成虫ゼブラフィッシュの部分肝切除術

要約

このプロトコルは、肝臓再生の研究を可能にするために、成体ゼブラフィッシュの肝臓の腹側葉を除去するための手順を説明します。

要約

肝不全は世界的に主要な死因の一つであり、慢性肝疾患による死亡率は米国で急激に増加している。健康な肝臓は、毒性の損傷から再生することができるが、先進の肝疾患では、再生する肝臓の自然な能力が損なわれる。ゼブラフィッシュは、再生を研究するための強力な実験システムとして登場しました。それらは部分的な肝切除術からの肝臓再生を研究するための理想的なモデルであり、肝臓の一部が外科的に除去され、残りはそのまま残る直接的な臨床的関連性を有する処置である。部分肝切除術のための標準的なプロトコルはありません。このモデルを使用した以前の研究では、わずかに異なるプロトコルを使用し、異なる結果を報告しました。ここで説明する、成体ゼブラフィッシュの部分肝切除術を行うための効率的で再現可能なプロトコルである。この技術を用い、ゼブラフィッシュが切除された葉のエピモルフィック再生が可能であることを実証する。このプロトコルは、ゼブラフィッシュの肝臓再生に必要なメカニズムをさらに調べるのに使用できます。

概要

ヒトの固体器官の中で、肝臓は再生可能な唯一の器官^である1.これは肝が必須臓器であるため、重要な代謝機能、エネルギー貯蔵、血液解毒、血漿タンパク質の分泌、胆汁産生を担う^重要な2である。毒性または炎症性の損傷のために失われた肝細胞は、主に残りの肝細胞の分裂によって置換される^1.肝臓再生を研究するための古典的な実験モデルの1つは、肝臓の個々の葉が除去され、残りの葉がそのまま残っている部分肝切除術^である3.この手順は、最初にラットで開発されました, 肝臓の質量の約3分の2が除去されます.哺乳類の部分的な肝切除術の後、肝臓が最初の質量を回復するまで残りの葉に代償性再生が起こる。特に、哺乳類の肝臓は欠けている葉を置き換えません。

ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、成人臓器再生⁴を研究するための難解なモデルを表す。ゼブラフィッシュ肝臓は、哺乳類の肝臓と構造的に異なるが、同じ細胞タイプで構成され、哺乳動物²と同じ機能を果たす。それは3つの葉で構成され、2つの後部葉と腸に沿って平らにされる単一の腹側葉がある。部分的な肝切除術は、以前にゼブラフィッシュで行われ、再生の正確なモードに関して矛盾....

プロトコル

ゼブラフィッシュは、標準的な手順に従って飼育され、飼育されました。実験はブリガム・アンド・ウィメンズ病院の施設動物の世話と使用委員会(2016N000405)によって承認されました。成体ゼブラフィッシュは、プロトコルの開始前に24時間断食した。システム水とは、水生施設のゼブラフィッシュの収容タンク内の水を指します。

1. 準備と麻酔

1. システム水に0.016%トリケーヌ溶液を準備します。
   注意:トリケーヌは、目、皮膚、または気道に接触すると刺激性です。
2. 解剖プロトコル中に麻酔ゼブラフィッシュを保持するためにスポンジを準備します。完全なスポンジを四分の一に切ります。カミソリの刃を使用して、スポンジ四分の一の長い軸に平行に走るスポンジの薄いくさびを取り除きます。
   1. スリットは、成魚を収容するのに十分な長さでなければなりません(これは魚の異なるサイズによって異なります)。例えば、長さが35mmの成魚の場合、スリットの長さは20mmでなければなりません。頭と体はスポンジにぴったりと保持されていますが、尾はスポンジの端を越えて走ります(図1B)。
3. スポンジを0.016%トリケイン溶液に浸します。
4. 0.016%トリケーヌ溶液の625 mLに成体ゼブラフィッシュ(オスまたはメスのいずれか)を入れる。
....

結果

成体ゼブラフィッシュ肝臓の再生ポテンシャルを調べるために、成体ゼブラフィッシュで部分肝切除術(PHX)を行った。一般に、1.5〜2.5歳の範囲で、大きな成人(長さ30〜40mm)が選択された。個々の実験の中で、動物は同じタンクから選択され、年齢とサイズが一致した。適切な対照として、我々は、動物が麻酔を受け、腹側の体壁に大きな切開を受けたが、組織を除去せずに回収されたシャム手.......

ディスカッション

肝臓再生のためのゼブラフィッシュと哺乳類モデルの解剖学的な違いは、肝臓切除に独特の課題を提示する。ゼブラフィッシュの肝臓は心臓と腸の近くにあります。誤ってどちらかの臓器にダメージを与えると、死亡率が増加する。ゼブラフィッシュの肝臓はカプセル化されておらず、腸から分離することがより困難になります。肝臓は、門脈を介して腸から栄養豊富な血液を受け取ります........

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500