精密切肺切片作为 离体 肺血管结构和收缩力研究的有效工具

摘要

这里介绍的是用于保存PCLS小鼠肺组织的血管收缩力的方案，从而产生肺脉管系统和气道的复杂三维图像，可以保存长达10天，容易受到许多程序的影响。

摘要

鼠肺组织的可视化提供了有关潜在气道和脉管系统的有价值的结构和细胞信息。然而，真正代表生理状况的肺血管的保存仍然存在挑战。此外，鼠肺的精细配置导致技术挑战，为保留细胞组成和结构的高质量图像制备样品。类似地，可以进行细胞收缩力测定来研究细胞 在体外对血管收缩剂作出反应的潜力，但这些测定不能再现完整肺的复杂环境。与这些技术问题相反，精确切割肺切片（PCLS）方法可以作为一种有效的替代方案，在没有区域偏倚的情况下以三维方式可视化肺组织，并作为长达10天的实时替代收缩力模型。使用PCLS制备的组织保留了结构和空间取向，使其成为 离体研究疾病过程的理想选择。从诱导的tdTomato报告小鼠模型中收获的PCLS中内源性tdTomato标记细胞的位置可以通过共聚焦显微镜成功可视化。暴露于血管收缩剂后，PCLS显示出血管收缩性和肺结构的保存，这可以通过延时模块捕获。结合其他程序，如蛋白质印迹和RNA分析，PCLS有助于全面了解各种疾病背后的信号级联反应，并导致更好地理解肺血管疾病的病理生理学。

引言

在不牺牲解剖结构的情况下保留细胞成分的肺组织的制备和成像的进步提供了对肺部疾病的详细了解。在保持生理结构的同时识别蛋白质，RNA和其他生物化合物的能力提供了有关细胞空间排列的重要信息，可以拓宽对许多肺部疾病的病理生理学的理解。当应用于动物模型时，这些详细的图像可以导致对肺血管疾病（如肺动脉高血压）的更好理解，从而可能导致治疗策略的改进。

尽管技术进步，但获得小鼠肺组织的高质量图像仍然是一个挑战。呼吸周期由吸入期间产生的负胸内压驱动¹。传统上，当获得活检并准备肺部样本进行成像时，负压梯度丢失，导致气道和脉管系统塌陷，不再代表自身的当前状态。为了获得反映当前状况的真实图像，必须重新充气肺气道，并灌注脉管系统，将动态肺变成静态夹具。这些不同技术的应用可以保持结构完整性，肺脉管系统和细胞成分，包括免疫细胞，如巨噬细胞，允许将肺组织视为尽可能接近其生理状态。

精密切肺切片（PCLS）是研究肺血管系统解剖学和生理学^{的理想工具2}。PCLS提供三维肺组织的详细成像，同时保留结构和细胞成分。PCLS已被用于动物和人类模型中，以允许在三维空间中提供细胞功能的实时高分辨率图像，使其成为研究潜在治疗靶点，测量小气道收缩和研究慢性肺部疾病（如COPD，ILD和肺癌）的病理生理学的理想工具^3。使用类似的技术，PCLS样品暴露于血管收缩剂可以保持肺结构和血管收缩性，复制 体外 条件。除了保持收缩性外，制备的样品在正确制备时还可以进行额外的分析，例如RNA测序，蛋白质印迹和流式细胞术。最后，在肺部收获后用tdTomato荧光标记的报告色标记细胞可以在制备微切片后保留标记，使其成为细胞追踪研究的理想选择。这些技术的整合提供了一个复杂的模型，保留了细胞的空间排列和血管收缩力，可以更详细地了解肺脉管系统疾病的信号级联反应和潜在的治疗方案。

在这份手稿中，PCLS小鼠肺组织暴露于血管收缩剂，显示出保留的结构完整性和血管收缩性。该研究表明，适当准备和处理的组织可以保持活力10天。该研究还证明了用内源性荧光（tdTomato）保存细胞，允许样品提供肺脉管系统和结构的高分辨率图像。最后，已经描述了处理和制备用于RNA测量的组织切片和蛋白质印迹以研究潜在机制的方法。

研究方案

所有动物护理均符合波士顿儿童医院的指导方针和机构动物护理和使用委员会批准的协议。本研究中使用的小鼠是野生型C57 / B6小鼠和Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato杂交小鼠。

1. 溶液的制备

1. 提前准备实验期间所需的磷酸盐缓冲溶液（1x PBS）和2%琼脂糖溶液。
   1. 将 2 克琼脂糖粉混合到 100 mL 高压灭菌水中。在微波炉中加热几秒钟，直到溶液变清。
   2. 将溶液置于42°C的水浴中直至使用。
      注意:PBS和2%琼脂糖都可以在室温下储存数周。

2. 提取小鼠肺

1. 通过异氟醚过量对小鼠实施安乐死。通过将少量异氟醚放在下层的薄纸上并将小鼠置于干燥器的上层，实现异氟醚过量。小鼠留在干燥器中，直到失去知觉。
2. 通过对颈部施加下压并拉动尾巴上的尾部来确保小鼠死亡。将鼠标带到解剖表面。
3. 将鼠标置于仰卧位置，并用胶带将其固定到位，用胶带将爪子和鼻子固定在桌子上。
4. 用70%乙醇喷洒小鼠的腹侧表面，擦去多余的乙醇。
5. 在膀胱的位置用镊子抬起小鼠的腹部皮肤，用手术剪刀在中线切割，向上移动到颈部区域，暴露气管。
6. 用镊子提起下面的筋膜层，用手术剪刀切开，露出内脏器官和纵隔室，再次从下切到上切。
7. 切开中线的胸骨，露出心脏和肺部。
8. 使用钝性解剖，将隔膜从肝脏和腹部隔室分离。
9. 在肠道下方找到下腔静脉（IVC）并切除IVC。
10. 找到右心室。
    注意:与左心室相比，右心室外观较轻，应可视化脑室内隔，将右心室与左心室分开。
11. 用25-30 G蝶针将0.5mL的1%分馏肝素注射到右心室，然后用10-15mL的1x PBS缓慢而稳定地冲洗（图1A）。
    1. 注意不要将针头插入心脏并将肝素注射到纵隔腔中。
       注意:注射1x PBS会使肺组织变白。从腹主动脉渗出的液体应该是清澈无色的，冲洗成功后肝脏可能会变白。
12. 定位喉部，并使用钝头镊子解剖周围的筋膜和组织。
13. 将手术缝合线放在气管下方，松松地打结。
14. 在气管上放一个高于绳子的小孔，并用20 G钝头针管。
15. 使用手术结收紧针头和气管周围的缝合线。
16. 将2.5-4毫升琼脂糖注射到气管中，并监测肺部充气。
17. 灌注琼脂糖后，将冷的，冷却的1x PBS倒在肺部以凝固琼脂糖。
18. 切除手术缝合线上的气管，并通过去除任何粘连和筋膜将肺和心脏从纵隔上解剖。
19. 凝固后，放入1x DMEM（足以浸没组织）放入培养皿中以保持在冰上。立即使用振动筛机切开一个叶片（图1B）。

3. 精密切肺切片

1. 用超胶将样品附着在平台上，使样品的内侧朝上。
2. 用1x PBS填充样品容器，确保样品完全浸没。
3. 用冰填充样品容器周围的容器，以保持周围的PBS和样品冷却。
4. 打开振动器并调整到下面的所需设置。
   1. 将厚度设置为 300um。
   2. 将频率设置为 100 Hz。
   3. 将振幅设置为 0.6 mm。
   4. 将速度设置为 5 μm/s。
5. 使用内六角扳手，将刀片架转到安全位置，然后打开钳口插入刀片。
6. 用内六角扳手拧紧钳口，并将刀片架旋转到适当的位置以进行切片。
7. 将样品和平台放在盒子上，然后在刀片前滑动。
8. 用 1 个 PBS 填充样品平台周围的盒子，直到样品浸没。
9. 将振动片向上移动到块的边缘，然后手动降低刀片，直到它与样品顶部均匀。
10. 确认适当的设置并运行振动切片机（图2）。
11. 当切开新鲜切片时，从PBS中取出样品，并将其放入含有1x抗生素 - 抗真菌剂的10 mL 1x DMEM的无菌培养皿中。
12. 完成后，将刀片完全缩回，然后使用内六角扳手将刀片抬高到安全位置。
13. 将样品储存在37°C的培养箱中的1x DMEM中，存活期长达10天（见下面的活度实验）。

4. 血管收缩剂实验示例

1. 将振动切片片放在显微镜载玻片上。
2. 在将其放在载玻片上之前，请使用清洁湿巾清除多余的介质（PBS）。
3. 将样品置于相差显微镜下，并使用10-20倍放大倍率鉴定容器。
4. 放入500μL血管收缩剂，如60mM KCl或1μM内皮素-1以完全浸没载玻片。
5. 通过录制30 s-60 s观察并捕获视频（视频1）。

5. 在PCLS上为RNA或蛋白质裂解准备组织

1. 在开始实验之前，用1L液氮填充一个小的聚苯乙烯泡沫盒。
2. 在开始之前，将两个小的微量离心管（1.5 mL）放入装有液氮的容器中。
   注意:液氮应在管外冷却，但不要在管内。一定要小心处理液氮，不要将皮肤暴露在液氮中。使用镊子和手套从盒子中放置和取出管子。
3. 将4-5片新鲜的振动切片放入砂浆碗中。
4. 将5-10毫升液体N2倒在砂浆碗中的切片上。
5. 在液氮蒸发之前，快速使用杵将速冻切片研磨成粉末。
   注意:组织应凝结成细粉。如果没有，请添加额外的液氮，直到达到。
6. 使用钢制实验室铲斗机（用液氮预冷），将粉末舀入两个冷冻的微量离心管中。
7. 通过加入500μLRNA提取试剂进行RNA分离或500μL RIPA缓冲液（含有1x蛋白酶抑制剂）进行蛋白质裂解来裂解粉末。
8. 将样品储存在-80°C，直到额外的RNA分离，BCA测量和蛋白质印迹。

6. 确定可行性

1. 振动切片机制备后，将两个肺切片放入装有450μLDMEM培养基和50μL细胞活力试剂的24孔培养板中（确保组织完全浸没）。
2. 将样品放回37°C培养箱中的5%CO₂ 中过夜，并尽量减少光照。
3. 早上，观察溶液的颜色变化。当组织可行时，蓝色溶液变成粉红色。

7. 细胞标记的保存

1. 用他莫昔芬（2mg /天）的IP注射治疗与Ai14 tdTomato小鼠杂交的转基因Cdh5-CreERT2，共5天（总剂量10mg他莫昔芬）以诱导tdTomato标签Cre阳性细胞。
2. 注射后一周，使用上述步骤1至3准备肺部。
3. 在制备精密切割的肺切片后，将组织放在显微镜载玻片上，并在组织顶部放置盖玻片。
4. 使用共聚焦显微镜检测tdTomato染色（使用激发波长555nm）。

结果

当添加到细胞或组织中时，活力试剂被活组织的还原环境修饰并变成粉红色/红色，变得高度荧光。 图3显示了从第0-1天和第9-10天检测到的代表性颜色变化。如前所述，溶液在一夜之间开始变为蓝色并变成粉红色，显示出可行性。颜色变化通常发生在1-4小时内;但是，可能需要更长的时间。为了测定活力，使用读板器测定振动切片机制备的样品和4%PFA固定肺切片的吸光度，作为...

讨论

在这份手稿中，描述了一种增强的方法，以产生高分辨率的小鼠肺组织图像，该图像保留了血管结构并优化了实验灵活性，特别是使用PCLS的应用来获得可以在三维空间中观察的肺组织微切片，并保留脉管系统的收缩力。使用活性试剂，该方案表明，精心准备和保存的切片可以保持活力超过一周。微切片的存活力得以在脉管系统和气道结构上进行多次和长时间的实验，使其成为测试多种药物 的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G