الدقة قص شرائح الرئة كأداة فعالة لهيكل الأوعية الرئوية في الجسم الحي السابق ودراسات الانقباض

Summary

يقدم هنا بروتوكول للحفاظ على انقباض الأوعية الدموية لأنسجة الرئة المورين PCLS ، مما يؤدي إلى صورة ثلاثية الأبعاد متطورة للمجرى الوعائي الرئوي والمجرى الهوائي ، والتي يمكن الحفاظ عليها لمدة تصل إلى 10 أيام عرضة للعديد من الإجراءات.

Abstract

التصور من أنسجة الرئة مورين يوفر معلومات هيكلية وخليوية قيمة بشأن مجرى الهواء الكامنة وvasculature. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على الأوعية الرئوية التي تمثل حقا الظروف الفسيولوجية لا يزال يمثل تحديات. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التكوين الدقيق لرئتي مورين يؤدي إلى تحديات تقنية في إعداد عينات للصور عالية الجودة التي تحافظ على التركيب الخلوي والهندسة المعمارية. وبالمثل ، يمكن إجراء فحوصات الانقباض الخلوي لدراسة إمكانات الخلايا للاستجابة لمغيري الأوعية في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تستنسخ البيئة المعقدة للرئة السليمة. وعلى النقيض من هذه القضايا التقنية، يمكن تطبيق طريقة قطع شريحة الرئة بدقة (PCLS) كبديل فعال لتصور أنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد دون تحيز إقليمي وتكون بمثابة نموذج انقباض بديل حي لمدة تصل إلى 10 أيام. وقد حافظت الأنسجة المعدة باستخدام PCLS الهيكل والتوجه المكاني، مما يجعلها مثالية لدراسة عمليات المرض في الجسم الحي السابق. يمكن تصور موقع الخلايا الذاتية التي تحمل علامة tdTomato في PCLS التي يتم حصادها من نموذج مورين مراسل tdTomato غير القابل للاختزال بنجاح عن طريق المجهر الكونفوكوكال. بعد التعرض لمكونات الأوعية الدموية ، يوضح PCLS الحفاظ على كل من انقباض الأوعية وبنية الرئة ، والتي يمكن التقاطها بواسطة وحدة الفاصل الزمني. بالاقتران مع الإجراءات الأخرى، مثل لطخة الغربية وتحليل الحمض النووي الريبي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل للشلالات الإشارات التي تكمن وراء مجموعة واسعة من الاضطرابات ويؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية في أمراض الأوعية الدموية الرئوية.

Introduction

تقدم في إعداد وتصوير أنسجة الرئة التي تحافظ على المكونات الخلوية دون التضحية الهيكل التشريحي توفير فهم مفصل للأمراض الرئوية. القدرة على تحديد البروتينات والحمرنا الريبي، والمركبات البيولوجية الأخرى مع الحفاظ على الهيكل الفسيولوجي يقدم معلومات حيوية عن الترتيب المكاني للخلايا التي يمكن أن توسع فهم الفيزيولوجيا المرضية في العديد من الأمراض الرئوية. يمكن أن تؤدي هذه الصور التفصيلية إلى فهم أفضل لأمراض الأوعية الدموية الرئوية ، مثل ارتفاع ضغط الدم الشرياني الرئوي ، عند تطبيقها على النماذج الحيوانية ، مما قد يؤدي إلى تحسين الاستراتيجيات العلاجية.

على الرغم من التقدم في التكنولوجيا، والحصول على صور عالية الجودة من أنسجة الرئة مورين لا يزال يشكل تحديا. تحرك الدورة التنفسية ضغط داخلي سلبي يتم توليده أثناء الاستنشاق¹. عند الحصول تقليديا الخزعات وإعداد عينات الرئة للتصوير، يتم فقدان الانحدار الضغط السلبي مما أدى إلى انهيار مجرى الهواء وvasculature، والتي لم تعد تمثل نفسها في حالتها الراهنة. لتحقيق صور واقعية تعكس الظروف الحالية ، يجب إعادة تضخم الشعب الهوائية الرئوية ، وثقب الأوعية الدموية ، وتغيير الرئة الديناميكية إلى لاعبا اساسيا ثابتا. يسمح تطبيق هذه التقنيات المتميزة بالحفاظ على السلامة الهيكلية ، والرئة الوعائية ، والمكونات الخلوية ، بما في ذلك الخلايا المناعية مثل الضامة ، مما يسمح بالنظر إلى أنسجة الرئة على أقرب ما يمكن إلى حالته الفسيولوجية.

الدقة قطع تشريح الرئة (PCLS) هو أداة مثالية لدراسة التشريح وعلم وظائف الأعضاء من الأوعية الدموية الرئوية². PCLS يوفر التصوير التفصيلي للأنسجة الرئة في ثلاثة أبعاد مع الحفاظ على المكونات الهيكلية والخلوية. وقد استخدمت PCLS في النماذج الحيوانية والبشرية للسماح للصور الحية وعالية الدقة من الوظائف الخلوية في ثلاثة أبعاد, مما يجعلها أداة مثالية لدراسة الأهداف العلاجية المحتملة, قياس تقلص مجرى الهواء الصغيرة ودراسة الفيزيولوجيا المرضية لأمراض الرئة المزمنة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن, ILD, وسرطان الرئة³. وباستخدام تقنيات مماثلة، يمكن أن يحافظ تعرض عينات PCLS لمكونات الأوعية على هيكل الرئة وانقباض الأوعية، وتكرارها في ظروف المختبر. جنبا إلى جنب مع الحفاظ على الانقباض، يمكن أن تخضع العينات المعدة لتحليل إضافي مثل تسلسل الحمض النووي الريبي، وصمة عار غربية، وقياس التدفق الخلوي عند إعدادها بشكل صحيح. وأخيرا، يمكن للخلايا المسماة بلون المراسل والتي تحمل علامة تضان tdTomato بعد حصاد الرئة الحفاظ على وضع العلامات بعد إعداد الميكروسليكس، مما يجعلها مثالية لدراسات تتبع الخلايا. يوفر دمج هذه التقنيات نموذجا متطورا يحافظ على الترتيب المكاني للخلايا وانقباض الأوعية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم أكثر تفصيلا لسلاسل الإشارات والخيارات العلاجية المحتملة في مرض الأوعية الدموية الرئوية.

في هذه المخطوطة، تتعرض أنسجة الرئة المورين PCLS إلى الأوعية الدموية، مما يدل على السلامة الهيكلية المحفوظة وانقباض الأوعية. وتبين الدراسة أن الأنسجة التي تم إعدادها والتعامل معها بشكل مناسب يمكن أن تظل قابلة للحياة لمدة 10 أيام. كما توضح الدراسة الحفاظ على الخلايا ذات الفلورة الذاتية (tdTomato)، مما يسمح للعينات بتوفير صور عالية الدقة للرئة والعمارة. وأخيرا، تم وصف طرق للتعامل مع شرائح الأنسجة وإعدادها لقياس الحمض النووي الريبي واللطخة الغربية للتحقيق في الآليات الأساسية.

Protocol

وكانت جميع رعاية الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية لمستشفى بوسطن للأطفال ووافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على بروتوكولات. الفئران المستخدمة في هذه الدراسة هي الفئران البرية من النوع C57/B6 والفئران المتقاطعة Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. إعداد الحلول

1. إعداد حل العازلة الفوسفات (1x PBS) و 2٪ agarose الحل المطلوب خلال التجربة مقدما.
   1. مزيج 2 غ مسحوق الآغاروز في 100 مل من الماء autoclaved. سخنيه في الميكروويف بضع ثوان في كل مرة حتى يصبح الحل واضحا.
   2. ضع المحلول في حمام مائي عند 42 درجة مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين كل من PBS و 2٪ agarose في درجة حرارة الغرفة لأسابيع.

2. استخراج الرئة الماوس

1. القتل الرحيم الماوس بجرعة زائدة isoflurane. تحقيق جرعة زائدة isoflurane عن طريق وضع كمية صغيرة من isoflurane على ورق الأنسجة في المستوى الأدنى ووضع الماوس في المستوى العلوي في مجفف. يبقى الفأر في المجفف حتى فاقد الوعي.
2. ضمان وفاة الماوس عن طريق تطبيق ضغط أدنى على الرقبة وسحب caudal على الذيل. جلب الماوس إلى السطح تشريح.
3. ضع الماوس في وضعية السطانة و قم بتأمينه في مكانه و قم بتسجيل الكفوف و الأنف إلى الطاولة بشريط لاصق.
4. رش سطح البطن من الماوس مع الإيثانول 70٪ ومسح الايثانول الزائد.
5. ارفع جلد البطن من الفأرة مع ملقط في موقع المثانة وقطع في خط الوسط مع مقص الجراحية، والانتقال بشكل متفوق على منطقة عنق الرحم، وفضح القصبة الهوائية.
6. رفع طبقة اللفافة الكامنة مع ملاقط وقطع مع مقص الجراحية لفضح الأعضاء الحشوية والمقصورة الوسيطة، وقطع مرة أخرى أقل شأنا إلى متفوقة.
7. قطع القص في منتصف الخط لفضح القلب والرئة.
8. باستخدام تشريح حاد، فصل الحجاب الحاجز من الكبد ومقصورة البطن.
9. تحديد موقع الوريد الأجوف السفلي (IVC) تحت الأمعاء وقطع IVC.
10. حدد موقع البطين الأيمن.
    ملاحظة: سيكون للبطين الأيمن مظهر أخف مقارنة بالبطين الأيسر، وينبغي تصور الحاجز داخل البطين، الذي يفصل البطين الأيمن عن البطين الأيسر.
11. حقن 0.5 مل من 1٪ الهيبارين مجزأة إلى البطين الأيمن مع إبرة فراشة 25-30 G ومن ثم تدفق ببطء ولكن بثبات مع 10-15 مل من 1x PBS (الشكل 1A).
    1. توخي الحذر من إدخال الإبرة من خلال القلب وحقن الهيبارين في تجويف الوساطة.
       ملاحظة: حقن برنامج تلفزيوني 1x يتحول أنسجة الرئة البيضاء. يجب أن يكون السائل الذي يتغلغل من الشريان الأورطي البطني واضحا وعديم اللون وقد يصبح الكبد أبيض المظهر بعد التنظيف الناجح.
12. حدد موقع الحنجرة وتشريح اللفافة المحيطة والأنسجة باستخدام ملاقط طرف حادة.
13. ضع الغرز الجراحي تحت القصبة الهوائية وربط عقدة جراحية بشكل فضفاض.
14. وضع ثقب صغير في القصبة الهوائية متفوقة على سلسلة و canulate مع 20 G إبرة حادة النهاية.
15. شد الغرز حول الإبرة والقرصة باستخدام عقدة جراحية.
16. حقن 2.5-4 مل من الآغاروز في القصبة الهوائية ورصد التضخم في الرئة.
17. بعد غرس agarose، صب الباردة، المبردة 1x برنامج تلفزيوني على الرئة لترسيخ agarose.
18. قطع القصبة الهوائية متفوقة على خياطة الجراحية وتشريح الرئة والقلب من mediastinum عن طريق إزالة أي التصاقات واللفافة.
19. بعد التجسيد، ضع في 1x DMEM (ما يكفي لغمر الأنسجة) في طبق بيتري للحفاظ على الجليد. شريحة على الفور فص واحد باستخدام جهاز هزاز (الشكل 1B).

3. الدقة قطع شرائح الرئة

1. إرفاق العينة إلى المنصة مع superglue، والحفاظ على الجانب الوسيط من العينة التي تواجه ما يصل.
2. ملء حاوية العينة مع برنامج تلفزيوني 1x، وضمان أن العينة مغمورة تماما.
3. ملء الحاوية المحيطة حاوية العينة مع الجليد للحفاظ على المحيطة PBS وعينة الباردة.
4. قم بتشغيل الهزاز واضبط الإعدادات المطلوبة أدناه.
   1. تعيين سمك إلى 300um.
   2. تعيين التردد إلى 100 هرتز.
   3. تعيين السعة إلى 0.6 مم.
   4. تعيين السرعة إلى 5 ميكرومتر / ثانية.
5. باستخدام وجع ألين، قم بتحويل حامل النصل إلى الوضع الآمن وافتح الفكين لإدخال شفرة.
6. تشديد الفكين مع وجع ألين وتحويل حامل النصل إلى الموقف المناسب للتقطيع.
7. ضع العينة والمنصة على المربع وانزلق أمام النصل.
8. ملء مربع حول منصة عينة مع برنامج تلفزيوني 1x حتى يتم غمر العينة.
9. جلب شفرة الهزاز تصل إلى حافة الكتلة وخفض يدويا شفرة حتى يكون حتى مع الجزء العلوي من العينة.
10. تأكيد الإعدادات المناسبة وتشغيل الهزاز (الشكل 2).
11. كما يتم قطع شرائح جديدة، وإزالة العينات من برنامج تلفزيوني ووضعها في طبق بيتري عقيمة مع 10 مل من 1x DMEM تحتوي على 1x المضادة للمضادات الحيوية المضادة للميكوزيك.
12. عند الانتهاء، تراجع عن النصل بالكامل ثم استخدم مفتاح ألين لرفع النصل إلى وضع آمن.
13. تخزين العينات في 1x DMEM في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع الحفاظ على البقاء لمدة تصل إلى 10 أيام (انظر تجربة الجدوى أدناه).

4. مثال تجربة الأوعية

1. ضع شريحة هزاز على شريحة المجهر.
2. قبل وضعه على الشريحة، استخدم مسح التنظيف للتخلص من الوسط الزائد (PBS).
3. ضع العينة تحت المجهر على النقيض من المرحلة واستخدم التكبير 10-20x لتحديد السفينة.
4. ضع 500 ميكرولتر من الأوعية، مثل 60 mCl أو 1 ميكرومتر إندوثين-1 لغمر الشريحة بالكامل.
5. مراقبة والتقاط الفيديو عن طريق تسجيل ل30 ق -60 ق (فيديو 1).

5. إعداد الأنسجة لتحلل الحمض النووي الريبي أو البروتين على PCLS

1. قبل بدء التجربة، ملء مربع رغوة البوليسترين صغيرة مع 1 لتر من النيتروجين السائل.
2. ضع أنبوبي طرد مركزي صغيرين (1.5 مل) في الحاوية مع النيتروجين السائل قبل البدء.
   ملاحظة: يجب أن يبرد النيتروجين السائل خارج الأنابيب ، ومع ذلك ، لا يكون في الداخل. تأكد من التعامل مع النيتروجين السائل بعناية ولا تعرض الجلد للنيتروجين السائل. استخدم ملقط وقفازات لوضع وإزالة أنابيب من منطقة الجزاء.
3. ضع 4-5 شرائح هزاز طازجة في وعاء هاون.
4. صب 5-10 مل من N2 السائل على رأس شرائح في وعاء هاون.
5. بسرعة استخدام الحشرات لطحن شرائح تجميد فلاش إلى مسحوق قبل النيتروجين السائل يتبخر.
   ملاحظة: يجب أن تتكثف الأنسجة إلى مسحوق ناعم. إذا لم يكن كذلك، إضافة النيتروجين السائل إضافية حتى يتحقق.
6. باستخدام مغرفة مختبر الصلب (prechilled مع النيتروجين السائل)، مغرفة مسحوق في اثنين من أنابيب الطرد المركزي المبردة.
7. ليس المسحوق بإضافة 500 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي للمضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي أو 500 ميكرولتر من العازلة RIPA (يحتوي على مثبطات 1x protease) للمضي قدما في تحلل البروتين.
8. تخزين العينات في -80 درجة مئوية حتى عزل الحمض النووي الريبي إضافية، قياس BCA، ولطخة الغربية.

6. تحديد الجدوى

1. بعد إعداد الهزاز، ضع شريحتين من الرئة في صفيحة ثقافة 24 بئرا مع 450 ميكرولتر من وسائط DMEM و50 ميكرولتر من كاشف قابلية البقاء على الخلايا (تأكد من غمر الأنسجة بالكامل).
2. ضع العينات مرة أخرى في 5٪ CO₂ في حاضنة 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع الحد الأدنى من التعرض للضوء.
3. في الصباح، مراقبة الحل لتغيير اللون. يتحول المحلول الأزرق إلى اللون الوردي عندما يكون النسيج قابلا للحياة.

7. الحفاظ على وضع العلامات الخلية

1. علاج Cdh5-CreERT2 المعدلة وراثيا عبرت مع الماوس TdTomato Ai14 مع حقن الملكية الفكرية من تاموكسيفين (2 ملغ / يوم) لما مجموعه 5 أيام (الجرعة الإجمالية 10 ملغ تاموكسيفين) للحث على تسمية tdTomato الخلايا الإيجابية كري.
2. بعد أسبوع واحد من الحقن، قم بإعداد الرئتين باستخدام الخطوات المذكورة أعلاه من 1 إلى 3.
3. بعد إعداد شريحة الرئة الدقيقة، ضع الأنسجة على شريحة المجهر وضع غطاء فوق الأنسجة.
4. استخدام المجهر confocal للكشف عن تلطيخ tdTomato (باستخدام الطول الموجي الإثارة 555 نانومتر).

النتائج

عند إضافتها إلى الخلايا أو الأنسجة ، يتم تعديل كاشف الجدوى عن طريق تقليل بيئة الأنسجة القابلة للحياة ويتحول إلى اللون الوردي / الأحمر ، ويصبح فلوريا للغاية. تظهر التغييرات اللونية التمثيلية التي تم اكتشافها من اليوم 0-1 واليوم 9-10 في الشكل 3. كما لوحظ، بدأ الحل الأزرق وتحول ال...

Discussion

في هذه المخطوطة، يتم وصف طريقة محسنة لإنتاج صور عالية الدقة لأنسجة الرئة المورين التي تحافظ على بنية الأوعية الدموية وتحسين المرونة التجريبية، وذلك على وجه التحديد باستخدام تطبيق PCLS للحصول على ميكروسيلكات من أنسجة الرئة التي يمكن مشاهدتها في ثلاثة أبعاد مع الانقباض المحفوظة للمحرك الوع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G