精密切肺切片作为 离体 肺血管结构和收缩力研究的有效工具

摘要

这里介绍的是用于保存PCLS小鼠肺组织的血管收缩力的方案，从而产生肺脉管系统和气道的复杂三维图像，可以保存长达10天，容易受到许多程序的影响。

摘要

鼠肺组织的可视化提供了有关潜在气道和脉管系统的有价值的结构和细胞信息。然而，真正代表生理状况的肺血管的保存仍然存在挑战。此外，鼠肺的精细配置导致技术挑战，为保留细胞组成和结构的高质量图像制备样品。类似地，可以进行细胞收缩力测定来研究细胞 在体外对血管收缩剂作出反应的潜力，但这些测定不能再现完整肺的复杂环境。与这些技术问题相反，精确切割肺切片（PCLS）方法可以作为一种有效的替代方案，在没有区域偏倚的情况下以三维方式可视化肺组织，并作为长达10天的实时替代收缩力模型。使用PCLS制备的组织保留了结构和空间取向，使其成为 离体研究疾病过程的理想选择。从诱导的tdTomato报告小鼠模型中收获的PCLS中内源性tdTomato标记细胞的位置可以通过共聚焦显微镜成功可视化。暴露于血管收缩剂后，PCLS显示出血管收缩性和肺结构的保存，这可以通过延时模块捕获。结合其他程序，如蛋白质印迹和RNA分析，PCLS有助于全面了解各种疾病背后的信号级联反应，并导致更好地理解肺血管疾病的病理生理学。

引言

在不牺牲解剖结构的情况下保留细胞成分的肺组织的制备和成像的进步提供了对肺部疾病的详细了解。在保持生理结构的同时识别蛋白质，RNA和其他生物化合物的能力提供了有关细胞空间排列的重要信息，可以拓宽对许多肺部疾病的病理生理学的理解。当应用于动物模型时，这些详细的图像可以导致对肺血管疾病（如肺动脉高血压）的更好理解，从而可能导致治疗策略的改进。

尽管技术进步，但获得小鼠肺组织的高质量图像仍然是一个挑战。呼吸周期由吸入期间产生的负胸内压驱动¹。传统上，当获得活检并准备肺部样本进行成像时，负压梯度丢失，导致气道和脉管系统塌陷，不再代表自身的当前状态。为了获得反映当前状况的真实图像，必须重新充气肺气道，并灌注脉管系统，将动态肺变成静态夹具。这些不同技术的应用可以保持结构完整性，肺脉管系统和细胞成分，包括免疫细胞，如巨噬细胞，允许将肺组织视为尽可能接近其生理状态。

精密切肺切片（PCLS）是研究肺血管系统解剖学和生理学^{的理想工具2}。PCLS提供三维肺组织的详细成像，同时保留结构和细胞成分。PCLS已被用于动物和人类模型中，以允许在三维空间中提供细胞功能的实时高分辨率图像，使其成为研究潜在治疗靶点，测量小气道收缩和研究慢性肺部疾病（如COPD，ILD和肺癌）的病理生理学的理想工具^3。使用类似的技术....

研究方案

所有动物护理均符合波士顿儿童医院的指导方针和机构动物护理和使用委员会批准的协议。本研究中使用的小鼠是野生型C57 / B6小鼠和Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato杂交小鼠。

1. 溶液的制备

1. 提前准备实验期间所需的磷酸盐缓冲溶液（1x PBS）和2%琼脂糖溶液。
   1. 将 2 克琼脂糖粉混合到 100 mL 高压灭菌水中。在微波炉中加热几秒钟，直到溶液变清。
   2. 将溶液置于42°C的水浴中直至使用。
      注意：PBS和2%琼脂糖都可以在室温下储存数周。

2. 提取小鼠肺

1. 通过异氟醚过量对小鼠实施安乐死。通过将少量异氟醚放在下层的薄纸上并将小鼠置于干燥器的上层，实现异氟醚过量。小鼠留在干燥器中，直到失去知觉。
2. 通过对颈部施加下压并拉动尾巴上的尾部来确保小鼠死亡。将鼠标带到解剖表面。
3. 将鼠标置于仰卧位置，并用胶带将其固定到位，用胶带将爪子和鼻子固定在桌子上。
4. 用70%乙醇喷洒小鼠的腹侧表面，擦去多余的乙醇。
5. 在膀胱的位置用镊子抬起小鼠的腹部皮肤，用手术剪刀在中线切割，向上移动到颈部区域，暴露气管。
6. 用镊子提起下面的筋膜层，用手术剪刀切开，露出内脏器官和纵隔室，再次从下切到上切。
7. ....

结果

当添加到细胞或组织中时，活力试剂被活组织的还原环境修饰并变成粉红色/红色，变得高度荧光。 图3显示了从第0-1天和第9-10天检测到的代表性颜色变化。如前所述，溶液在一夜之间开始变为蓝色并变成粉红色，显示出可行性。颜色变化通常发生在1-4小时内;但是，可能需要更长的时间。为了测定活力，使用读板器测定振动切片机制备的样品和4%PFA固定肺切片的吸光度，作为.......

讨论

在这份手稿中，描述了一种增强的方法，以产生高分辨率的小鼠肺组织图像，该图像保留了血管结构并优化了实验灵活性，特别是使用PCLS的应用来获得可以在三维空间中观察的肺组织微切片，并保留脉管系统的收缩力。使用活性试剂，该方案表明，精心准备和保存的切片可以保持活力超过一周。微切片的存活力得以在脉管系统和气道结构上进行多次和长时间的实验，使其成为测试多种药物 的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G