Yetişkin Zebra Balıklarında Kısmi Hepatektomi

Özet

Bu protokol, karaciğer yenilenmesinin incelenmesini sağlamak için yetişkin zebra balıklarında karaciğerin ventral lobunun çıkarılması prosedürünü açıklar.

Özet

Karaciğer yetmezliği dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir ve Amerika Birleşik Devletleri'nde kronik karaciğer hastalığından ölüm oranı keskin bir şekilde artmaktadır. Sağlıklı karaciğerler toksik hasardan yenilenebilir, ancak ileri karaciğer hastalığında karaciğerin doğal yenilenme yeteneği bozulur. Zebra balığı, yenilenmeyi incelemek için güçlü bir deneysel sistem olarak ortaya çıkmıştır. Karaciğerin bir kısmının cerrahi olarak çıkarıldığı, geri kalanının sağlam bıraktığı doğrudan klinik alaka düzeyine sahip bir prosedür olan kısmi hepatektomiden karaciğer yenilenmesini incelemek için ideal bir modeldir. Kısmi hepatektomi için standart bir protokol yoktur; bu modeli kullanan önceki çalışmalar biraz farklı protokoller kullanmış ve farklı sonuçlar bildirmiştir. Burada açıklanan, yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi yapmak için verimli, tekrarlanabilir bir protokoldür. Zebra balıklarının resected lobun epimorfik rejenerasyonunu yapabildiğini göstermek için bu tekniği kullanıyoruz. Bu protokol zebra balıklarında karaciğer yenilenmesi için gerekli mekanizmaları daha fazla sorgulamak için kullanılabilir.

Giriş

İnsanlardaki katı organlar arasında karaciğer yenilenebilen tek organdır¹. Karaciğer, temel metabolik fonksiyonlardan, enerji depolamadan, kan detoksifikasyonundan, plazma proteinlerinin salgılanmasından ve safra üretiminden sorumlu temel bir organ olduğu için bu kritiktir². Toksik veya enflamatuar hasar nedeniyle kaybedilen hepatositler öncelikle kalan hepatositlerin bölünmesi ile değiştirilir¹. Karaciğer yenilenmesini incelemek için klasik deneysel modellerden biri, karaciğerin bireysel loblarının çıkarıldığı ve kalan lobların sağlam kaldığı kısmi hepatektomidir³. Bu prosedür başlangıçta karaciğer kütlesinin yaklaşık üçte ikisinin çıkarıldığı sıçanlarda geliştirilmiştir. Memelilerde kısmi hepatektomiden sonra, karaciğer ilk kütlesini geri alana kadar kalan loblarda telafi edici rejenerasyon meydana gelir. Özellikle, memeli karaciğeri eksik lobların yerini almaz.

Zebra balığı (Danio rerio) yetişkin organ rejenerasyonunu incelemek için çekişli bir modeli temsil eder⁴. Zebra balığı karaciğeri, yapısal olarak memeli karaciğerinden farklı olsa da, aynı hücre türlerinden oluşur ve memelilerde olduğu gibi aynı işleve hizmet eder². İki sırt lob ve bağırsak boyunca düzleştirilmiş tek bir ventral lob ile üç lobdan oluşur. Kısmi hepatektomi daha önce zebra balıklarında, kesin rejenerasyon modu ile çelişen hesaplarla gerçeklenmiştir. Tipik olarak, tüm ventral lobun çıkarılmasıyla üçte bir kısmi hepatektomi yapılır. İlk raporlar, ventral lobun çıkarılmasından sonra,⁵, 6^,7hafta içinde tamamen yenilendiğini ve^memelikaraciğerinin aksine zebra balığı karaciğerinin epimorfik rejenerasyon yapabileceğini göstermektedir. Daha sonraki çalışmalar, ventral lobun çıkarılmasının, eksik ventral lobun yenilenmesi yerine sırt loblarında telafi edici yenilenme ile sonuçlendiğini ve sonuçta karaciğer kütlesinin bir hafta içinde iyileşmesine neden olduğunu göstermiştir^8,9. Ventral lobun rezeksiyonunu takiben sırt loblarının transkriptomik profillemesi, kompanzasyon rejenerasyonu ile ilişkili önemli değişiklikler ortaya koydu¹⁰. Karaciğer rejenerasyon modunun yaralanmanın boyutuna göre değişebileceği göz önüne alındığında⁸, sonuçlardaki tutarsızlıkların araştırma grupları arasındaki kısmi hepatektomi protokolündeki teknik varyasyondan kaynaklanabileceğini tahmin ettik.

Bu protokol, ventral lobun çıkarılmasıyla yetişkin zebra balıklarında üçte bir kısmi hepatektomi yapılması için bir prosedür açıklanmaktadır. Bu teknik karaciğer yenilenme mekanizmalarının değerlendirilmesi için değerli olacaktır.

Protokol

Zebra balıkları standart prosedürlere göre yetiştirildi ve yetiştirildi. Deneyler Brigham ve Kadın Hastanesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (2016N000405) tarafından onaylandı. Yetişkin zebra balıkları, protokolün başlamasından önce 24 saat boyunca oruç tuttu. Sistem suyu, su tesisindeki zebra balığı muhafaza tanklarındaki suyu ifade eder.

1. Hazırlık ve anestezi

1. Sistem suyunda %0,016 Trikain çözeltisi hazırlayın.
   DİkKAT: Trikain gözlere, cilde veya solunum yollarına temas ederse tahriş edicidir.
2. Diseksiyon protokolü sırasında uyuşturulma zebra balıklarını tutmak için bir sünger hazırlayın. Tam bir süngeri çeyrekliklere kesin. Jilet kullanarak, sünger çeyreğinin uzun eksenine paralel çalışan ince bir sünger kamasını çıkarın.
   1. Yarık yetişkin bir balığı barındıracak kadar uzun olmalıdır (bu farklı balık boyutları arasında değişecektir). Örneğin, 35 mm uzunluğundaki yetişkin bir balık için yarık uzunluğu 20 mm olmalıdır. Baş ve vücut süngerde sıkıca tutulur, ancak kuyruk süngerin kenarından geçer (Şekil 1B).
3. Süngeri% 0.016 Tricaine çözeltisinde bekletin.
4. Yetişkin zebra balıklarını (erkek veya dişi) % 0.016 Trikain çözeltisinin 625 mL'sine yerleştirin.
5. 6 dakika boyunca veya balık dokunmaya tepkisiz olana kadar kuluçkaya yatırın.
6. Yaban arılarını kullanarak, balıkları Tricaine tankından dikkatlice çıkarın ve balık ventral tarafını süngerin oluğuna yerleştirin (Şekil 1A - B).
7. Süngeri yukarıdan aşağıya aydınlatmalı bir kesme mikroskobu altına yerleştirin.

2. Cerrahi

1. İnce tokmaklar kullanarak, cildi çimdikleyin ve kalbe sadece arka olarak orta derecede ölçeklendirin (Şekil 1B).
2. Yaylı makas kullanarak, vücut boşluğunda bir delik oluşturmak için önpslerin altında bir kesim yapın (Şekil 1C - D). Kalbi veya büyük bir kan damarını yaralamamaya dikkat edin, çünkü bu ölüm oranının artmasına neden olacaktır.
3. Yaylı makas kullanarak, karın boyunca 3-4 mm'lik bir kesi yapın, kesi pelvik yüzgeçlere ulaşana kadar arka arkaya işleyin (Şekil 1D - E). Bu noktada, karaciğerin ventral lob kesi yoluyla görülebilir.
4. Visseral organları vücut boşluğundan çıkarmak için süngerin kenarlarını bir elinizle sıkın. Karaciğerin ventral lobları bağırsağın üstünde görülebilir (Şekil 1F, 2A-B). Karaciğer, altın-kahverengi bağırsağın üzerine yayılmış pembe veya turuncu bir yapı olarak görünecektir. Sahte kontrol olarak belirlenen hayvanlar bu noktada kurtarılır.
5. İnce kaleleri iki tine dokunarak olacak şekilde sıkın. Sünger üzerinde baskı tutarken, ince kümeslerin tinelerini karaciğer ve bağırsak arasına kaydırın (Şekil 1G). Bağırsakları delmemeye dikkat edin, çünkü bu ölüm oranının artmasına neden olacaktır.
6. Tinelerin birbirlerinden uzaklaşması için esinler üzerindeki basıncı yavaşça gevşetin (Şekil 1H). Bu kayar etki, ventral lob ve bağırsak arasındaki çok sayıda portal damar ekini keser (Şekil 2B) ve ventral lobu temiz bir şekilde çıkarmak için gereklidir. Karaciğer ve bağırsak arasındaki tüm portal bağlantıları kopana kadar bu işlemi tekrarlayın.
7. İnce önseçimler kullanarak bağırsak lobunun bağırsaktan geri soyun ve ventral lobun karaciğerin geri kalanından arındırın(Şekil 1I).
8. Bu prosedür üçte bir kısmi hepatektomi ile sonuçlanır (Şekil 1J).

3. kurtarma

1. Balıkları süngerden dikkatlice çıkarın ve bir sistem suyu tankına yerleştirin.
2. Pipet sistemi, balık kendi kendine yüzene kadar birkaç dakika solungaçların üzerinde su sağlar (Şekil 1K).
3. Balıkları sisteme geri yerleştirmeden önce 2-4 saat izleyin. Ameliyattan sonra balığı tam 24 saat beslemeyin.
4. Deney süresince balıkları günlük olarak izleyin.
5. Zamanla, vücut duvarındaki kesi dikişe gerek kalmadan doğal olarak iyileşir (Şekil 1L, 2C).

4. Ventral lobdan bağırsak uzunluğu analizine

1. Tüm opera hareketleri sona erene kadar buzlu suda analize yönelik tüm hayvanları 10 dakika ötenazi yapın.
2. Balıkları buzlu sudan çıkarın ve ventral tarafı bir süngerin oluğuna yerleştirin.
3. Yaylı makas kullanarak, kalbin ön-arka konumundaki ventral vücut duvarında bir kesi yapın. Daha sonra ilk kesiden pelvik yüzgeçlere kadar ön-arka eksen boyunca uzanan iki kesi daha yapın. (Şekil 2A).
4. Viseral organları ortaya çıkarmak için cildi ve kası soyun (Şekil 2A).
5. Epifluoresans mikroskobu kullanarak viseral organların parlak alan ve floresan görüntülerini elde edin. Bu görüş alanı, ventral lobun reseksiyon edildiği alanı içerecektir. Hayvanlar analizden önce ötenaziye tabi olduğundan, bu tür bir analiz aynı balığın uzun süreli görüntülenmesini önler.

5. Karaciğerden vücut ağırlığına oran analizi

1. Tüm opera hareketleri sona erene kadar buzlu suda analize yönelik tüm hayvanları 10 dakika ötenazi yapın.
2. Balıkları 50 mL konik bir tüpe yerleştirin.
3. 1x PBS'de %4 paraformaldehitin 25 mL'sini ve tüpe %0,3 Arasını ekleyin.
   DİkKAT: Formaldehit toksiktir ve formaldehit içeren çözeltiler her zaman kimyasal bir başlıkta işlenmelidir.
4. 4 °C'de 48 saat fındık.
5. 1x PBS ve %0,3 Ara ile dört 10 dakikalık yıkama gerçekleştirin.
6. Balıkları tokslarla alın ve bir kağıt havlu üzerinde kurutun.
7. Tüm balığın ağırlığını kaydedin.
8. Yaylı makas kullanarak, kalbin ön-arka konumundaki ventral vücut duvarında bir kesi yapın. Daha sonra, ilk kesiden pelvik yüzgeçlere kadar ön-arka eksen boyunca uzanan iki kesi daha yapın. (Şekil 2A).
9. Viseral organları ortaya çıkarmak için cildi ve kası soyun (Şekil 2A).
10. Epifluoresans mikroskobu kullanarak karaciğerin parlak alan görüntülerini elde edin.
11. Karaciğeri parçalara ayırın, karaciğer parçalarını bir tartım teknesine yerleştirin.
12. Karaciğerin ağırlığını kaydedin.

Sonuçlar

Yetişkin zebra balığı karaciğerinin rejeneratif potansiyelini incelemek için yetişkin zebra balıklarında kısmi hepatektomi (PHX) yaptık. Genel olarak, 1,5-2,5 yaş arasında değişen büyük yetişkinler (30-40 mm uzunluğunda) seçildi. Bireysel deneylerde, hayvanlar aynı tanktan seçildi ve yaş ve boyutla eşleşti. Uygun bir kontrol olarak, hayvanın hem uyuşturulduğu hem de ventral vücut duvarında büyük bir kesi aldığı ancak herhangi bir doku çıkarılmadan kurtarıldığı sahte ameliyatlarda...

Tartışmalar

Karaciğer yenilenmesi için zebra balığı ve memeli modelleri arasındaki anatomik farklılıklar karaciğer rezeksiyonu için benzersiz zorluklar ortaya koyuyor. Zebra balıklarındaki karaciğer kalbe ve bağırsaya yakındır; yanlışlıkla her iki organa da zarar vermek mortalitenin artmasına neden olur. Zebra balığı karaciğeri kapsüllenmemiştir, bu da bağırsaktan ayrılmasını zorlaştırır. Karaciğer, portal damarlardan bağırsaktan besin bakımından zengin kan alır. Memelilerde, bağırsaktan ay...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15700
50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Corning	352098
AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance	Bay State Scale & Systems, INC.	WL-104-1051
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps	Electron Microscopy Sciences	72997-07
Epifluorescence microscope	Zeiss	Discovery.V8
Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge	Amazon	B07CBSM53Z
PBS10X Liquid Conc 4L	EMD Millipore	6505-4L
Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight	Biomedical Research Instruments	11-1020
Tricaine methanesulfonate	Syndel	TRIC-M-GR-0010
Tween 20, Fisher BioReagents	Fischer Scientific	BP337-500