Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

Résumé

Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.

Résumé

La visualisation du tissu pulmonaire murin fournit des informations structurelles et cellulaires précieuses concernant les voies respiratoires et le système vasculaire sous-jacent. Cependant, la préservation des vaisseaux pulmonaires qui représente vraiment des conditions physiologiques présente encore des défis. De plus, la configuration délicate des poumons murins entraîne des défis techniques dans la préparation d’échantillons pour des images de haute qualité qui préservent à la fois la composition cellulaire et l’architecture. De même, des tests de contractilité cellulaire peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre aux vasoconstricteurs in vitro,mais ces tests ne reproduisent pas l’environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces problèmes techniques, la méthode de la tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS) peut être appliquée comme une alternative efficace pour visualiser le tissu pulmonaire en trois dimensions sans biais régional et servir de modèle de contractilité de substitution vivant jusqu’à 10 jours. Les tissus préparés à l’aide de PCLS ont conservé la structure et l’orientation spatiale, ce qui les rend idéaux pour étudier les processus pathologiques ex vivo. L’emplacement des cellules endogènes tdTomato-marqué dans le PCLS récoltées à partir d’un modèle murin tdTomato reporter inductible peut être visualisé avec succès par microscopie confocale. Après exposition à des vasoconstricteurs, le PCLS démontre la préservation de la contractilité des vaisseaux et de la structure pulmonaire, qui peuvent être capturées par un module time-lapse. En combinaison avec les autres procédures, telles que le transfert de Western et l’analyse de l’ARN, le PCLS peut contribuer à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduire à une meilleure compréhension de la physiopathologie dans les maladies vasculaires pulmonaires.

Introduction

Les progrès dans la préparation et l’imagerie du tissu pulmonaire qui préserve les composants cellulaires sans sacrifier la structure anatomique fournissent une compréhension détaillée des maladies pulmonaires. La capacité d’identifier les protéines, l’ARN et d’autres composés biologiques tout en maintenant la structure physiologique offre des informations vitales sur l’arrangement spatial des cellules qui peuvent élargir la compréhension de la physiopathologie dans de nombreuses maladies pulmonaires. Ces images détaillées peuvent conduire à une meilleure compréhension des maladies vasculaires pulmonaires, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, lorsqu’elles sont appliquées à des modèles animaux, ce qui peut conduire à des stratégies thérapeutiques améliorées.

Malgré les progrès technologiques, l’obtention d’images de haute qualité du tissu pulmonaire murin reste un défi. Le cycle respiratoire est entraîné par une pression intrathoracique négative générée lors de l’inhalation¹. Lors de l’obtention traditionnelle de biopsies et de la préparation d’échantillons pulmonaires pour l’imagerie, le gradient de pression négative est perdu, ce qui entraîne l’effondrement des voies respiratoires et du système vasculaire, qui ne se représente plus dans son état actuel. Pour obtenir des images réalistes reflétant les conditions actuelles, les voies respiratoires pulmonaires doivent être regonflées et le système vasculaire perfusé, transformant le poumon dynamique en un luminaire statique. L’application de ces techniques distinctes permet de préserver l’intégrité structurelle, le système vasculaire pulmonaire et les composants cellulaires, y compris les cellules immunitaires telles que les macrophages, ce qui permet de voir le tissu pulmonaire aussi près que possible de son état physiologique.

Le tranchage pulmonaire coupé avec précision (PCLS) est un outil idéal pour étudier l’anatomie et la physiologie du système vasculaire pulmonaire². PCLS fournit une imagerie détaillée du tissu pulmonaire en trois dimensions tout en préservant les composants structurels et cellulaires. Le PCLS a été utilisé dans des modèles animaux et humains pour permettre des images vivantes et à haute résolution des fonctions cellulaires en trois dimensions, ce qui en fait un outil idéal pour étudier des cibles thérapeutiques potentielles, mesurer la contraction des petites voies respiratoires et étudier la physiopathologie des maladies pulmonaires chroniques telles que la MPOC, la MFI et le cancer du poumon^3. En utilisant des techniques similaires, l’exposition d’échantillons de PCLS à des vasoconstricteurs peut préserver la structure pulmonaire et la contractilité des vaisseaux, reproduisant ainsi des conditions in vitro. En plus de préserver la contractilité, les échantillons préparés peuvent subir des analyses supplémentaires telles que le séquençage de l’ARN, le transfert Western et la cytométrie en flux lorsqu’ils sont préparés correctement. Enfin, les cellules marquées par couleur rapporteur marquées avec la fluorescence tdTomato après la récolte pulmonaire peuvent préserver l’étiquetage après la préparation des microselices, ce qui le rend idéal pour les études de suivi cellulaire. L’intégration de ces techniques fournit un modèle sophistiqué préservant l’arrangement spatial des cellules et la contractilité des vaisseaux qui peut conduire à une compréhension plus détaillée des cascades de signalisation et des options thérapeutiques potentielles dans la maladie vasculaire pulmonaire.

Dans ce manuscrit, le tissu pulmonaire murin PCLS est exposé à des vasoconstricteurs, démontrant une intégrité structurelle préservée et une contractilité des vaisseaux. L’étude démontre que les tissus préparés et manipulés de manière appropriée peuvent rester viables pendant 10 jours. L’étude démontre également la préservation des cellules à fluorescence endogène (tdTomato), permettant aux échantillons de fournir des images à haute résolution du système vasculaire pulmonaire et de l’architecture. Enfin, des moyens de manipuler et de préparer des tranches de tissu pour la mesure de l’ARN et le transfert Western pour étudier les mécanismes sous-jacents ont été décrits.

Protocole

Tous les soins aux animaux ont été conformes aux lignes directrices du Boston Children’s Hospital et les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les souris utilisées dans cette étude sont des souris sauvages de type C57/B6 et des souris croisées Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Préparation des solutions

1. Préparer à l’avance une solution tampon de phosphate (1x PBS) et une solution d’agarose à 2% requise pendant l’expérience.
   1. Mélanger 2 g de poudre d’agarose dans 100 mL d’eau autoclavée. Chauffez-le au micro-ondes quelques secondes à la fois jusqu’à ce que la solution soit claire.
   2. Placer la solution au bain-marie à 42 °C jusqu’à utilisation.
      REMARQUE: Le PBS et l’agarose à 2% peuvent être conservés à température ambiante pendant des semaines.

2. Extraction du poumon de la souris

1. Euthanasier la souris par surdosage d’isoflurane. Obtenez un surdosage d’isoflurane en plaçant une petite quantité d’isoflurane sur du papier de soie au niveau inférieur et en plaçant la souris au niveau supérieur dans un dessiccateur. La souris reste dans le dessiccateur jusqu’à ce qu’elle soit inconsciente.
2. Assurer la mort de la souris en appliquant une pression inférieure sur le cou et en tirant caudale sur la queue. Amenez la souris sur la surface de dissection.
3. Placez la souris en position couchée et fixez-la en place en scotchant les pattes et le nez à la table avec du ruban adhésif.
4. Vaporisez la surface ventrale de la souris avec 70% d’éthanol et essuyez l’excès d’éthanol.
5. Soulevez la peau abdominale de la souris avec une pince à l’emplacement de la vessie et coupez à la ligne médiane avec des ciseaux chirurgicaux, en se déplaçant de manière supérieure vers la région cervicale, exposant la trachée.
6. Soulevez la couche fasciale sous-jacente avec une pince à épiler et coupez-la avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer les organes viscéraux et le compartiment médiastinal, en coupant à nouveau de manière inférieure à supérieure.
7. Coupez le sternum à la ligne médiane pour exposer le cœur et les poumons.
8. À l’aide d’une dissection émoussée, détachez le diaphragme du foie et du compartiment abdominal.
9. Localisez la veine cave inférieure (CIV) sous les intestins et coupez la CIV.
10. Localisez le ventricule droit.
    REMARQUE: Le ventricule droit aura un aspect plus léger par rapport au ventricule gauche et le septum intraventriculaire doit être visualisé, séparant le ventricule droit du ventricule gauche.
11. Injecter 0,5 mL d’héparine fractionnée à 1 % dans le ventricule droit avec une aiguille papillon de 25 à 30 G, puis rincer lentement mais régulièrement avec 10 à 15 mL de 1x PBS(Figure 1A).
    1. Attention à ne pas insérer l’aiguille dans le cœur et à injecter de l’héparine dans la cavité médiastinale.
       REMARQUE: L’injection de 1x PBS rend le tissu pulmonaire blanc. Le liquide extravasant de l’aorte abdominale doit être clair et incolore et le foie peut devenir blanc en apparence après un rinçage réussi.
12. Localisez le larynx et disséquez le fascia et les tissus environnants à l’aide d’une pince à épiler à pointe émoussée.
13. Placez la suture chirurgicale sous la trachée et nouez lâchement un nœud chirurgical.
14. Placez un petit trou dans la trachée supérieur à la ficelle et canulez avec une aiguille émoussée de 20 G.
15. Serrez la suture autour de l’aiguille et de la trachée à l’aide d’un nœud chirurgical.
16. Injecter 2,5 à 4 mL d’agarose dans la trachée et surveiller l’inflation du poumon.
17. Après l’instillage de l’agarose, versez 1x PBS froid et réfrigéré sur le poumon pour solidifier l’agarose.
18. Coupez la trachée supérieure à la suture chirurgicale et disséquez le poumon et le cœur du médiastin en enlevant les adhérences et le fascia.
19. Après solidification, placer 1x DMEM (assez pour immerger les tissus) dans une boîte de Petri pour rester sur la glace. Trancher immédiatement un lobe à l’aide d’une machine à vibratome (Figure 1B).

3. Tranches de poumon coupées avec précision

1. Fixez l’échantillon à la plate-forme avec de la supercolle, en gardant le côté médial de l’échantillon tourné vers le haut.
2. Remplissez le récipient d’échantillon avec 1x PBS, en vous assurant que l’échantillon est complètement immergé.
3. Remplissez le récipient entourant le récipient d’échantillon avec de la glace pour garder le PBS environnant et l’échantillon au froid.
4. Allumez le vibratome et ajustez-le aux paramètres souhaités ci-dessous.
   1. Réglez l’épaisseur sur 300um.
   2. Réglez la fréquence sur 100 Hz.
   3. Réglez l’amplitude sur 0,6 mm.
   4. Réglez la vitesse sur 5 μm/s.
5. À l’aide d’une clé Allen, tournez le porte-lame en position de sécurité et ouvrez les mâchoires pour insérer une lame.
6. Serrez les mâchoires avec une clé Allen et tournez le porte-lame dans la position appropriée pour le tranchage.
7. Placez l’échantillon et la plate-forme sur la boîte et faites glisser devant la lame.
8. Remplissez la boîte autour de la plate-forme d’échantillon avec 1x PBS jusqu’à ce que l’échantillon soit submergé.
9. Amenez la lame du vibratome jusqu’au bord du bloc et abaissez manuellement la lame jusqu’à ce qu’elle soit uniforme avec le haut de l’échantillon.
10. Confirmez les paramètres appropriés et exécutez le vibratome (Figure 2).
11. Au fur et à mesure que les tranches fraîches sont coupées, retirez les échantillons du PBS et placez-les dans une boîte de Petri stérile avec 10 mL de 1x DMEM contenant 1x antibiotique-antimycotique.
12. Lorsque vous avez terminé, rétractez entièrement la lame, puis utilisez la clé Allen pour la mettre dans une position sûre.
13. Conservez les échantillons dans 1x DMEM dans un incubateur à 37 °C avec une viabilité préservée jusqu’à 10 jours (voir l’expérience de viabilité ci-dessous).

4. Exemple d’expérience vasoconstrictrice

1. Placez une tranche de vibratome sur une lame de microscope.
2. Avant de le placer sur la glissière, utilisez une lingette nettoyante pour vous débarrasser de l’excès de milieu (PBS).
3. Placez l’échantillon sous microscopie à contraste de phase et utilisez un grossissement de 10 à 20x pour identifier un récipient.
4. Mettez 500 μL de vasoconstricteurs, tels que 60 mM KCl ou 1 μM d’endothéline-1 pour immerger complètement la lame.
5. Observez et capturez la vidéo en enregistrant pendant 30 s-60 s (Vidéo 1).

5. Préparation du tissu pour la lyse de l’ARN ou des protéines sur le PCLS

1. Avant de commencer l’expérience, remplissez une petite boîte en mousse de polystyrène avec 1 L d’azote liquide.
2. Placer deux petits tubes de microcentrifugation (1,5 mL) dans le récipient avec de l’azote liquide avant de commencer.
   REMARQUE: L’azote liquide doit refroidir à l’extérieur des tubes, mais pas à l’intérieur. Assurez-vous de manipuler l’azote liquide avec soin et n’exposez pas la peau à l’azote liquide. Utilisez des pinces et des gants pour placer et retirer les tubes de la boîte.
3. Placez 4-5 tranches de vibratome frais dans un bol de mortier.
4. Versez 5 à 10 mL de liquide N2 sur les tranches dans le bol de mortier.
5. Utilisez rapidement le pilon pour broyer les tranches de congélation éclair en poudre avant que l’azote liquide ne s’évapore.
   REMARQUE: Les tissus doivent se condenser en une poudre fine. Si ce n’est pas le cas, ajoutez de l’azote liquide supplémentaire jusqu’à ce qu’il soit atteint.
6. À l’aide d’une pelle de laboratoire en acier (pré-refroidie avec de l’azote liquide), pré-cuillère la poudre dans les deux tubes de microcentrifugation réfrigérés.
7. Lyser la poudre en ajoutant 500 μL de réactif d’extraction d’ARN pour procéder à l’isolement de l’ARN ou 500 μL de tampon RIPA (contient 1x inhibiteurs de la protéase) pour procéder à la lyse des protéines.
8. Conservez les échantillons à -80 °C jusqu’à l’isolement supplémentaire de l’ARN, la mesure de l’ACA et le transfert western.

6. Détermination de la viabilité

1. Après la préparation du vibratome, placer deux tranches de poumon dans une plaque de culture de 24 puits avec 450 μL de milieu DMEM et 50 μL de réactif de viabilité cellulaire (assurez-vous que le tissu est entièrement immergé).
2. Replacez les échantillons dans un incubateur à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant la nuit avec une exposition minimale à la lumière.
3. Le matin, observez la solution pour le changement de couleur. La solution bleue devient rose lorsque le tissu est viable.

7. Préservation de l’étiquetage cellulaire

1. Traiter un Cdh5-CreERT2 transgénique croisé avec une souris Ai14 tdTomato avec une injection IP de tamoxifène (2 mg/ jour) pendant un total de 5 jours (dose totale de 10 mg de tamoxifène) pour induire des cellules tdTomato label Cre positives.
2. Une semaine après l’injection, préparez les poumons en suivant les étapes 1 à 3 ci-dessus.
3. Après la préparation de la tranche de poumon coupée avec précision, placez le tissu sur une lame de microscope et placez un couvercle sur le dessus du tissu.
4. Utilisez un microscope confocal pour détecter la coloration tdTomato (en utilisant la longueur d’onde d’excitation 555 nm).

Résultats

Lorsqu’il est ajouté aux cellules ou aux tissus, le réactif de viabilité est modifié par l’environnement réducteur des tissus viables et devient rose / rouge, devenant très fluorescent. Les changements de couleur représentatifs détectés du jour 0-1 et du jour 9-10 sont illustrés à la figure 3. Comme indiqué, la solution a commencé en bleu et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur se produit généralement dans les 1-4...

Discussion

Dans ce manuscrit, une méthode améliorée pour produire des images à haute résolution du tissu pulmonaire murin qui préserve la structure vasculaire et optimise la flexibilité expérimentale est décrite, en utilisant spécifiquement l’application de PCLS pour obtenir des microslices de tissu pulmonaire qui peuvent être visualisés en trois dimensions avec une contractilité préservée du système vasculaire. En utilisant le réactif de viabilité, le protocole démontre que des tranches soigneusement préparé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G