成人斑马鱼的部分肝切除术

摘要

本协议描述了在成年斑马鱼中去除肝脏腹叶以促进肝脏再生研究的程序。

摘要

肝衰竭是全世界主要死因之一，美国慢性肝病死亡率急剧上升。健康的肝脏能够从有毒损伤中再生，但在晚期肝病中，肝脏的自然再生能力受到损害。斑马鱼已成为研究再生的强大实验系统。它们是研究部分肝切除术肝脏再生的理想模型，该手术具有直接的临床相关性，其中部分肝脏被手术切除，其余部分完好无损。没有部分肝切除术的标准方案;以前使用此模型的研究使用略有不同的协议，并报告了不同的结果。这里描述的是一个高效，可重复的协议，在成年斑马鱼进行部分肝切除术。我们使用这项技术来证明斑马鱼能够对被切除的叶进行表观再生。此协议可用于进一步询问斑马鱼肝脏再生所需的机制。

引言

在人类的实体器官中，肝脏是唯一能够再生^的器官。这一点至关重要，因为肝脏是一个必不可少的器官，负责关键的代谢功能，能量储存，血液排毒，血浆蛋白的分泌，和胆汁生产^2。因毒性或炎症性损伤而损失的肝细胞主要通过分割剩余的肝细胞¹来取代。研究肝脏再生的一个经典实验模型是部分肝切除术，其中肝脏的个别叶被切除，留下剩余叶完好无损^的3。这个过程最初是在大鼠体内开发的，其中大约三分之二的肝脏质量被切除。在哺乳动物进行部分肝切除术后，在剩余叶中发生补偿性再生，直到肝脏恢复其初始质量。值得注意的是，哺乳动物肝脏不能取代缺失的叶。

斑马鱼（达尼奥雷里奥）代表一个可驾可兰其法的模型，研究成人器官再生^4。斑马鱼肝脏虽然在结构上不同于哺乳动物肝脏，但由相同的细胞类型组成，其功能与哺乳动物^相同。它由三个叶组成，两个圆叶和一个沿着肠道扁平的单个腹叶。部分肝切除术以前在斑马鱼中进行过，关于精确再生模式的说法相互矛盾。通常，三分之一的部分肝切除术通过切除整个腹腔叶来执行。初步报告显示，在切除腹腔叶后，它在一周内完全再生^5，6，7，这表明与哺乳动物肝脏相比，斑马鱼肝具有表观再生的能力。随后的研究表明，切除腹腔叶可导致主叶的补偿性再生，而不是缺失的腹叶的再生，并最终在^8、9周内恢复肝脏质量。剖腹腔叶后对主叶的转录剖析显示与补偿性再生¹⁰相关的显著变化。鉴于肝脏再生模式可能随^损伤程度而变化，我们推测结果的差异可能是由于研究组之间部分肝切除方案的技术差异。

本协议描述了通过切除腹腔叶对成年斑马鱼进行三分之一部分肝切除手术的程序。这项技术对于评估肝脏再生机制将很有价值。

研究方案

斑马鱼是按照标准程序饲养和繁殖的。实验获得布里格姆和妇女医院机构动物护理和使用委员会（2016N000405）的批准。成年斑马鱼在协议开始前被禁食24小时。系统水是指水生设施中斑马鱼壳箱中的水。

1. 准备和麻醉

1. 在系统水中准备 0.016% 三卡因溶液。
   警告:如果三卡因与眼睛、皮肤或呼吸道接触，则是刺激物。
2. 准备一块海绵，在解剖过程中举行麻醉斑马鱼。把一块满满的海绵切成四分之一。使用剃须刀刀片，去除与海绵区长轴平行的薄海绵楔子。
   1. 缝隙应该足够长，以适应成年鱼（这将不同大小的鱼）。例如，对于长度为 35 mm 的成年鱼，缝隙的长度应为 20 mm。头部和身体紧贴在海绵中，但尾巴穿过海绵的边缘（图1B）。
3. 将海绵浸泡在 0.016% 三卡因溶液中。
4. 将成年斑马鱼（雄性或雌性）放在 625 mL 的 0.016% 三卡因溶液中。
5. 孵育6分钟或直到鱼没有反应触摸。
6. 使用钳子，小心地将鱼从Tricaine水箱中取出，并将鱼腹侧放在海绵的凹槽中（图1A-B）。
7. 将海绵置于自上而下照明的解剖显微镜下。

2. 手术

1. 使用细钳，捏皮肤和鳞片内，只是后心（图1B）。
2. 使用弹簧加载的剪刀，在钳子下切割，在机身腔内创建一个孔（图1C - D）。小心不要伤害心脏或主要血管，因为这将导致死亡率增加。
3. 使用弹簧式剪刀，沿着腹部切口3-4毫米，在切口到达骨盆鳍（图1D-E）之前进行后部处理。此时，肝脏的腹叶可以通过切口可见。
4. 用一只手挤压海绵的两侧，迫使内脏器官从体腔中取出。肝脏的腹叶在肠道顶部可见（图1F，2A-B）。肝脏将呈现为粉红色或橙色结构，分布在金棕色的肠道上。指定为虚假控制装置的动物此时已恢复。
5. 挤压细钳，使两个锡接触。在保持海绵压力的同时，将细钳的锡滑入肝脏和肠道之间（图1G）。小心不要刺穿肠道，因为这会导致死亡率增加。
6. 慢慢放松钳子上的压力，使钳子彼此移开（图1H）。这种滑动动作分离了心室叶和肠道之间的众多入口静脉附件（图2B），并且是清洁切除腹腔叶所必需的。重复此过程，直到肝脏和肠道之间的所有入口连接被切断。
7. 用细钳将腹叶从肠道中剥下来，将腹叶从肝脏的其他部位切开（图1I）。
8. 此程序导致三分之一的部分肝切除术（图1J）。

3. 恢复

1. 小心地将鱼从海绵中取出，放入系统水箱中。
2. 派佩特系统水在刺上几分钟，直到鱼自己游泳（图1K）。
3. 监测鱼2-4小时，然后再将其放回系统。手术后整整24小时不要喂鱼。
4. 在实验期间每天监测鱼。
5. 随着时间的推移，身体壁的切口将自然愈合，而无需缝合（图1L，2C）。

4. 肠叶到肠长度分析

1. 安乐死所有动物在冰水中分析10分钟，直到所有手术停止。
2. 将鱼从冰水中取出，放在海绵槽的腹侧。
3. 使用弹簧式剪刀，在心脏前后部位置的腹壁上切口。然后再做两个切口，沿着前后轴运行，从第一个切口一直到骨盆鳍。（图2A）。
4. 剥去皮肤和肌肉，露出内脏器官（图2A）。
5. 使用表观显微镜获取内脏器官的亮场和荧光图像。此视图范围将包括切除腹叶的区域。由于动物在分析前被安乐死，这种分析排除了对同一条鱼的长期成像。

5. 肝脏与体重比分析

1. 安乐死所有动物在冰水中分析10分钟，直到所有手术停止。
2. 将鱼放到 50 mL 圆锥管中。
3. 在 1x PBS 中加入 25 mL 的 4% 副甲醛，在管中加入 0.3% 的 Tween。
   警告:甲醛是有毒的，含有甲醛的溶液应始终在化学罩中处理。
4. 在 4 °C 下营养 48 小时。
5. 在 1x PBS 和 0.3% Tween 中执行 4 次 10 分钟洗涤。
6. 用钳子取回鱼，在纸巾上擦干污渍。
7. 记录整条鱼的重量。
8. 使用弹簧式剪刀，在心脏前后部位置的腹壁上切口。然后，再做两个切口，沿着前后轴运行，从第一个切口一直运行到骨盆鳍。（图2A）。
9. 剥去皮肤和肌肉，露出内脏器官（图2A）。
10. 使用表观显微镜获取肝脏的亮场图像。
11. 解剖肝脏，将肝脏碎片放在称重船上。
12. 记录肝脏的重量。

结果

为了检查成年斑马鱼肝脏的再生潜力，我们在成年斑马鱼中进行了部分肝切除术（PHX）。一般来说，选择大成人（长度为30-40毫米），年龄从1.5-2.5岁不等。在单个实验中，动物是从同一个水箱中挑选出来的，年龄和大小都与动物相吻合。作为适当的控制，我们利用假手术，其中动物既麻醉，并接受了一个大切口在腹腔体壁，但恢复没有删除任何组织。假对照鱼的存活率从90%-100%不等，雄性斑马鱼?...

讨论

斑马鱼和哺乳动物肝脏再生模型之间的解剖学差异对肝脏切除提出了独特的挑战。斑马鱼的肝脏靠近心脏和肠道:无意中损坏任一器官会导致死亡率增加。斑马鱼肝脏没有封装，因此很难与肠道分离。肝脏通过入口静脉从肠道接收富含营养的血液。在哺乳动物中，离开肠道的静脉聚集在原位入口静脉上，然后在进入肝脏¹²时分裂。相比之下，斑马鱼肝脏从一系列从肠道直接进入肝?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500