Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Zusammenfassung

Die Visualisierung des murinen Lungengewebes liefert wertvolle strukturelle und zelluläre Informationen über die darunter liegenden Atemwege und das Gefäßsystem. Die Erhaltung der Lungengefäße, die wirklich physiologische Bedingungen darstellt, stellt jedoch immer noch Herausforderungen dar. Darüber hinaus führt die empfindliche Konfiguration der murinen Lunge zu technischen Herausforderungen bei der Vorbereitung von Proben für qualitativ hochwertige Bilder, die sowohl die zelluläre Zusammensetzung als auch die Architektur bewahren. In ähnlicher Weise können zelluläre Kontraktilitätsassays durchgeführt werden, um das Potenzial von Zellen zu untersuchen, auf Vasokonstriktoren in vitrozu reagieren, aber diese Assays reproduzieren nicht die komplexe Umgebung der intakten Lunge. Im Gegensatz zu diesen technischen Fragestellungen kann die Precision-Cut Lung Slice (PCLS)-Methode als effiziente Alternative zur dreidimensionalen Visualisierung von Lungengewebe in drei Dimensionen ohne regionale Verzerrung eingesetzt werden und als Live-Surrogat-Kontraktilitätsmodell für bis zu 10 Tage dienen. Gewebe, das mit PCLS hergestellt wurde, hat Struktur und räumliche Orientierung bewahrt, was es ideal macht, um Krankheitsprozesse ex vivo zu untersuchen. Die Position von endogenen tdTomato-markierten Zellen in PCLS, die aus einem induzierbaren tdTomato-Reporter-Murinenmodell gewonnen wurden, kann durch konfokale Mikroskopie erfolgreich visualisiert werden. Nach der Exposition gegenüber Vasokonstriktoren zeigt PCLS die Erhaltung sowohl der Gefäßkontraktilität als auch der Lungenstruktur, die durch ein Zeitraffermodul erfasst werden kann. In Kombination mit den anderen Verfahren, wie der Western-Blot- und RNA-Analyse, kann PCLS zum umfassenden Verständnis von Signalkaskaden beitragen, die einer Vielzahl von Erkrankungen zugrunde liegen und zu einem besseren Verständnis der Pathophysiologie bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen.

Einleitung

Fortschritte in der Präparation und Bildgebung von Lungengewebe, das zelluläre Komponenten bewahrt, ohne die anatomische Struktur zu beeinträchtigen, liefern ein detailliertes Verständnis von Lungenerkrankungen. Die Fähigkeit, Proteine, RNA und andere biologische Verbindungen unter Beibehaltung der physiologischen Struktur zu identifizieren, bietet wichtige Informationen über die räumliche Anordnung von Zellen, die das Verständnis der Pathophysiologie bei zahlreichen Lungenerkrankungen erweitern können. Diese detaillierten Bilder können zu einem besseren Verständnis von pulmonalen Gefäßerkrankungen wie der pulmonalen Arterienhypertonie führen, wenn sie auf Tiermodelle angewendet werden, was möglicherweise zu verbesserten therapeutischen Strategien führt.

Trotz technologischer Fortschritte bleibt es eine Herausforderung, qualitativ hochwertige Bilder von murinem Lungengewebe zu erhalten. Der Atemzyklus wird durch einen negativen intrathorakalen Druck angetrieben, der während der Inhalation erzeugt wird¹. Bei der traditionellen Gewinnung von Biopsien und der Vorbereitung von Lungenproben für die Bildgebung geht der Unterdruckgradient verloren, was zum Kollaps der Atemwege und des Gefäßsystems führt, das sich nicht mehr in seinem gegenwärtigen Zustand darstellt. Um realistische Bilder zu erhalten, die die aktuellen Bedingungen widerspiegeln, müssen die Lungenatemwege wieder aufgepumpt und das Gefäßsystem perfundiert werden, wodurch die dynamische Lunge in eine statische Vorrichtung umgewandelt wird. Die Anwendung dieser unterschiedlichen Techniken ermöglicht die Erhaltung der strukturellen Integrität, des Lungengefäßsystems und der zellulären Komponenten, einschließlich Immunzellen wie Makrophagen, so dass das Lungengewebe so nah wie möglich an seinem physiologischen Zustand betrachtet werden kann.

Precision Cut Lung Slicing (PCLS) ist ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Anatomie und Physiologie des Lungengefäßsystems². PCLS ermöglicht eine detaillierte Bildgebung des Lungengewebes in drei Dimensionen unter Beibehaltung struktureller und zellulärer Komponenten. PCLS wurde in Tier- und Humanmodellen verwendet, um hochauflösende Live-Bilder von Zellfunktionen in drei Dimensionen zu ermöglichen, was es zu einem idealen Werkzeug macht, um potenzielle therapeutische Ziele zu untersuchen, kleine Atemwegskontraktionen zu messen und die Pathophysiologie chronischer Lungenerkrankungen wie COPD, ILD und Lungenkrebs zu untersuchen³. Mit ähnlichen Techniken kann die Exposition von PCLS-Proben gegenüber Vasokonstriktoren die Lungenstruktur und die Gefäßkontraktilität erhalten und In-vitro-Bedingungen replizieren. Neben der Erhaltung der Kontraktilität können vorbereitete Proben bei korrekter Vorbereitung zusätzlichen Analysen wie RNA-Sequenzierung, Western Blot und Durchflusszytometrie unterzogen werden. Schließlich können reporterfarben markierte Zellen, die nach der Lungenernte mit tdTomato-Fluoreszenz markiert sind, die Markierung nach der Herstellung von Mikroläusen beibehalten, was sie ideal für Zell-Tracking-Studien macht. Die Integration dieser Techniken liefert ein ausgeklügeltes Modell, das die räumliche Anordnung von Zellen und Gefäßkontraktilität bewahrt und zu einem detaillierteren Verständnis der Signalkaskaden und möglichen therapeutischen Optionen bei pulmonalen Gefäßerkrankungen führen kann.

In diesem Manuskript wird PCLS murines Lungengewebe Vasokonstriktoren ausgesetzt, was eine erhaltene strukturelle Integrität und Gefäßkontraktilität zeigt. Die Studie zeigt, dass das entsprechend zubereitete und behandelte Gewebe 10 Tage lang lebensfähig bleiben kann. Die Studie zeigt auch die Erhaltung von Zellen mit endogener Fluoreszenz (tdTomato), so dass Proben hochauflösende Bilder des Lungengefäßsystems und der Architektur liefern können. Schließlich wurden Möglichkeiten zur Handhabung und Vorbereitung von Gewebeschnitten für die RNA-Messung und Western Blot zur Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen beschrieben.

Protokoll

Die gesamte Tierpflege entsprach den Richtlinien des Boston Children's Hospital und den vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Protokollen. Die in dieser Studie verwendeten Mäuse sind Wildtyp C57/B6 Mäuse und Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato gekreuzte Mäuse.

1. Herstellung von Lösungen

1. Bereiten Sie die während des Experiments erforderliche Phosphatpufferlösung (1x PBS) und 2% ige Agaroselösung im Voraus vor.
   1. Mischen Sie 2 g Agarosepulver in 100 ml autoklaviertes Wasser. Erhitzen Sie es in der Mikrowelle einige Sekunden am Stück, bis die Lösung klar ist.
   2. Die Lösung bis zum Gebrauch in ein Wasserbad bei 42 °C geben.
      HINWEIS: Sowohl PBS als auch 2% Agarose können wochenlang bei Raumtemperatur gelagert werden.

2. Extraktion der Mauslunge

1. Die Maus wird durch Überdosierung von Isofluran eingeschläfert. Erreichen Sie eine Überdosierung von Isofluran, indem Sie eine kleine Menge Isofluran auf Seidenpapier in der unteren Ebene und die Maus in der oberen Ebene in einem Exsikkator platzieren. Die Maus bleibt im Exsikkator, bis sie bewusstlos ist.
2. Stellen Sie den Tod der Maus sicher, indem Sie minderwertigen Druck auf den Hals ausüben und kaudal am Schwanz ziehen. Bringen Sie die Maus auf die Sezierfläche.
3. Legen Sie die Maus in Rückenlage und befestigen Sie sie mit Klebeband an Ihren Platz, indem Sie Pfoten und Nase mit Klebeband an den Tisch kleben.
4. Besprühen Sie die ventrale Oberfläche der Maus mit 70% Ethanol und wischen Sie das überschüssige Ethanol ab.
5. Heben Sie die Bauchhaut der Maus mit einer Pinzette an der Stelle der Blase an und schneiden Sie an der Mittellinie mit einer chirurgischen Schere, bewegen Sie sich überlegen zur Zervixregion und legen Sie die Luftröhre frei.
6. Heben Sie die darunter liegende Faszienschicht mit einer Pinzette an und schneiden Sie sie mit einer chirurgischen Schere, um viszerale Organe und mediastinales Kompartiment freizulegen, und schneiden Sie wiederum minderwertig bis überlegen.
7. Schneiden Sie das Brustbein an der Mittellinie ab, um das Herz und die Lunge freizulegen.
8. Lösen Sie das Zwerchfell mit stumpfer Dissektion von der Leber und dem Bauchkompartiment.
9. Lokalisieren Sie die untere Hohlvene (IVC) unter dem Darm und schneiden Sie die IVC.
10. Suchen Sie den rechten Ventrikel.
    HINWEIS: Der rechte Ventrikel hat im Vergleich zum linken Ventrikel ein helleres Aussehen und die intraventrikuläre Septum sollte visualisiert werden, wobei der rechte Ventrikel vom linken Ventrikel getrennt wird.
11. Injizieren Sie 0,5 ml 1% fraktioniertes Heparin mit einer 25-30 G Schmetterlingsnadel in den rechten Ventrikel und spülen Sie dann langsam, aber stetig mit 10-15 ml 1x PBS (Abbildung 1A).
    1. Seien Sie vorsichtig, die Nadel nicht durch das Herz einzuführen und Heparin in die Mediastinale Höhle zu injizieren.
       HINWEIS: Die Injektion von 1x PBS macht das Lungengewebe weiß. Die aus der Bauchaorta extravasierende Flüssigkeit sollte klar und farblos sein und die Leber kann nach erfolgreicher Spülung weiß werden.
12. Lokalisieren Sie den Kehlkopf und sezieren Sie die umgebenden Faszien und das Gewebe mit einer stumpfen Spitzenpinzette.
13. Legen Sie die chirurgische Naht unter die Luftröhre und binden Sie locker einen chirurgischen Knoten.
14. Legen Sie ein kleines Loch in die Luftröhre oberhalb der Schnur und kanulieren Sie mit 20 G stumpfer Nadel.
15. Ziehen Sie die Naht um die Nadel und die Luftröhre mit einem chirurgischen Knoten fest.
16. Injizieren Sie 2,5-4 ml Agarose in die Luftröhre und überwachen Sie die Inflation der Lunge.
17. Nachdem Agarose eingeträufelt wurde, gießen Sie kalte, gekühlte 1x PBS über die Lunge, um Agarose zu verfestigen.
18. Schneiden Sie die Luftröhre der chirurgischen Naht überlegen und sezieren Sie die Lunge und das Herz vom Mediastinum, indem Sie Alle Adhäsionen und Faszien entfernen.
19. Nach der Erstarrung 1x DMEM (genug, um Gewebe einzutauchen) in eine Petrischale geben, um sie auf Eis zu halten. Schneiden Sie sofort einen Lappen mit einer Vibratommaschine in Scheiben (Abbildung 1B).

3. Präzisionsgeschnittene Lungenscheiben

1. Befestigen Sie die Probe mit Sekundenkleber an der Plattform und halten Sie die mediale Seite der Probe nach oben gerichtet.
2. Füllen Sie den Probenbehälter mit 1x PBS, um sicherzustellen, dass die Probe vollständig untergetaucht ist.
3. Füllen Sie den Behälter, der den Probenbehälter umgibt, mit Eis, um das umgebende PBS und die Probe kalt zu halten.
4. Schalten Sie das Vibratom ein und stellen Sie sich auf die gewünschten Einstellungen unten ein.
   1. Stellen Sie die Dicke auf 300um ein.
   2. Stellen Sie die Frequenz auf 100 Hz ein.
   3. Stellen Sie die Amplitude auf 0,6 mm ein.
   4. Stellen Sie die Geschwindigkeit auf 5 μm/s ein.
5. Drehen Sie den Klingenhalter mit einem Inbusschlüssel in die sichere Position und öffnen Sie die Backen, um eine Klinge einzuführen.
6. Ziehen Sie die Backen mit einem Inbusschlüssel fest und drehen Sie den Klingenhalter in die richtige Position zum Schneiden.
7. Legen Sie die Probe und die Plattform auf die Box und schieben Sie sie vor die Klinge.
8. Füllen Sie die Box um die Probenplattform mit 1x PBS, bis die Probe untergetaucht ist.
9. Bringen Sie die Vibrationsklinge an den Rand des Blocks und senken Sie die Klinge manuell ab, bis sie sich mit der Oberseite der Probe befindet.
10. Bestätigen Sie die entsprechenden Einstellungen, und führen Sie das Vibratom aus (Abbildung 2).
11. Wenn frische Scheiben geschnitten werden, entfernen Sie die Proben aus dem PBS und legen Sie sie in eine sterile Petrischale mit 10 ml 1x DMEM, die 1x Antibiotikum-Antimykotikum enthält.
12. Wenn Sie fertig sind, ziehen Sie die Klinge vollständig zurück und verwenden Sie dann den Inbusschlüssel, um die Klinge in eine sichere Position zu bringen.
13. Lagern Sie die Proben in 1x DMEM in einem Inkubator bei 37 °C, wobei die Lebensfähigkeit bis zu 10 Tage erhalten bleibt (siehe Lebensfähigkeitsexperiment unten).

4. Beispiel vasokonstriktorisches Experiment

1. Legen Sie eine Vibratomscheibe auf einen Objektträger.
2. Bevor Sie es auf den Objektträger legen, verwenden Sie ein Reinigungstuch, um das überschüssige Medium (PBS) loszuwerden.
3. Legen Sie die Probe unter Phasenkontrastmikroskopie und verwenden Sie eine 10-20-fache Vergrößerung, um ein Gefäß zu identifizieren.
4. Setzen Sie 500 μL Vasokonstriktoren wie 60 mM KCl oder 1 μM Endothelin-1 ein, um den Objektträger vollständig einzutauchen.
5. Beobachten und erfassen Sie das Video durch Aufnahme für 30 s-60 s (Video 1).

5. Vorbereitung des Gewebes für die RNA- oder Proteinlyse auf PCLS

1. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, füllen Sie eine kleine Polystyrolschaumbox mit 1 L flüssigem Stickstoff.
2. Legen Sie zwei kleine Mikrozentrifugenröhrchen (1,5 ml) vor dem Start in den Behälter mit flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: Flüssiger Stickstoff sollte außerhalb der Röhrchen abkühlen, jedoch nicht im Inneren. Achten Sie darauf, mit flüssigem Stickstoff vorsichtig umzugehen und setzen Sie die Haut keinem flüssigen Stickstoff aus. Verwenden Sie eine Pinzette und Handschuhe, um die Schläuche aus der Box zu legen und zu entfernen.
3. 4-5 frische Vibratomscheiben in eine Mörserschüssel geben.
4. Gießen Sie 5-10 ml flüssiges N2 auf die Scheiben in der Mörtelschüssel.
5. Verwenden Sie den Stößel schnell, um die Schockfrostscheiben zu Pulver zu mahlen, bevor flüssiger Stickstoff verdunstet.
   HINWEIS: Gewebe sollte zu einem feinen Pulver kondensieren. Wenn nicht, fügen Sie zusätzlichen flüssigen Stickstoff hinzu, bis dies erreicht ist.
6. Mit einem Laborlöffel aus Stahl (mit flüssigem Stickstoff vorgekühlt) wird das Pulver in die beiden gekühlten Mikrozentrifugenröhrchen geschüttelt.
7. Lyse des Pulvers durch Zugabe von 500 μL RNA-Extraktionsreagenz, um mit der RNA-Isolierung fortzufahren, oder 500 μL RIPA-Puffer (enthält 1x Proteaseinhibitoren), um mit der Proteinlyse fortzufahren.
8. Lagern Sie die Proben bei -80 °C bis zur zusätzlichen RNA-Isolierung, BCA-Messung und Western Blot.

6. Feststellung der Rentabilität

1. Nach der Vibratomvorbereitung legen Sie zwei Lungenscheiben in eine 24-Well-Kulturplatte mit 450 μL DMEM-Medien und 50 μL Zelllebensfähigkeitsreagenz (stellen Sie sicher, dass das Gewebe vollständig eingetaucht ist).
2. Legen Sie die Proben über Nacht wieder in 5% CO₂ bei 37 °C Inkubator mit minimaler Lichteinwirkung.
3. Beobachten Sie am Morgen die Lösung für Farbveränderungen. Die blaue Lösung wird rosa, wenn das Gewebe lebensfähig ist.

7. Erhalt der Zellkennzeichnung

1. Behandeln Sie eine transgene Cdh5-CreERT2, die mit Ai14 tdTomato Maus gekreuzt wurde, mit einer IP-Injektion von Tamoxifen (2 mg/Tag) für insgesamt 5 Tage (Gesamtdosis 10 mg Tamoxifen), um tdTomato Label Cre-positive Zellen zu induzieren.
2. Bereiten Sie eine Woche nach der Injektion die Lunge mit den oben genannten Schritten 1 bis 3 vor.
3. Legen Sie nach der Vorbereitung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe das Gewebe auf einen Objektträger und legen Sie einen Deckglas auf das Gewebe.
4. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um tdTomato-Färbung zu erkennen (unter Verwendung der Anregungswellenlänge 555 nm).

Ergebnisse

Wenn es zu Zellen oder Gewebe hinzugefügt wird, wird das Lebensfähigkeitsreagenz durch die reduzierende Umgebung von lebensfähigem Gewebe modifiziert und färbt sich rosa / rot, wodurch es stark fluoreszierend wird. Die repräsentativen Farbveränderungen, die ab Tag 0-1 und Tag 9-10 festgestellt wurden, sind in Abbildung 3 dargestellt. Wie bereits erwähnt, begann die Lösung blau und wurde über Nacht rosa, was die Lebensfähigkeit demonstrierte. Farbänderungen treten typischerweise in...

Diskussion

In diesem Manuskript wird eine verbesserte Methode zur Herstellung hochauflösender Bilder von murinem Lungengewebe beschrieben, die die Gefäßstruktur bewahrt und die experimentelle Flexibilität optimiert, insbesondere unter Verwendung der Anwendung von PCLS, um Mikroläuse aus Lungengewebe zu erhalten, die dreidimensional mit erhaltener Kontraktilität des Gefäßsystems betrachtet werden können. Unter Verwendung des Lebensfähigkeitsreagenzes zeigt das Protokoll, dass sorgfältig vorbereitete und konservierte Schei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G