成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

要約

このプロトコルは、肝臓再生の研究を可能にするために、成体ゼブラフィッシュの肝臓の腹側葉を除去するための手順を説明します。

要約

肝不全は世界的に主要な死因の一つであり、慢性肝疾患による死亡率は米国で急激に増加している。健康な肝臓は、毒性の損傷から再生することができるが、先進の肝疾患では、再生する肝臓の自然な能力が損なわれる。ゼブラフィッシュは、再生を研究するための強力な実験システムとして登場しました。それらは部分的な肝切除術からの肝臓再生を研究するための理想的なモデルであり、肝臓の一部が外科的に除去され、残りはそのまま残る直接的な臨床的関連性を有する処置である。部分肝切除術のための標準的なプロトコルはありません。このモデルを使用した以前の研究では、わずかに異なるプロトコルを使用し、異なる結果を報告しました。ここで説明する、成体ゼブラフィッシュの部分肝切除術を行うための効率的で再現可能なプロトコルである。この技術を用い、ゼブラフィッシュが切除された葉のエピモルフィック再生が可能であることを実証する。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの肝臓再生に必要なメカニズムをさらに調べるのに使用できます。

概要

ヒトの固体器官の中で、肝臓は再生可能な唯一の器官^である1.これは肝が必須臓器であるため、重要な代謝機能、エネルギー貯蔵、血液解毒、血漿タンパク質の分泌、胆汁産生を担う^重要な2である。毒性または炎症性の損傷のために失われた肝細胞は、主に残りの肝細胞の分裂によって置換される^1.肝臓再生を研究するための古典的な実験モデルの1つは、肝臓の個々の葉が除去され、残りの葉がそのまま残っている部分肝切除術^である3.この手順は、最初にラットで開発されました, 肝臓の質量の約3分の2が除去されます.哺乳類の部分的な肝切除術の後、肝臓が最初の質量を回復するまで残りの葉に代償性再生が起こる。特に、哺乳類の肝臓は欠けている葉を置き換えません。

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、成人臓器再生⁴を研究するための難解なモデルを表す。ゼブラフィッシュ肝臓は、哺乳類の肝臓と構造的に異なるが、同じ細胞タイプで構成され、哺乳動物²と同じ機能を果たす。それは3つの葉で構成され、2つの後部葉と腸に沿って平らにされる単一の腹側葉がある。部分的な肝切除術は、以前にゼブラフィッシュで行われ、再生の正確なモードに関して矛盾するアカウントを持つ。典型的には、腹側葉全体の除去によって3分の1分の肝切除術が行われる。最初の報告では、腹側葉を除去した後、1週間^5、6、7以内に完全に再生し、哺乳類の肝臓とは対照的に、ゼブラフィッシュ肝臓はエピモルフィック再生が可能であることを示唆した。その後の研究では、腹側葉の除去は、行方不明の腹側葉の再生ではなく、後部葉の代償性再生をもたらし、最終的には週^8、9以内に肝臓質量の回復をもたらした。腹側葉の切除後の側葉の転写的プロファイリングは、代償性再生¹⁰に関連する有意な変化を明らかにした。肝再生の様式は傷害⁸の程度によって変化する可能性があることを考えると、結果の不一致は研究グループ間の部分肝切除プロトコルの技術的変動によるものかもしれないと推測した。

このプロトコルは、腹側葉を除去することによって成体ゼブラフィッシュに3分の1の部分肝切除術を行うための手順を記述する。この技術は、肝再生のメカニズムを評価するために有用である。

プロトコル

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って飼育され、飼育されました。実験はブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物の世話と使用委員会(2016N000405)によって承認されました。成体ゼブラフィッシュは、プロトコルの開始前に24時間断食した。システム水とは、水生施設のゼブラフィッシュの収容タンク内の水を指します。

1. 準備と麻酔

1. システム水に0.016%トリケーヌ溶液を準備します。
   注意:トリケーヌは、目、皮膚、または気道に接触すると刺激性です。
2. 解剖プロトコル中に麻酔ゼブラフィッシュを保持するためにスポンジを準備します。完全なスポンジを四分の一に切ります。カミソリの刃を使用して、スポンジ四分の一の長い軸に平行に走るスポンジの薄いくさびを取り除きます。
   1. スリットは、成魚を収容するのに十分な長さでなければなりません(これは魚の異なるサイズによって異なります)。例えば、長さが35mmの成魚の場合、スリットの長さは20mmでなければなりません。頭と体はスポンジにぴったりと保持されていますが、尾はスポンジの端を越えて走ります(図1B)。
3. スポンジを0.016%トリケイン溶液に浸します。
4. 0.016%トリケーヌ溶液の625 mLに成体ゼブラフィッシュ(オスまたはメスのいずれか)を入れる。
5. 6分間、または魚が触れに反応しなくなるまでインキュベートします。
6. 鉗子を使用して、トリケーヌタンクから魚を慎重に取り出し、魚の腹側をスポンジの溝に上に置きます(図1A - B)。
7. スポンジをトップダウン照明で解剖顕微鏡の下に置きます。

2. 手術

1. 細かい鉗子を使って、皮膚をつまんで心をうろつき、心臓の後部にだけスケールする(図1B)。
2. バネ付きハサミを使用して、鉗子の下にカットを行い、ボディキャビティに穴を開けます(図1C - D)。これは、増加死亡率をもたらすので、心臓や主要な血管を傷つけないように注意してください。
3. バネ付きハサミを使用して、腹部に沿って3〜4mmの切開を行い、切開が骨盤ひれに到達するまで後処理する(図1D - E)。この時点で、肝臓の腹側葉は切開を通して見ることができる。
4. 片手でスポンジの側面を絞り、内臓を体腔から強制的に外します。肝臓の腹側葉は腸の上に見えるでしょう(図1F、2A-B)。肝臓は、黄金色の腸の上に広がるピンクまたはオレンジ色の構造として表示されます。シャムコントロールとして指定された動物は、この時点で回収されます。
5. 2つの尖叉が触れるように細かい鉗子を絞ります。スポンジに圧力をかけながら、肝臓と腸の間に細かい鉗子の尖叉をスライドさせます(図1G)。これは増加した死亡率をもたらすので、腸を穿刺しないように注意してください。
6. 徐々に鉗子の圧力を緩め、尖叉が互いに離れるようにする(図1H)。この摺動作用は、腹側の葉と腸の間の多数の門脈の付着を切断し(図2B)、そして腹側の葉をきれいに取り除くために必要である。肝臓と腸の間のポータル接続がすべて切断されるまで、このプロセスを繰り返します。
7. 細かい鉗子を使って腸から腹側葉を剥がし、残りの肝臓から離れた腹側葉を切る(図1I)。
8. この手順により、3分の1の部分肝切除術が生じます(図1J)。

3. 回復

1. 慎重にスポンジから魚を取り出し、システム水のタンクに置きます。
2. ピペットシステムは、魚が自分で泳ぐまで数分間、エラの上に水を流します(図1K)。
3. 魚をシステムに戻す前に2〜4時間監視します。手術後24時間魚に餌を与えないでください。
4. 実験期間中、魚を毎日監視します。
5. 時間が経つと、体壁の切開は縫合糸を必要とせずに自然に治癒します(図1L,2C)。

4. 腸長分析に対する腹側葉

1. すべての眼の動きが止まるまで、氷水で10分間分析のために運命づけられたすべての動物を安楽死させます。
2. 氷水から魚を取り出し、スポンジの溝に腹側を置きます。
3. バネ付きハサミを使用して、心臓の前部後部位置の腹側の体壁に切開を行います。その後、最初の切開から骨盤のひれまで前部後方軸に沿って走る2つの切開をさらに2つ作ります。(図2A)
4. 皮膚や筋肉を剥がして内臓を明らかにする(図2A)。
5. 蛍光顕微鏡を用いて内臓の明視野画像と蛍光画像を取得します。この視野には、腹側葉が切除された領域が含まれます。動物は分析の前に安楽死させるため、この種の分析は同じ魚の長期イメージングを排除する。

5. 肝臓と体重比の分析

1. すべての眼の動きが止まるまで、氷水で10分間分析のために運命づけられたすべての動物を安楽死させます。
2. 50 mL円錐形のチューブに魚を入れる。
3. 1x PBSに25mLのパラホルムアルデヒドを加え、チューブにツイーンを0.3%加えます。
   注意:ホルムアルデヒドは有毒であり、ホルムアルデヒドを含む溶液は常に化学フードで処理する必要があります。
4. 4°Cで48時間のヌテート。
5. 1x PBSで10分の4回のスウィーを実行し、0.3%のトゥイーンを行います。
6. 鉗子で魚を取り出し、ペーパータオルで乾かします。
7. 魚全体の重量を記録します。
8. バネ付きハサミを使用して、心臓の前部後部位置の腹側の体壁に切開を行います。その後、最初の切開から骨盤のフィンまで前部後方軸に沿って走る2つの切開をさらに2つ作ります。(図2A)
9. 皮膚や筋肉を剥がして内臓を明らかにする(図2A)。
10. 蛍光顕微鏡を用いて肝臓の明視野画像を取得する。
11. 肝臓を解剖し、肝臓の破片を計量ボートに乗せた。
12. 肝臓の体重を記録します。

結果

成体ゼブラフィッシュ肝臓の再生ポテンシャルを調べるために、成体ゼブラフィッシュで部分肝切除術(PHX)を行った。一般に、1.5〜2.5歳の範囲で、大きな成人(長さ30〜40mm)が選択された。個々の実験の中で、動物は同じタンクから選択され、年齢とサイズが一致した。適切な対照として、我々は、動物が麻酔を受け、腹側の体壁に大きな切開を受けたが、組織を除去せずに回収されたシャム手...

ディスカッション

肝臓再生のためのゼブラフィッシュと哺乳類モデルの解剖学的な違いは、肝臓切除に独特の課題を提示する。ゼブラフィッシュの肝臓は心臓と腸の近くにあります。誤ってどちらかの臓器にダメージを与えると、死亡率が増加する。ゼブラフィッシュの肝臓はカプセル化されておらず、腸から分離することがより困難になります。肝臓は、門脈を介して腸から栄養豊富な血液を受け取ります....

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500