Fette polmonari tagliate con precisione come strumento efficiente per studi ex vivo sulla struttura dei vasi polmonari e sulla contrattilità

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo per preservare la contrattilità vascolare del tessuto polmonare murino PCLS, risultante in una sofisticata immagine tridimensionale della vascolarizzazione polmonare e delle vie aeree, che può essere conservata fino a 10 giorni che è suscettibile di numerose procedure.

Abstract

La visualizzazione del tessuto polmonare murino fornisce preziose informazioni strutturali e cellulari riguardanti le vie aeree e la vascolarizzazione sottostanti. Tuttavia, la conservazione dei vasi polmonari che rappresenta veramente le condizioni fisiologiche presenta ancora delle sfide. Inoltre, la delicata configurazione dei polmoni murini comporta sfide tecniche nella preparazione di campioni per immagini di alta qualità che preservano sia la composizione cellulare che l'architettura. Allo stesso modo, i saggi di contrattilità cellulare possono essere eseguiti per studiare il potenziale delle cellule di rispondere ai vasocostrittori in vitro, ma questi saggi non riproducono l'ambiente complesso del polmone intatto. In contrasto con questi problemi tecnici, il metodo PCLS (Precision-Cut Lung Slice) può essere applicato come alternativa efficiente per visualizzare il tessuto polmonare in tre dimensioni senza pregiudizi regionali e fungere da modello di contrattilità surrogata dal vivo per un massimo di 10 giorni. Il tessuto preparato utilizzando PCLS ha conservato la struttura e l'orientamento spaziale, rendendolo ideale per studiare i processi patologici ex vivo. La posizione delle cellule endogene tdTomato-labeled in PCLS raccolte da un modello murino tdTomato reporter inducibile può essere visualizzata con successo mediante microscopia confocale. Dopo l'esposizione a vasocostrittori, PCLS dimostra la conservazione sia della contrattilità dei vasi che della struttura polmonare, che può essere catturata da un modulo time-lapse. In combinazione con le altre procedure, come western blot e analisi dell'RNA, PCLS può contribuire alla comprensione completa delle cascate di segnalazione che sono alla base di un'ampia varietà di disturbi e portano a una migliore comprensione della fisiopatologia nelle malattie vascolari polmonari.

Introduzione

I progressi nella preparazione e nell'imaging del tessuto polmonare che preserva i componenti cellulari senza sacrificare la struttura anatomica forniscono una comprensione dettagliata delle malattie polmonari. La capacità di identificare proteine, RNA e altri composti biologici mantenendo la struttura fisiologica offre informazioni vitali sulla disposizione spaziale delle cellule che possono ampliare la comprensione della fisiopatologia in numerose malattie polmonari. Queste immagini dettagliate possono portare a una migliore comprensione delle malattie vascolari polmonari, come l'ipertensione dell'arteria polmonare, se applicate a modelli animali, portando potenzialmente a migliori strategie terapeutiche.

Nonostante i progressi della tecnologia, ottenere immagini di alta qualità del tessuto polmonare murino rimane una sfida. Il ciclo respiratorio è guidato da una pressione intratoracica negativa generata durante l'inalazione¹. Quando tradizionalmente si ottengono biopsie e si preparano campioni polmonari per l'imaging, il gradiente di pressione negativa viene perso con conseguente collasso delle vie aeree e della vascolarizzazione, che non si presenta più nel suo stato attuale. Per ottenere immagini realistiche che riflettano le condizioni attuali, le vie aeree polmonari devono essere rigonfiate e la vascolarizzazione perfusa, trasformando il polmone dinamico in un dispositivo statico. L'applicazione di queste tecniche distinte consente la conservazione dell'integrità strutturale, della vascolarizzazione polmonare e dei componenti cellulari, comprese le cellule immunitarie come i macrofagi, consentendo al tessuto polmonare di essere visto il più vicino possibile al suo stato fisiologico.

Precision cut lung slicing (PCLS) è uno strumento ideale per studiare l'anatomia e la fisiologia della vascolarizzazione polmonare². PCLS fornisce immagini dettagliate del tessuto polmonare in tre dimensioni, preservando i componenti strutturali e cellulari. PCLS è stato utilizzato in modelli animali e umani per consentire immagini vive ad alta risoluzione delle funzioni cellulari in tre dimensioni, rendendolo uno strumento ideale per studiare potenziali bersagli terapeutici, misurare la contrazione delle piccole vie aeree e studiare la fisiopatologia delle malattie polmonari croniche come BPCO, ILD e cancro del polmone³. Utilizzando tecniche simili, l'esposizione di campioni PCLS a vasocostrittori può preservare la struttura polmonare e la contrattilità dei vasi, replicando le condizioni in vitro. Oltre a preservare la contrattilità, i campioni preparati possono essere sottoposti a ulteriori analisi come il sequenziamento dell'RNA, il Western blot e la citometria a flusso se preparati correttamente. Infine, le cellule marcate con colore reporter contrassegnate con fluorescenza tdTomato dopo la raccolta polmonare possono preservare l'etichettatura dopo aver preparato le microslice, rendendolo ideale per gli studi di tracciamento cellulare. L'integrazione di queste tecniche fornisce un modello sofisticato che preserva la disposizione spaziale delle cellule e la contrattilità dei vasi che può portare a una comprensione più dettagliata delle cascate di segnalazione e delle potenziali opzioni terapeutiche nella malattia vascolare polmonare.

In questo manoscritto, il tessuto polmonare murino PCLS è esposto a vasocostrittori, dimostrando l'integrità strutturale preservata e la contrattilità dei vasi. Lo studio dimostra che il tessuto preparato e maneggiato in modo appropriato può rimanere vitale per 10 giorni. Lo studio dimostra anche la conservazione delle cellule con fluorescenza endogena (tdTomato), consentendo ai campioni di fornire immagini ad alta risoluzione della vascolarizzazione polmonare e dell'architettura. Infine, sono stati descritti modi per gestire e preparare fette di tessuto per la misurazione dell'RNA e Western blot per studiare i meccanismi sottostanti.

Protocollo

Tutta la cura degli animali era in conformità con le linee guida del Boston Children's Hospital e i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee. I topi utilizzati in questo studio sono topi wild type C57/B6 e topi incrociati Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare in anticipo la soluzione tampone fosfato (1x PBS) e la soluzione di agarose al 2% necessaria durante l'esperimento.
   1. Mescolare 2 g di polvere di agarose in 100 ml di acqua autoclavata. Riscaldarlo nel microonde alcuni secondi alla volta fino a quando la soluzione è chiara.
   2. Porre la soluzione a bagnomaria a 42 °C fino all'uso.
      NOTA: Sia PBS che 2% di agarose possono essere conservati a temperatura ambiente per settimane.

2. Estrazione del polmone del topo

1. Eutanasia del topo per sovradosaggio di isoflurano. Ottenere il sovradosaggio di isoflurano posizionando una piccola quantità di isoflurano su carta velina nel livello inferiore e posizionando il topo nel livello superiore in un essiccatore. Il topo rimane nell'essiccatore fino a quando non incosciente.
2. Garantire la morte del topo applicando una pressione inferiore sul collo e tirando caudale sulla coda. Portate il mouse sulla superficie di dissezione.
3. Posizionare il mouse in posizione supina e fissarlo in posizione nastrando le zampe e il naso al tavolo con nastro adesivo.
4. Spruzzare la superficie ventrale del mouse con etanolo al 70% e rimuovere l'etanolo in eccesso.
5. Sollevare la pelle addominale del topo con una pinza nella posizione della vescica e tagliare la linea mediana con le forbici chirurgiche, muovendosi superiormente alla regione cervicale, esponendo la trachea.
6. Sollevare lo strato fasciale sottostante con una pinzetta e tagliare con forbici chirurgiche per esporre organi viscerali e compartimento mediastinico, tagliando di nuovo da inferiore a superiore.
7. Tagliare lo sterno sulla linea mediana per esporre il cuore e il polmone.
8. Usando la dissezione smussata, staccare il diaframma dal fegato e dal compartimento addominale.
9. Individuare la vena cava inferiore (IVC) sotto l'intestino e tagliare l'IVC.
10. Individuare il ventricolo destro.
    NOTA: Il ventricolo destro avrà un aspetto più leggero rispetto al ventricolo sinistro e il setto intraventricolare dovrebbe essere visualizzato, separando il ventricolo destro dal ventricolo sinistro.
11. Iniettare 0,5 mL di eparina frazionata all'1% nel ventricolo destro con un ago a farfalla da 25-30 G e poi sciacquare lentamente ma costantemente con 10-15 mL di 1x PBS (Figura 1A).
    1. Usare cautela per non inserire l'ago attraverso il cuore e iniettare eparina nella cavità mediastinico.
       NOTA: L'iniezione di 1x PBS rende bianco il tessuto polmonare. Il fluido che estrave dall'aorta addominale deve essere chiaro e incolore e il fegato può diventare bianco in apparenza dopo un arrossamento riuscito.
12. Individuare la laringe e sezionare la fascia e il tessuto circostanti utilizzando una pinzetta a punta smussata.
13. Posizionare la sutura chirurgica sotto la trachea e legare liberamente un nodo chirurgico.
14. Posizionare un piccolo foro nella trachea superiore alla corda e canulare con ago smussato da 20 G.
15. Stringere la sutura attorno all'ago e alla trachea usando un nodo chirurgico.
16. Iniettare 2,5-4 ml di agarose nella trachea e monitorare l'inflazione del polmone.
17. Dopo che l'agarose è stato instillato, versare freddo, refrigerato 1x PBS sul polmone per solidificare l'agarose.
18. Tagliare la trachea superiore alla sutura chirurgica e sezionare il polmone e il cuore dal mediastino rimuovendo eventuali aderenze e fascia.
19. Dopo la solidificazione, mettere in 1x DMEM (abbastanza per immergere il tessuto) in una capsula di Petri per mantenere sul ghiaccio. Tagliare immediatamente un lobo usando una macchina a vibratomo (Figura 1B).

3. Fette polmonari tagliate di precisione

1. Attaccare il campione alla piattaforma con supercolla, mantenendo il lato mediale del campione rivolto verso l'alto.
2. Riempire il contenitore del campione con 1x PBS, assicurandosi che il campione sia completamente sommerso.
3. Riempire il contenitore che circonda il contenitore del campione con ghiaccio per mantenere il PBS circostante e il campione freddo.
4. Accendere il vibratomo e regolare le impostazioni desiderate di seguito.
   1. Impostare lo spessore su 300um.
   2. Impostare la frequenza su 100 Hz.
   3. Impostare l'ampiezza su 0,6 mm.
   4. Impostare la velocità su 5 μm/s.
5. Utilizzando una chiave a brugola, ruotare il supporto della lama nella posizione sicura e aprire le ganasce per inserire una lama.
6. Stringere le ganasce con una chiave a brugola e girare il supporto della lama nella posizione appropriata per l'affettatura.
7. Posizionare il campione e la piattaforma sulla scatola e far scorrere davanti alla lama.
8. Riempire la scatola intorno alla piattaforma del campione con 1x PBS fino a quando il campione non è sommerso.
9. Portare la lama del vibratomo fino al bordo del blocco e abbassare manualmente la lama fino a quando non è uniforme con la parte superiore del campione.
10. Confermare le impostazioni appropriate ed eseguire il vibratoma (Figura 2).
11. Quando le fette fresche vengono tagliate, rimuovere i campioni dal PBS e metterli in una capsula di Petri sterile con 10 ml di 1x DMEM contenente 1x antibiotico-antimicotico.
12. Al termine, ritrarre completamente la lama e quindi utilizzare la chiave a brugola per sollevare la lama in una posizione sicura.
13. Conservare i campioni in 1x DMEM in un incubatore a 37 °C con vitalità conservata per un massimo di 10 giorni (vedere esperimento di vitalità di seguito).

4. Esempio di esperimento vasocostrittore

1. Posizionare una fetta di vibratome su un vetrino per microscopio.
2. Prima di posizionarlo sulla diapositiva, utilizzare una salvietta detergente per eliminare il mezzo in eccesso (PBS).
3. Posizionare il campione sotto microscopia a contrasto di fase e utilizzare l'ingrandimento 10-20x per identificare un vaso.
4. Metti 500 μL di vasocostrittori, come 60 mM KCl o 1 μM Endotelina-1 per immergere completamente il vetrino.
5. Osserva e cattura il video registrando per 30 s-60 s (Video 1).

5. Preparare il tessuto per la lisi dell'RNA o delle proteine su PCLS

1. Prima di iniziare l'esperimento, riempire una piccola scatola di polistirene espanso con 1 L di azoto liquido.
2. Posizionare due piccoli tubi microcentrifuga (1,5 ml) nel contenitore con azoto liquido prima di iniziare.
   NOTA: l'azoto liquido deve raffreddarsi all'esterno dei tubi, tuttavia, non essere all'interno. Assicurati di maneggiare l'azoto liquido con cura e non esporre la pelle all'azoto liquido. Utilizzare pinzo e guanti per posizionare e rimuovere i tubi dalla scatola.
3. Mettere 4-5 fette di vibratome fresco in una ciotola di mortaio.
4. Versare 5-10 ml di N2 liquido sopra le fette nella ciotola di malta.
5. Utilizzare rapidamente il pestello per macinare le fette di congelamento flash in polvere prima che l'azoto liquido evapori.
   NOTA: il tessuto deve condensarsi in una polvere fine. In caso contrario, aggiungere ulteriore azoto liquido fino a quando non viene raggiunto.
6. Utilizzando uno scooper da laboratorio in acciaio (prechilled con azoto liquido), raccogliere la polvere nei due tubi microcentrifuga refrigerati.
7. Liquidare la polvere aggiungendo 500 μL di reagente di estrazione dell'RNA per procedere con l'isolamento dell'RNA o 500 μL di tampone RIPA (contiene 1x inibitori della proteasi) per procedere con la lisi proteica.
8. Conservare i campioni a -80 °C fino a ulteriore isolamento dell'RNA, misurazione bcA e western blot.

6. Determinazione della redditività

1. Dopo la preparazione del vibratoma, posizionare due fette di polmone in una piastra di coltura a 24 pozzetti con 450 μL di mezzo DMEM e 50 μL di reagente di vitalità cellulare (assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso).
2. Rimettere i campioni in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C durante la notte con un'esposizione minima alla luce.
3. Al mattino, osservare la soluzione per il cambiamento di colore. La soluzione blu diventa rosa quando il tessuto è vitale.

7. Conservazione dell'etichettatura delle cellule

1. Trattare un cdh5-CreERT2 transgenico incrociato con topo Ai14 tdTomato con un'iniezione IP di Tamoxifene (2 mg/die) per un totale di 5 giorni (dose totale 10 mg di Tamoxifene) per indurre tdTomato label Cre cellule positive.
2. Una settimana dopo l'iniezione, preparare i polmoni utilizzando i passaggi da 1 a 3 di cui sopra.
3. Dopo aver preparato la fetta di polmone tagliata con precisione, posizionare il tessuto su un vetrino per microscopio e posizionare un coperchio sopra il tessuto.
4. Utilizzare un microscopio confocale per rilevare la colorazione tdTomato (utilizzando la lunghezza d'onda di eccitazione 555 nm).

Risultati

Quando viene aggiunto alle cellule o ai tessuti, il reagente di vitalità viene modificato dall'ambiente riducente del tessuto vitale e diventa rosa / rosso, diventando altamente fluorescente. I cambiamenti di colore rappresentativi rilevati dal giorno 0-1 e dal giorno 9-10 sono dimostrati nella Figura 3. Come notato, la soluzione è iniziata blu e si è trasformata in rosa durante la notte, dimostrando vitalità. Il cambiamento di colore si verifica in genere entro 1-4 ore; tuttavia, potreb...

Discussione

In questo manoscritto, viene descritto un metodo avanzato per produrre immagini ad alta risoluzione del tessuto polmonare murino che preserva la struttura vascolare e ottimizza la flessibilità sperimentale, in particolare utilizzando l'applicazione di PCLS per ottenere microslice di tessuto polmonare che possono essere visualizzate in tre dimensioni con contrattilità preservata della vascolarizzazione. Utilizzando il reagente di vitalità, il protocollo dimostra che le fette accuratamente preparate e conservate possono...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G