sa masse initiale. Notamment, le foie des mammifères ne remplace pas les lobes manquants.

Le poisson zèbre (Danio rerio) représente un modèle traitable pour l’étude de la régénération des organes adultes⁴. Le foie de poisson zèbre, bien que structurellement différent du foie de mammifères, est composé des mêmes types de cellules et remplit la même fonction que chez les mammifères². Il est composé de trois lobes, avec deux lobes dorsaux et un seul lobe ventral qui sont aplatir le long de l’intestin. L’hépatectomie partielle a été précédemment réalisée chez le poisson zèbre, avec des récits contradictoires quant au mode précis de régénération. Typiquement, une hépatectomie partielle d’un tiers est réalisée par ablation de l’ensemble du lobe ventral. Les rapports initiaux ont indiqué qu’après l’élimination du lobe ventral, il a été complètement régénéré en une semaine^5,6,7,ce qui suggère que contrairement au foie de mammifère, le foie de poisson zèbre est capable de régénération épimorphique. Des études ultérieures ont démontré que l’ablation du lobe ventral entraînait une régénération compensatoire dans les lobes dorsaux, plutôt que la régénération du lobe ventral manquant, et finalement la récupération de la masse hépatique dans un délai de^8,9. Le profilage transcriptomique des lobes dorsaux après la résection du lobe ventral a indiqué les changements significatifs liés à la régénération compensatoire^10. Étant donné que le mode de régénération du foie peut varier avec l’étendue de la blessure⁸, nous avons spéculé que les écarts dans les résultats peuvent être dus à la variation technique dans le protocole partiel d’hépatectomie entre les groupes de recherche.

Ce protocole décrit un procédé pour exécuter un hepatectomy partiel d’un tiers sur le poisson zèbre adulte en enlevant le lobe ventral. Cette technique sera utile pour évaluer les mécanismes de régénération du foie.

Protocole

Les poissons zèbres ont été élevés et élevés selon les procédures standard. Les expériences ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Brigham and Women’s Hospital (2016N000405). Les poissons zèbres adultes ont été jeûnés pendant 24 h avant le début du protocole. L’eau du système fait référence à l’eau dans les réservoirs abritant des poissons zèbres dans l’installation aquatique.

1. Préparation et anesthésie

1. Préparer une solution de tricaine à 0,016% dans l’eau du système.
   ATTENTION: La tricaine est un irritant si elle entre en contact avec les yeux, la peau ou les voies respiratoires.
2. Préparez une éponge pour contenir le poisson zèbre anesthésié pendant le protocole de dissection. Couper une éponge complète en quartiers. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez un mince coin d’éponge qui est parallèle au long axe du quart de l’éponge.
   1. La fente doit être assez longue pour accueillir un poisson adulte (cela variera selon les tailles de poisson). Par exemple, pour un poisson adulte de 35 mm de longueur, la longueur de la fente doit être de 20 mm. La tête et le corps sont bien maintenus dans l’éponge, mais la queue passe devant le bord de l’éponge(figure 1B).
3. Faire tremper l’éponge dans une solution de tricaine à 0,016%.
4. Placer le poisson zèbre adulte (mâle ou femelle) dans 625 mL de solution de tricaine à 0,016 %.
5. Incuber pendant 6 min ou jusqu’à ce que le poisson ne réponde pas au toucher.
6. À l’aide d’une pince, retirez soigneusement le poisson du réservoir de Tricaine et placez la face ventrale du poisson dans la rainure de l’éponge(Figure 1A - B).
7. Placez l’éponge sous un microscope de dissection avec éclairage descendant.

2. Chirurgie

1. À l’aide d’une pince fine, pincer la peau et les écailles par voie médiale, juste en arrière du cœur (Figure 1B).
2. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une coupe sous la pince pour créer un trou dans la cavité du corps(Figure 1C - D). Prenez soin de ne pas blesser le cœur ou un vaisseau sanguin majeur, car cela entraînerait une mortalité accrue.
3. À l’aide de ciseaux à ressort, faire une incision de 3-4 mm le long de l’abdomen, traitement postérieur jusqu’à ce que l’incision arrive aux nageoires pelviennes (Figure 1D - E). À ce stade, le lobe ventral du foie peut être visible à travers l’incision.
4. Pressez les côtés de l’éponge d’une main pour forcer les organes viscéraux à sortir de la cavité corporelle. Le lobe ventral du foie sera visible sur le dessus de l’intestin (Figures 1F,2A-B). Le foie apparaîtra sous la forme d’une structure rose ou orange étalée sur l’intestin brun doré. Les animaux désignés comme témoins fictifs sont récupérés à ce stade.
5. Pressez la pince fine pour que les deux dents se touchent. Tout en maintenant la pression sur l’éponge, faites glisser les dents de la pince fine entre le foie et l’intestin (Figure 1G). Prenez soin de ne pas percer l’intestin, car cela entraînera une augmentation de la mortalité.
6. Relâchez lentement la pression sur la pince afin que les dents s’éloignent les unes des autres(Figure 1H). Cette action glissante coupe les nombreuses attaches de veines portiques entre le lobe ventral et l’intestin(figure 2B),et est nécessaire pour enlever proprement le lobe ventral. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les connexions portales entre le foie et l’intestin aient été sectionné.
7. Décoller le lobe ventral de l’intestin à l’aide d’une pince fine et couper le lobe ventral libre du reste du foie (Figure 1I).
8. Cette procédure entraîne une hépatectomie partielle d’un tiers (figure 1J).

3. Rétablissement

1. Retirez soigneusement le poisson de l’éponge et placez-le dans un réservoir d’eau du système.
2. Le système de pipettes arrose les branchies pendant quelques minutes jusqu’à ce que le poisson nage seul(figure 1K).
3. Surveillez les poissons pendant 2 à 4 heures avant de les replacer dans le système. Ne nourrissez pas le poisson pendant 24 h après la chirurgie.
4. Surveiller les poissons quotidiennement pendant toute la durée de l’expérience.
5. Avec le temps, l’incision dans la paroi du corps guérira naturellement sans avoir besoin de sutures(Figure 1L,2C).

4. Analyse de la longueur du lobe ventral à l’intestin

1. Euthanasier tous les animaux destinés à l’analyse dans l’eau glacée pendant 10 min jusqu’à ce que tous les mouvements operculaires cessent.
2. Retirez le poisson de l’eau glacée et placez-le côté ventral dans la rainure d’une éponge.
3. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision dans la paroi ventrale du corps à la position antérieure-postérieure du cœur. Ensuite, faites deux autres incisions qui longent l’axe antérieur-postérieur de la première incision jusqu’aux nageoires pelviennes. (Figure 2A).
4. Décollez la peau et les muscles pour révéler les organes viscéraux (Figure 2A).
5. Acquérir des images fluorescentes et en champ lumineux des organes viscéraux à l’aide d’un microscope à épifluorescence. Ce champ de vision comprendra la zone où le lobe ventral a été réséqué. Étant donné que les animaux sont euthanasiés avant l’analyse, ce type d’analyse empêche l’imagerie à long terme du même poisson.

5. Analyse du rapport poids du foie au corps

1. Euthanasier tous les animaux destinés à l’analyse dans l’eau glacée pendant 10 min jusqu’à ce que tous les mouvements operculaires cessent.
2. Placer le poisson dans un tube conique de 50 mL.
3. Ajouter 25 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans 1x PBS et 0,3 % tween dans le tube.
   ATTENTION : Le formaldéhyde est toxique et les solutions contenant du formaldéhyde doivent toujours être traitées dans une hotte chimique.
4. Nutate pendant 48 h à 4 °C.
5. Effectuez quatre lavages de 10 minutes en 1x PBS et 0,3% Tween.
6. Récupérez le poisson avec une pince et séchez-le sur une serviette en papier.
7. Notez le poids du poisson entier.
8. À l’aide de ciseaux à ressort, faites une incision dans la paroi ventrale du corps à la position antérieure-postérieure du cœur. Ensuite, faites deux autres incisions qui longent l’axe antérieur-postérieur de la première incision jusqu’aux nageoires pelviennes. (Figure 2A).
9. Décollez la peau et les muscles pour révéler les organes viscéraux (Figure 2A).
10. Acquérir des images en champ lumineux du foie à l’aide d’un microscope à épifluorescence.
11. Disséquer le foie, en plaçant les morceaux de foie sur un bateau de pesée.
12. Notez le poids du foie.

Résultats

Afin d’examiner le potentiel régénérateur du foie adulte de poisson zèbre, nous avons exécuté hepatectomy partiel (PHX) dans le poisson zèbre adulte. En général, de grands adultes (30-40 mm de longueur) ont été sélectionnés, allant de 1,5 à 2,5 ans. Dans le cadre d’expériences individuelles, les animaux ont été sélectionnés dans le même réservoir et ont été appariés selon l’âge et la taille. Comme contrôle approprié, nous avons utilisé des chirurgies simulées dans lesquelles l’animal ...

Discussion

Les différences anatomiques entre les modèles de régénération hépatique chez le poisson zèbre et les mammifères présentent des défis uniques pour la résection hépatique. Le foie chez le poisson zèbre est à proximité du cœur et de l’intestin; Endommageant par inadvertance l’un ou l’autre organe a comme conséquence la mortalité accrue. Le foie de poisson zèbre n’est pas encapsulé, ce qui le rend plus difficile à séparer de l’intestin. Le foie reçoit du sang riche en nutriments de l’intest...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500