Частичная гепатэктомия у взрослых рыбок данио

Резюме

Этот протокол описывает процедуру удаления вентральной доли печени у взрослых рыбок данио, чтобы обеспечить возможность изучения регенерации печени.

Аннотация

Печеночная недостаточность является одной из ведущих причин смерти во всем мире, а смертность от хронических заболеваний печени резко возрастает в Соединенных Штатах. Здоровая печень способна регенерировать от токсического повреждения, но при запущенном заболевании печени естественная способность печени к регенерации нарушается. Рыбки данио стали мощной экспериментальной системой для изучения регенерации. Они являются идеальной моделью для изучения регенерации печени после частичной гепатэктомии, процедуры, имеющей прямое клиническое значение, при которой часть печени удаляется хирургическим путем, оставляя остальную часть нетронутой. Не существует стандартного протокола для частичной гепатэктомии; Предыдущие исследования с использованием этой модели использовали несколько разные протоколы и сообщали о несопоставимых результатах. Здесь описан эффективный, воспроизводимый протокол для выполнения частичной гепатэктомии у взрослых рыбок данио. Мы используем эту технику, чтобы продемонстрировать, что рыбки данио способны к эпиморфной регенерации резекционированной доли. Этот протокол может быть использован для дальнейшего опроса механизмов, необходимых для регенерации печени у рыбок данио.

Введение

Среди твердых органов у человека печень является единственным органом, способным к регенерации^1. Это имеет решающее значение, так как печень является важным органом, ответственным за ключевые метаболические функции, хранение энергии, детоксикацию крови, секрецию белков плазмы и выработку желчи^2. Гепатоциты, потерянные из-за токсического или воспалительного повреждения, заменяются в основном путем деления оставшихся гепатоцитов^1. Одной из классических экспериментальных моделей для изучения регенерации печени является частичная гепатэктомия, при которой удаляются отдельные доли печени, оставляя оставшиеся доли нетронутыми^3. Эта процедура была первоначально разработана на крысах, у которых удаляется примерно две трети печеночной массы. После частичной гепатэктомии у млекопитающих компенсаторная регенерация происходит в оставшихся долях до тех пор, пока печень не восстановит свою первоначальную массу. Примечательно, что печень млекопитающих не заменяет отсутствующие доли.

Рыбки данио (Danio rerio) представляют собой пригодную модель для изучения регенерации органов взрослых^{особей 4.} Печень рыбок данио, хотя и структурно отличается от печени млекопитающих, состоит из тех же типов клеток и выполняет ту же функцию, что и у млекопитающих^2. Он состоит из трех долей, с двумя дорсальными долями и одной вентральной долей, которые уплощены вдоль кишечника. Частичная гепатэктомия ранее проводилась у рыбок данио, с противоречивыми отчетами о точном способе регенерации. Как правило, одна треть частичной гепатэктомии выполняется путем удаления всей вентральной доли. Первоначальные сообщения указывали, что после удаления вентральной доли она была полностью регенерирована в течение^{недели 5,6,7,}предполагая, что в отличие от печени млекопитающих, печень рыбок данио способна к эпиморфной регенерации. Последующие исследования показали, что удаление вентральной доли приводило к компенсаторной регенерации в дорсальных долях, а не к регенерации отсутствующей вентральной доли, и в конечном итоге к восстановлению печеночной массы в течение^8,9недель. Транскриптомное профилирование дорсальных долей после резекции вентральной доли выявило значительные изменения, связанные с компенсаторной регенерацией^10. Учитывая, что режим регенерации печени может варьироваться в зависимости от степени повреждения^8,мы предположили, что расхождения в результатах могут быть связаны с техническими вариациями в протоколе частичной гепатэктомии между исследовательскими группами.

Этот протокол описывает процедуру выполнения одной трети частичной гепатэктомии на взрослых рыбках данио путем удаления вентральной доли. Эта методика будет ценна для оценки механизмов регенерации печени.

протокол

Рыбок данио выращивали и разводили в соответствии со стандартными процедурами. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Бригама и женской больницы (2016N000405). Взрослых рыбок данио голодали за 24 часа до начала протокола. Системная вода относится к воде в аквариумах для рыбок данио в водном объекте.

1. Подготовка и обезболивание

1. Готовят 0,016% раствор трикаина в системной воде.
   ВНИМАНИЕ: Трикаин является раздражителем, если он контактирует с глазами, кожей или дыхательными путями.
2. Приготовьте губку для хранения анестезированных рыбок данио во время протокола рассечения. Разрежьте полную губку на четвертины. Используя лезвие бритвы, удалите тонкий клин губки, который проходит параллельно длинной оси губчатой четверти.
   1. Щель должна быть достаточно длинной, чтобы вместить взрослую рыбу (это будет варьироваться между разными размерами рыбы). Например, для взрослой рыбы длиной 35 мм длина щели должна составлять 20 мм. Голова и тело плотно удерживаются в губке, но хвост проходит мимо края губки(рисунок 1В).
3. Замочите губку в 0,016% растворе трикаина.
4. Поместите взрослых рыбок данио (самцов или самок) в 625 мл 0,016% раствора трикаина.
5. Инкубировать в течение 6 минут или до тех пор, пока рыба не перестанет реагировать на прикосновения.
6. Используя щипцы, осторожно извлеките рыбу из аквариума Трикаин и поместите рыбу вентральной стороной вверх в канавку губки(Рисунок 1А - В).
7. Поместите губку под рассекающий микроскоп с подсветкой сверху вниз.

2. Хирургия

1. Используя тонкие щипцы, защемляйте кожу и чешуйки медиально, только с задней стороны сердца(рисунок 1B).
2. Используя подпружиненные ножницы, сделайте разрез под щипцами для создания отверстия в полости тела(рисунок 1С - D). Позаботьтесь о том, чтобы не повредить сердце или крупный кровеносный сосуд, так как это приведет к увеличению смертности.
3. Используя подпружиненные ножницы, сделайте разрез 3-4 мм вдоль брюшка, обрабатывая с задней стороны до тех пор, пока разрез не поступит на брюшные плавники(рисунок 1D - E). К этому моменту вентральная доля печени может быть видна через разрез.
4. Сожмите стороны губки одной рукой, чтобы вытеснить висцеральные органы из полости тела. Вентральная доля печени будет видна поверх кишечника(рис. 1F,2A-B). Печень будет выглядеть как розовая или оранжевая структура, разбросанная по золотисто-коричневой кишке. Животные, обозначенные как фиктивные контрольные, восстанавливаются на этом этапе.
5. Сожмите мелкие щипцы так, чтобы два зубья соприкасались. Сохраняя давление на губку, скользите зубьями тонких щипцов между печенью и кишечником(рисунок 1G). Позаботьтесь о том, чтобы не проколоть кишечник, так как это приведет к повышенной смертности.
6. Медленно расслабьте давление на щипцы так, чтобы зубья отдаляли друг от друга(рисунок 1H). Это скользящее действие разрывает многочисленные прикрепления воротной вени между вентральной мочкой и кишечником(рисунок 2B)и необходимо для чистого удаления вентральной доли. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока все портальные связи между печенью и кишечником не будут разорваны.
7. Отшелушить вентральную мочку от кишечника с помощью тонких щипцов и отрезать вентральную мочку свободно от остальной части печени(рисунок 1I).
8. Эта процедура приводит к одной трети частичной гепатэктомии(рисунок 1J).

3. Восстановление

1. Осторожно выньте рыбу из губки и поместите ее в резервуар с системной водой.
2. Пипетная система поливает жабры в течение нескольких минут, пока рыба не заплывет самостоятельно(рисунок 1K).
3. Контролируйте рыбу в течение 2-4 часов, прежде чем поместить ее обратно в систему. Не кормите рыбу в течение полных 24 ч после операции.
4. Ежедневно контролируйте рыбу в течение всего эксперимента.
5. Со временем разрез в стенке тела заживет естественным путем без необходимости наложения швов(рисунок 1L,2C).

4. Анализ доли вентральной доли к кишечнику

1. Усыпить всех животных, предназначенных для анализа, в ледяной воде в течение 10 минут до тех пор, пока не прекратятся все оперкулярные движения.
2. Извлеките рыбу из ледяной воды и поместите ее брюшной стороной вверх в паз губки.
3. С помощью подпружиненные ножницы сделайте разрез в стенке вентрального тела в передне-заднем положении сердца. Затем сделайте еще два разреза, которые проходят вдоль передне-задней оси от первого разреза до брюшных плавников. (Рисунок 2А).
4. Отшелушивайте кожу и мышцы, чтобы выявить висцеральные органы(рисунок 2А).
5. Получение ярко-полевых и флуоресцентных изображений висцеральных органов с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Это поле зрения будет включать область, где была резектирована вентральная доля. Поскольку животные подвергаются эвтаназии перед анализом, этот вид анализа исключает долгосрочную визуализацию одной и той же рыбы.

5. Анализ соотношения печени к массе тела

1. Усыпить всех животных, предназначенных для анализа, в ледяной воде в течение 10 минут до тех пор, пока не прекратятся все оперкулярные движения.
2. Поместите рыбу в коническую трубку 50 мл.
3. Добавьте 25 мл 4% параформальдегида в 1x PBS и 0,3% Tween в пробирку.
   ВНИМАНИЕ: Формальдегид токсичен, и растворы, содержащие формальдегид, всегда должны обрабатываться в химической вытяжке.
4. Нутят в течение 48 ч при 4 °C.
5. Выполните четыре 10-минутные стирки в 1x PBS и 0,3% анимации.
6. Достать рыбу щипцами и смахнуть насухо на бумажном полотенце.
7. Запишите вес всей рыбы.
8. С помощью подпружиненные ножницы сделайте разрез в стенке вентрального тела в передне-заднем положении сердца. Затем сделайте еще два разреза, которые проходят вдоль передне-задней оси от первого разреза до тазовых плавников. (Рисунок 2А).
9. Отшелушивайте кожу и мышцы, чтобы выявить висцеральные органы(рисунок 2А).
10. Получайте изображения печени с ярким полем с помощью эпифлуоресцентного микроскопа.
11. Рассеките печень, поместив кусочки печени на весовую лодку.
12. Запишите вес печени.

Результаты

Чтобы изучить регенеративный потенциал печени взрослой рыбки данио, мы провели частичную гепатэктомию (PHX) у взрослых рыбок данио. В основном отбирались крупные взрослые особи (30-40 мм в длину), начиная от 1,5-2,5 лет. В ходе отдельных экспериментов животные были отобраны из одного аквариума ...

Обсуждение

Анатомические различия между моделями регенеративной печени рыбок данио и млекопитающих представляют собой уникальные проблемы для резекции печени. Печень у рыбок данио находится в непосредственной близости от сердца и кишечника; непреднамеренное повреждение любого органа приводи?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500