Ex vivo Pulmoner Damar Yapısı ve Kontritite Çalışmaları İçin Verimli Bir Araç Olarak Hassas Kesim Akciğer Dilimleri

Özet

Burada sunulan PCLS murine akciğer dokusunun damar kontrititesini korumak için bir protokoldür, bu da pulmoner vaskülat ve hava yolunun sofistike bir üç boyutlu görüntüsü ile sonuçlanır, bu da çok sayıda prosedüre duyarlı 10 güne kadar korunabilir.

Özet

Murine akciğer dokusunun görselleştirilmesi, alttaki hava yolu ve vaskülat ile ilgili değerli yapısal ve hücresel bilgiler sağlar. Bununla birlikte, fizyolojik koşulları gerçekten temsil eden pulmoner damarların korunması hala zorluklar ortaya koyuyor. Ek olarak, murine akciğerlerinin hassas konfigürasyonu, hem hücresel kompozisyonu hem de mimariyi koruyan yüksek kaliteli görüntüler için numuneler hazırlamakta teknik zorluklarla sonuçlanır. Benzer şekilde, hücresel kontritite tahlilleri, hücrelerin vazokonstriktörlere in vitroyanıt verme potansiyelini incelemek için yapılabilir, ancak bu tahliller sağlam akciğerin karmaşık ortamını yeniden üretmez. Bu teknik konuların aksine hassas kesimli akciğer dilimi (PCLS) yöntemi, akciğer dokusunu bölgesel önyargı olmadan üç boyutlu olarak görselleştirmek için etkili bir alternatif olarak uygulanabilir ve 10 güne kadar canlı vekil kontritite modeli olarak hizmet vermektedir. PCLS kullanılarak hazırlanan doku, yapıyı ve mekansal yönelimi korumuştur, bu da hastalık süreçlerinin eks vivoincelenmesini ideal hale getirir. Endojen tdTomato etiketli hücrelerin, indüklenebilir bir tdTomato muhabir murine modelinden elde edilen PCLS'deki konumu konfokal mikroskopi ile başarıyla görselleştirilebilir. Vazokonstriktörlere maruz kalındıktan sonra PCLS, hem damar kontrititesinin hem de zaman atlamalı bir modül tarafından yakalanabilen akciğer yapısının korunmasını gösterir. Batı blot ve RNA analizi gibi diğer prosedürlerle birlikte PCLS, çok çeşitli bozuklukların altında yatan ve pulmoner vasküler hastalıklarda patofizyolojinin daha iyi anlaşılmasına yol açan sinyal basamaklarının kapsamlı bir şekilde anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Giriş

Anatomik yapıdan ödün vermeden hücresel bileşenleri koruyan akciğer dokusunun hazırlanması ve görüntülenmesinde meydana gelen gelişmeler pulmoner hastalıkların ayrıntılı bir şekilde anlaşılmasını sağlar. Fizyolojik yapıyı korurken proteinleri, RNA'yı ve diğer biyolojik bileşikleri tanımlama yeteneği, çok sayıda pulmoner hastalıkta patofizyolojinin anlaşılmasını genişletebilecek hücrelerin mekansal düzeni hakkında hayati bilgiler sunar. Bu ayrıntılı görüntüler, hayvan modellerine uygulandığında pulmoner arter hipertansiyonu gibi pulmoner vasküler hastalıkların daha iyi anlaşılmasına yol açabilir ve potansiyel olarak iyileştirilmiş terapötik stratejilere yol açabilir.

Teknolojideki gelişmelere rağmen, murine akciğer dokusunun yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek zor olmaya devam ediyor. Solunum döngüsü, inhalasyon sırasında oluşan negatif intratorasik basınç tarafından tahrik edilir¹. Geleneksel olarak biyopsiler elde edilirken ve akciğer örnekleri görüntüleme için hazırlanırken, negatif basınç gradyanı kaybolur ve bu da artık mevcut durumunda kendini temsil eden hava yolu ve vaskülatın çökmesine neden olabilir. Mevcut koşulları yansıtan gerçekçi görüntüler elde etmek için, pulmoner hava yolları yeniden şişirilmeli ve vaskülat perfüzyona maruz kalarak dinamik akciğeri statik bir fikstüre dönüştürmelidir. Bu farklı tekniklerin uygulanması, makrofajlar gibi bağışıklık hücreleri de dahil olmak üzere yapısal bütünlüğün, pulmoner vaskülatın ve hücresel bileşenlerin korunmasına izin vererek akciğer dokusunun fizyolojik durumuna mümkün olduğunca yakın görülmesini sağlar.

Hassas kesim akciğer dilimleme (PCLS), pulmoner vaskülat²anatomisini ve fizyolojisini incelemek için ideal bir araçtır. PCLS, yapısal ve hücresel bileşenleri korurken akciğer dokusunun üç boyutlu olarak ayrıntılı görüntülenmesini sağlar. PCLS, hayvan ve insan modellerinde hücresel fonksiyonların canlı, yüksek çözünürlüklü görüntülerinin üç boyutta kullanılmasına izin vermek için kullanılmıştır, bu da potansiyel terapötik hedefleri incelemek, küçük hava yolu kasılmalarını ölçmek ve KOAH, ILD ve akciğer kanseri gibi kronik akciğer hastalıklarının patofizyolojisini incelemek için ideal bir^{araçtır 3}. Benzer teknikler kullanılarak, PCLS örneklerinin vazokonstriktörlere maruz kalması akciğer yapısını ve damar kontrititesini koruyarak in vitro durumları çoğaltabilir. Sözleşmenin korunmasının yanı sıra, hazırlanan numuneler doğru hazırlandığında RNA dizilimi, Batı lekesi ve akış sitometrisi gibi ek analizlerden geçirilebilir. Son olarak, akciğer hasadından sonra tdTomato floresan ile işaretlenmiş muhabir renk etiketli hücreler, mikroslikler hazırladıktan sonra etiketlemeyi koruyabilir ve bu da hücre izleme çalışmaları için idealdir. Bu tekniklerin entegrasyonu, pulmoner vaskülür hastalığında sinyal basamaklarının ve potansiyel terapötik seçeneklerin daha ayrıntılı anlaşılmasına yol açabilecek hücrelerin mekansal düzenini ve damar kontrtinazlığını koruyan sofistike bir model sağlar.

Bu yazıda PCLS murine akciğer dokusu vasokonstriktörlere maruz kalarak korunmuş yapısal bütünlük ve damar kontrititesini ortaya koymuştur. Çalışma, uygun şekilde hazırlanan ve ele alınabilen dokunun 10 gün boyunca canlı kalabileceğini göstermektedir. Çalışma ayrıca endojen floresan (tdTomato) ile hücrelerin korunmasını göstererek, örneklerin pulmoner vaskülat ve mimarinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini sağlamasına izin vermektedir. Son olarak, doku dilimlerini RNA ölçümü için ve Batı lekesini alttaki mekanizmaları araştırmak için ele almanın ve hazırlamanın yolları açıklanmıştır.

Protokol

Tüm hayvan bakımı Boston Çocuk Hastanesi'nin yönergelerine uygundu ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokoller. Bu çalışmada kullanılan fareler vahşi tip C57 /B6 fareler ve Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato çapraz farelerdir.

1. Çözümlerin hazırlanması

1. Deney sırasında gerekli olan fosfat tampon çözeltisini (1x PBS) ve% 2 agarose çözeltisini önceden hazırlayın.
   1. 2 g agarose tozunun 100 mL otomatik kapatılmış suya karıştırılması. Çözelti net olana kadar mikrodalga fırında birkaç saniye ısıtın.
   2. Çözeltiyi kullanıma kadar 42 °C'de bir su banyosuna yerleştirin.
      NOT: Hem PBS hem de %2 agarose haftalarca oda sıcaklığında saklanabilir.

2. Fare akciğerinin çıkarılması

1. Fareyi aşırı dozda izofluran ile ötenazi. Alt seviyedeki kağıt mendile az miktarda izofluran yerleştirerek ve fareyi bir kurutucuda üst seviyeye yerleştirerek izofluran aşırı doz elde edin. Fare, bilinçsiz olana kadar kurutucuda kalır.
2. Boyuna düşük basınç uygulayarak ve kuyruğa kaudal çekerek farenin ölümünü sağlayın. Fareyi diseksiyon yüzeyine getirin.
3. Fareyi supine konumuna getirin ve yapışkan bantla masaya bantlama pençeleri ve burun yerine sabitleyin.
4. Farenin ventral yüzeyine% 70 etanol püskürtün ve fazla etanolleri silin.
5. Farenin karın derisini mesanenin bulunduğu yerde tokmaklarla kaldırın ve orta çizgide cerrahi makasla kesin, servikal bölgeye üstün hareket ederek nefes borusuna maruz kalın.
6. Alttaki fasyal tabakayı cımbızla kaldırın ve visseral organları ve mediastinal bölmeyi ortaya çıkarmak için cerrahi makasla kesin, yine üstünden daha düşük bir şekilde kesin.
7. Kalbi ve akciğeri açığa çıkarmak için orta çizgideki sternumu kesin.
8. Künt diseksiyon kullanarak diyaframı karaciğer ve karın bölmesinden ayırın.
9. Bağırsakların altındaki alt vena kavayı (IVC) bulun ve IVC'yi kesin.
10. Sağ ventrikülü bulun.
    NOT: Sağ ventrikül sol ventriküle göre daha hafif bir görünüme sahip olacak ve sağ ventrikülü sol ventrikülden ayırarak intraventriküler septum görselleştirilmelidir.
11. 25-30 G kelebek iğnesi ile sağ ventrile 0,5 mL%1 fraksiyone heparin enjekte edin ve ardından 1x PBS'nin 10-15 mL'si ile yavaşça ama istikrarlı bir şekilde yıkayın (Şekil 1A).
    1. İğneyi kalpten geçirmemek ve kantinanik boşluğa heparin enjekte etmemek için dikkatli olun.
       NOT: 1x PBS enjeksiyonu akciğer dokusunu beyaza çevirir. Karın aortundan ekstravaze olan sıvı berrak ve renksiz olmalı ve başarılı kızarma sonrası karaciğer görünüşte beyazlaşabilir.
12. Gırtlak bulun ve künt uç cımbız kullanarak çevredeki fasya ve dokuyu parçalara ayrıştırın.
13. Cerrahi dikişi nefes borusunun altına yerleştirin ve gevşek bir şekilde cerrahi bir düğüm bağlayın.
14. Nefes borusuna ip ve 20 G künt uçlu iğne ile kanüleden daha üstün küçük bir delik yerleştirin.
15. Cerrahi bir düğüm kullanarak iğne ve trakea etrafındaki dikişi sıkın.
16. Nefes borusuna 2,5-4 mL agarose enjekte edin ve akciğerin şişirmesini izleyin.
17. Agarose aşılandıktan sonra, agarose katılaştırmak için akciğerin üzerine soğuk, soğutulmuş 1x PBS dökün.
18. Ameliyat dikişinden daha üstün trakeayı kesin ve herhangi bir yapışıklığı ve fasyayı çıkararak akciğeri ve kalbi mediastinyumdan kesin.
19. Katılaşmadan sonra, buzda tutmak için bir Petri kabına 1x DMEM 'e (dokuyu batırmaya yetecek kadar) yerleştirin. Vibratom makinesi kullanarak hemen bir lob dilimleyin(Şekil 1B).

3. Hassas kesilmiş akciğer dilimleri

1. Numuneyi platforma süperglue ile takın ve numunenin medial tarafını yukarı bakacak şekilde tutun.
2. Numune kabını 1x PBS ile doldurun ve numunenin tamamen suya batırılmasını sağlayın.
3. PBS'yi ve numuneyi soğuk tutmak için numune kabını çevreleyen kabı buzla doldurun.
4. Vibratomu açın ve aşağıdaki istenen ayarlara ayarlayın.
   1. Kalınlığı 300um olarak ayarlayın.
   2. Frekansı 100 Hz olarak ayarlayın.
   3. Genliği 0,6 mm olarak ayarlayın.
   4. Hızı 5 μm/s'ye ayarlayın.
5. Bir Allen anahtarı kullanarak, bıçak tutucuyu güvenli konuma getirin ve bir bıçak yerleştirmek için çeneleri açın.
6. Çeneleri bir Allen anahtarı ile sıkın ve bıçak tutucuyu dilimleme için uygun konuma getirin.
7. Örneği ve platformu kutunun üzerine yerleştirin ve bıçağın önüne kaydırın.
8. Örnek platformunun etrafındaki kutuyu, numune suya gömülene kadar 1x PBS ile doldurun.
9. Vibratom bıçağını bloğun kenarına getirin ve bıçağı numunenin üst kısmına gelene kadar manuel olarak diraye diri diri dürt.
10. Uygun ayarları onaylayın ve vibratomu çalıştırın (Şekil 2).
11. Taze dilimler kesildikçe, örnekleri PBS'den çıkarın ve 1x antibiyotik-antimycotic içeren 10 mL 1x DMEM ile steril bir Petri kabına yerleştirin.
12. İşiniz bittiğinde bıçağı tamamen geri çekin ve ardından bıçağı güvenli bir konuma getirmek için Allen anahtarını kullanın.
13. Numuneleri 1x DMEM'de 37 °C'de bir inkübatörde 10 güne kadar korunmuş canlılık ile saklayın (aşağıdaki canlılık deneyine bakın).

4. Örnek vazokonstriktör deneyi

1. Mikroskop slaydına vibratom dilimi yerleştirin.
2. Slayda yerleştirmeden önce, fazla ortamdan (PBS) kurtulmak için bir temizleme mendili kullanın.
3. Numuneyi faz kontrastlı mikroskopinin altına yerleştirin ve bir damarı tanımlamak için 10-20x büyütme kullanın.
4. Slaydı tamamen batırmak için 60 mM KCl veya 1 μM Endothelin-1 gibi 500 μL vazokonstriktör koyun.
5. 30 s-60 sn(Video 1)için kayıt larak videoyu gözlemleyin ve yakalayın.

5. PCLS'de dokuyu RNA veya protein lizizine hazırlamak

1. Deneye başlamadan önce, küçük bir polistiren köpük kutusunu 1 L sıvı azotla doldurun.
2. Başlamadan önce sıvı azotlu kabın içine iki küçük mikrosantrifüj tüpü (1,5 mL) yerleştirin.
   NOT: Sıvı nitrojen tüplerin dışında soğumalı, ancak içeride olmamalıdır. Sıvı nitrojeni dikkatli bir şekilde işlediğinizden ve cildi sıvı nitrojene maruz bırakmadığınızdan emin olun. Kutudan tüpleri yerleştirmek ve çıkarmak için tokmaklar ve eldivenler kullanın.
3. Bir harç kabına 4-5 taze vibratom dilimi yerleştirin.
4. Harç kabındaki dilimlerin üzerine 5-10 mL sıvı N2 dökün.
5. Sıvı azot buharlaşmadan önce flaş dondurma dilimlerini toz haline getirmek için pestle'ı hızla kullanın.
   NOT: Doku ince bir toz halinde yoğunlaşmalıdır. Değilse, elde edilene kadar ek sıvı azot ekleyin.
6. Çelik laboratuvar kepçesi (sıvı nitrojen ile önseçimli) kullanarak, tozu iki soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne kepçeleyin.
7. Protein lizizine devam etmek için RNA izolasyonu veya 500 μL RIPA tamponu (1x proteaz inhibitörleri içerir) ile devam etmek için 500 μL RNA ekstraksiyon reaktifi ekleyerek tozu lyse edin.
8. Ek RNA yalıtımı, BCA ölçümü ve batı lekesi olana kadar numuneleri -80 °C'de saklayın.

6. Canlılığın belirlenmesi

1. Vibratom hazırlığından sonra, iki akciğer dilimini 450 μL DMEM ortamlı ve 50 μL hücre canlılığı reaktifli 24 kuyulu bir kültür plakasına yerleştirin (dokunun tamamen batırıldığından emin olun).
2. Numuneleri ışığa minimum maruz kalarak gece boyunca 37 °C inkübatörde %5 CO_2'ye geri yerleştirin.
3. Sabahları, renk değişimi için çözümü gözlemleyin. Doku uygun olduğunda mavi çözelti pembeye döner.

7. Hücre etiketlemesinin korunması

1. TdTomato etiketi Cre pozitif hücrelerini indük etmek için toplam 5 gün boyunca (toplam doz 10 mg Tamoxifen) TAMOXIFEN (2 mg / gün) IP enjeksiyonu ile Ai14 tdTomato faresi ile çapraz transgenik bir Cdh5-CreERT2 tedavi edin.
2. Enjeksiyondan bir hafta sonra, yukarıdaki 1 ila 3 adımlarını kullanarak akciğerleri hazırlayın.
3. Hassas kesilmiş akciğer diliminin hazırlanmasından sonra, dokuyu bir mikroskop kaydırağı üzerine yerleştirin ve dokunun üzerine bir kapak parçası yerleştirin.
4. TdTomato boyamasını tespit etmek için bir konfokal mikroskop kullanın (eksitasyon dalga boyu 555 nm kullanarak).

Sonuçlar

Hücrelere veya dokuya eklendiğinde, canlılık reaktifi, canlı dokunun azaltıcı ortamı tarafından değiştirilir ve pembe / kırmızıya döner ve yüksek floresan haline gelir. 0-1 ve 9-10. günden itibaren tespit edilen temsili renk değişiklikleri Şekil 3'tegösterilmiştir. Belirtildiği gibi, çözüm maviye başladı ve bir gecede pembeye döndü ve canlılık gösterdi. Renk değişimi genellikle 1-4 saat içinde gerçekleşir; ancak, daha uzun bir süre gerekebilir. Canlıl?...

Tartışmalar

Bu yazıda, özellikle vasküler yapının korunmuş kontrititesi ile üç boyutlu olarak görülebilen akciğer dokusunun mikrosliklerini elde etmek için PCLS uygulaması kullanılarak, vasküler yapıyı koruyan ve deneysel esnekliği optimize eden yüksek çözünürlüklü murine akciğer dokusu görüntüleri üretmek için geliştirilmiş bir yöntem açıklanmıştır. Uygulanabilirlik reaktifini kullanarak, protokol özenle hazırlanmış ve korunmuş dilimlerin bir haftadan fazla yaşayabilirliği koruyabilece?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G