Epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto

Riepilogo

Questo protocollo descrive la procedura per rimuovere il lobo ventrale del fegato nel pesce zebra adulto per consentire lo studio della rigenerazione epatica.

Abstract

L'insufficienza epatica è una delle principali cause di morte in tutto il mondo e la mortalità per malattie croniche del fegato sta aumentando bruscamente negli Stati Uniti. I fegati sani sono in grado di rigenerarsi da danni tossici, ma nelle malattie epatiche avanzate, la naturale capacità del fegato di rigenerarsi è compromessa. Zebrafish è emerso come un potente sistema sperimentale per lo studio della rigenerazione. Sono un modello ideale per studiare la rigenerazione epatica dall'epatomia parziale, una procedura con rilevanza clinica diretta in cui parte del fegato viene rimossa chirurgicamente, lasciando intatto il resto. Non esiste un protocollo standard per l'epatotomia parziale; studi precedenti che utilizzano questo modello hanno utilizzato protocolli leggermente diversi e riportato risultati disparati. Qui descritto è un protocollo efficiente e riproducibile per eseguire un'epatotectomia parziale nel pesce zebra adulto. Usiamo questa tecnica per dimostrare che i pesci zebra sono in grado di rigenerazione epimorfica del lobo reinsediato. Questo protocollo può essere utilizzato per interrogare ulteriormente i meccanismi necessari per la rigenerazione epatica nel pesce zebra.

Introduzione

Tra gli organi solidi nell'uomo, il fegato è l'unico organo in grado di rigenerazione¹. Questo è fondamentale, in quanto il fegato è un organo essenziale, responsabile delle principali funzioni metaboliche, conservazione dell'energia, disintossicazione del sangue, secrezione di proteine plasmatiche e produzione di bile². Gli epatociti persi a causa di danni tossici o infiammatori vengono sostituiti principalmente attraverso la divisione degli epatociti rimanenti¹. Un modello sperimentale classico per lo studio della rigenerazione epatica è l'epatomia parziale, in cui vengono rimossi i singoli lobi del fegato, lasciando intatti i lobi^{rimanenti 3}. Questa procedura è stata inizialmente sviluppata nei ratti, in cui vengono rimossi circa due terzi della massa epatica. Dopo un'epatomia parziale nei mammiferi, la rigenerazione compensativa si verifica nei lobi rimanenti fino a quando il fegato non recupera la sua massa iniziale. In particolare, il fegato di mammifero non sostituisce i lobi mancanti.

I pesci zebra (Danio rerio) rappresentano un modello trattabile per lo studio della rigenerazione di organi adulti⁴. Il fegato di zebrafish, sebbene strutturalmente diverso dal fegato di mammifero, è costituito dagli stessi tipi di cellule e svolge la stessa funzione dei mammiferi². È composto da tre lobi, con due lobi dorsali e un singolo lobo ventrale che sono appiattiti lungo l'intestino. L'epatotomia parziale è stata precedentemente eseguita in zebrafish, con resoconti contrastanti sulla modalità precisa di rigenerazione. Tipicamente, un'epatotectomia parziale di un terzo viene eseguita rimozione dell'intero lobo ventrale. I primi rapporti indicavano che dopo la rimozione del lobo ventrale, è stato completamente rigenerato entro^{una settimana 5,6,7}, suggerendo che a differenza del fegato di mammifero, il fegato di zebrafish è in grado di rigenerazione epimorfica. Studi successivi hanno dimostrato che la rimozione del lobo ventrale ha portato alla rigenerazione compensativa nei lobi dorsali, piuttosto che alla rigenerazione del lobo ventrale mancante e, in ultima analisi, al recupero della massa epatica entro^{una settimana 8,9}. La profilazione trascrittamica dei lobi dorsali a seguito della resezione del lobo ventrale ha rivelato cambiamenti significativi associati alla rigenerazione^{compensativa 10}. Dato che la modalità di rigenerazione epatica può variare con l'entità della^{lesione 8}, abbiamo ipotizzato che le discrepanze nei risultati possano essere dovute a variazioni tecniche nel protocollo parziale di epatomia tra gruppi di ricerca.

Questo protocollo descrive una procedura per eseguire un'epatotectomia parziale di un terzo sul pesce zebra adulto rimuovendo il lobo ventrale. Questa tecnica sarà preziosa per valutare i meccanismi di rigenerazione epatica.

Protocollo

Zebrafish sono stati allevati e allevati secondo procedure standard. Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del Brigham and Women's Hospital (2016N000405). I pesci zebra adulti sono stati digiunati per 24 ore prima dell'inizio del protocollo. L'acqua del sistema si riferisce all'acqua nei serbatoi di alloggiamento del pesce zebra nella struttura acquatica.

1. Preparazione e anestesizzazione

1. Preparare la soluzione di Tricaine 0,016% nell'acqua del sistema.
   ATTENZIONE: La tricaina è irritante se viene a contatto con gli occhi, la pelle o le vie respiratorie.
2. Preparare una spugna per tenere il pesce zebra anestetizzato durante il protocollo di dissezione. Tagliare una spugna piena in quarti. Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere un sottile cuneo di spugna che corre parallelo al lungo asse del quarto di spugna.
   1. La fessura dovrebbe essere abbastanza lunga da ospitare un pesce adulto (questo varierà tra diverse dimensioni di pesce). Ad esempio, per un pesce adulto di 35 mm di lunghezza, la lunghezza della fessura dovrebbe essere di 20 mm. La testa e il corpo sono comodamente tenuti nella spugna, ma la coda corre oltre il bordo della spugna (Figura 1B).
3. Immergere la spugna in soluzione di Tricaine allo 0,016%.
4. Posizionare il pesce zebra adulto (maschio o femmina) in 625 mL di soluzione di Tricaine 0,016%.
5. Incubare per 6 minuti o fino a quando il pesce non risponde al tatto.
6. Utilizzando le flessure, rimuovere con cura il pesce dal serbatoio di Tricaine e posizionare il lato ventrale del pesce nella scanalatura dellaspugna (Figura 1A - B).
7. Posizionare la spugna sotto un microscopio sezionato con illuminazione dall'alto verso il basso.

2. Chirurgia

1. Usando forcep fini, pizzicare la pelle e ridimensionare medialmente, appena posteriore al cuore (Figura 1B).
2. Utilizzando forbici a molla, effettuare un taglio sotto le forcep per creare un foro nella cavità corporea (Figura 1C - D). Fare attenzione a non ferire il cuore o un vaso sanguigno principale, in quanto ciò comporterà un aumento della mortalità.
3. Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione di 3-4 mm lungo l'addome, elaborando posteriormente fino a quando l'incisione arriva alle pinne pelviche(Figura 1D - E). A questo punto, il lobo ventrale del fegato può essere visibile attraverso l'incisione.
4. Spremere i lati della spugna con una mano per forzare gli organi viscerali fuori dalla cavità corporea. Il lobo ventrale del fegato sarà visibile sopra l'intestino(figure 1F,2A-B). Il fegato apparirà come una struttura rosa o arancione distribuita sull'intestino bruno-dorato. A questo punto vengono recuperati animali designati come controlli fittizi.
5. Spremere le forcep sottili in modo che i due denti si tocchino. Pur mantenendo la pressione sulla spugna, far scorrere i denti delle forcep fini tra il fegato e l'intestino (Figura 1G). Fai attenzione a non forare l'intestino, poiché ciò comporterà un aumento della mortalità.
6. Rilassare lentamente la pressione sui farsa in modo che i denti si allontanino l'uno dall'altro(Figura 1H). Questa azione scorrevole aggredisce i numerosi attacchi delle vene portale tra il lobo ventrale e l'intestino(Figura 2B),ed è necessaria per rimuovere in modo pulito il lobo ventrale. Ripetere questo processo fino a quando tutte le connessioni del portale tra fegato e intestino non sono state recise.
7. Sbucciare il lobo ventrale dall'intestino usando forcep fini e tagliare il lobo ventrale libero dal resto del fegato (Figura 1I).
8. Questa procedura si traduce in un'epatotectomia parziale di un terzo (figura 1J).

3. Recupero

1. Rimuovere con cura il pesce dalla spugna e posizionarelo in un serbatoio di acqua di sistema.
2. Il sistema pipette innaffia sulle branchie per alcuni minuti fino a quando il pesce nuota da solo(Figura 1K).
3. Monitorare i pesci per 2-4 ore prima di rimetterli sul sistema. Non nutrire il pesce per un pieno 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
4. Monitorare quotidianamente i pesci per tutta la durata dell'esperimento.
5. Con il tempo, l'incisione nella parete corporea guarirà naturalmente senza la necessità di suture(Figura 1L,2C).

4. Analisi della lunghezza da lobo ventrale a intestino

1. Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.
2. Rimuovere il pesce dall'acqua ghiacciata e posizionarlo lato ventrale verso l'alto nel solco di una spugna.
3. Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).
4. Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).
5. Acquisire immagini luminose e fluorescenti degli organi viscerali utilizzando un microscopio a epifluorescenza. Questo campo visivo includerà l'area in cui è stato rispecchiato il lobo ventrale. Poiché gli animali vengono eutanasiati prima dell'analisi, questo tipo di analisi impedisce l'imaging a lungo termine dello stesso pesce.

5. Analisi del rapporto fegato/peso corporeo

1. Eutanasia di tutti gli animali destinati all'analisi in acqua ghiacciata per 10 minuti fino a quando non cessano tutti i movimenti opercolari.
2. Mettere il pesce in un tubo conico da 50 ml.
3. Aggiungere 25 ml di paraformaldeide al 4% in 1x PBS e 0,3% di Interpolazione al tubo.
   ATTENZIONE: La formaldeide è tossica e le soluzioni contenenti formaldeide devono sempre essere lavorate in una cappa chimica.
4. Nutato per 48 h a 4 °C.
5. Eseguire quattro lavaggi da 10 minuti in 1x PBS e 0,3% tween.
6. Recuperare il pesce con le affelli e asciugare su un tovagliolo di carta.
7. Registrare il peso dell'intero pesce.
8. Utilizzando forbici a molla, fare un'incisione nella parete del corpo ventrale nella posizione anteriore-posteriore del cuore. Quindi, fare altre due incisioni che corrono lungo l'asse anteriore-posteriore dalla prima incisione fino alle pinne pelviche. (Figura 2A).
9. Sbucciare la pelle e il muscolo per rivelare gli organi viscerali (Figura 2A).
10. Acquisire immagini a campo luminoso del fegato utilizzando un microscopio a epifluorescenza.
11. Sezionare il fegato, posizionando i pezzi di fegato su una barca di pesatura.
12. Registrare il peso del fegato.

Risultati

Al fine di esaminare il potenziale rigenerativo del fegato di zebrafish adulto, abbiamo eseguito un'epatotectomia parziale (PHX) nel pesce zebra adulto. In generale, sono stati selezionati grandi adulti (30-40 mm di lunghezza), che vanno da 1,5 a 2,5 anni. All'interno dei singoli esperimenti, gli animali venivano selezionati dallo stesso serbatoio e corrispondevano all'età e alle dimensioni. Come controllo appropriato, abbiamo utilizzato interventi chirurgici fittizi in cui l'animale è stato anestetizzato e ha ricevuto...

Discussione

Le differenze anatomiche tra zebrafish e modelli di mammiferi per la rigenerazione del fegato presentano sfide uniche per la resezione epatica. Il fegato nei pesci zebra è nelle immediate vicinanze del cuore e dell'intestino; inavvertitamente dannoso per entrambi gli organi si traduce in un aumento della mortalità. Il fegato di zebrafish non è incapsulato, rendendo più difficile separarsi dall'intestino. Il fegato riceve sangue ricco di nutrienti dall'intestino attraverso le vene portale. Nei mammiferi, le vene che l...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500