פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות

Summary

מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.

Abstract

ההדמיה של רקמת ריאה מורינית מספקת מידע מבני ותאי בעל ערך לגבי דרכי הנשימה הבסיסיות ו vasculature. עם זאת, שימור כלי הריאות המייצגים באמת תנאים פיזיולוגיים עדיין מציב אתגרים. בנוסף, התצורה העדינה של ריאות מורינה גורמת לאתגרים טכניים בהכנת דגימות לתמונות באיכות גבוהה המשמרות הן את הרכב התאים והן את הארכיטקטורה. באופן דומה, בדיקות התכווצות הסלולר יכולות להתבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב vasoconstrictors במבחנה, אבל בדיקות אלה אינם לשחזר את הסביבה המורכבת של הריאה שלם. בניגוד לבעיות טכניות אלה, ניתן ליישם את שיטת פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) כחלופה יעילה להדמיית רקמת ריאה בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ולשמש מודל קבלנות פונדקאית חיה עד 10 ימים. רקמות מוכנות באמצעות PCLS יש מבנה משומר אוריינטציה מרחבית, מה שהופך אותו אידיאלי ללמוד תהליכי מחלה ex vivo. המיקום של תאים אנדוגניים המסומנים ב- PCLS שנקטפו ממודל מורינה של כתב tdTomato שניתן לתמצית יכול להיות חזותי בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר חשיפה vasoconstrictors, PCLS מדגים את השימור של התכווצות כלי הדם ואת מבנה הריאות, אשר ניתן ללכוד על ידי מודול לשגות זמן. בשילוב עם ההליכים האחרים, כגון כתם מערבי וניתוח RNA, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ולהוביל להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיים.

Introduction

ההתקדמות בהכנת והדמיה של רקמת ריאה המשמרת רכיבים תאיים מבלי להקריב מבנה אנטומי מספקת הבנה מפורטת של מחלות ריאות. היכולת לזהות חלבונים, RNA ותרכובות ביולוגיות אחרות תוך שמירה על מבנה פיזיולוגי מציעה מידע חיוני על הסידור המרחבי של תאים שיכולים להרחיב את ההבנה של הפתופיזיולוגיה במחלות ריאות רבות. תמונות מפורטות אלה יכולות להוביל להבנה טובה יותר של מחלות כלי דם ריאתיים, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, כאשר הם מוחלים על מודלים של בעלי חיים, מה שעלול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.

למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השגת תמונות באיכות גבוהה של רקמת ריאה מורינה נותרה אתגר. מחזור הנשימה מונע על ידי לחץ תוך-אתורי שלילי שנוצר במהלך שאיפה¹. כאשר באופן מסורתי להשיג ביופסיות והכנת דגימות ריאות להדמיה, שיפוע הלחץ השלילי הולך לאיבוד וכתוצאה מכך קריסת דרכי הנשימה vasculature, אשר כבר לא מייצג את עצמו במצב הנוכחי שלה. כדי להשיג תמונות מציאותיות המשקפות את התנאים הנוכחיים, יש לנפח מחדש את דרכי הנשימה הריאתיות, ואת כלי השיט, שינוי הריאה הדינמית לתוך מתקן סטטי. היישום של טכניקות ייחודיות אלה מאפשר שימור של שלמות מבנית, כלי דם ריאתי, ורכיבים תאיים, כולל תאים חיסוניים כגון מקרופאגים, המאפשר רקמת ריאה להיות גלוי קרוב ככל האפשר למצבה הפיזיולוגי.

חיתוך ריאות מדויק (PCLS) הוא כלי אידיאלי לחקר האנטומיה והפיזיולוגיה של כלי הריאות². PCLS מספק הדמיה מפורטת של רקמת הריאה בשלושה ממדים תוך שמירה על רכיבים מבניים ותאיים. PCLS שימש במודלים של בעלי חיים ובני אדם כדי לאפשר תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של תפקודים תאיים בשלושה ממדים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות, למדוד התכווצות דרכי הנשימה הקטנות וללמוד את הפתופיזיקה של מחלות ריאות כרוניות כגון COPD, ILD וסרטן^{ריאות 3}. באמצעות טכניקות דומות, החשיפה של דגימות PCLS vasoconstrictors יכול לשמר את מבנה הריאות ואת התכווצות כלי הדם, שכפול בתנאי הפריה. יחד עם שמירה על התכווצות, דגימות מוכנות יכולות לעבור ניתוח נוסף כגון רצף RNA, כתם מערבי, וציטומטריית זרימה כאשר הם מוכנים כראוי. לבסוף, כתב צבע מסומן עם פלואורסצנטיות tdTomato לאחר קציר ריאות יכול לשמר תיוג לאחר הכנת microslices, מה שהופך אותו אידיאלי עבור מחקרי מעקב אחר תאים. השילוב של טכניקות אלה מספק מודל מתוחכם המשמר את הסידור המרחבי של תאים והתכווצות כלי שיכול להוביל להבנה מפורטת יותר של מפלי האיתות ואפשרויות טיפוליות פוטנציאליות במחלת כלי הדם הריאתי.

בכתב יד זה, רקמת הריאה המורינה של PCLS נחשפת ל vasoconstrictors, המדגימה שלמות מבנית שמורה והתכווצות כלי. המחקר מדגים כי הרקמה מוכנה ומטופלת כראוי יכול להישאר קיימא במשך 10 ימים. המחקר מדגים גם את שימור התאים עם פלואורסצנטיות אנדוגני (tdTomato), ומאפשר דגימות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי וארכיטקטורה. לבסוף, תוארו דרכים לטפל ולהכין פרוסות רקמות למדידת RNA וכתם מערבי כדי לחקור מנגנונים הבסיסיים.

Protocol

כל הטיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות של בית החולים לילדים בבוסטון וועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדית אישרה פרוטוקולים. העכברים המשמשים במחקר זה הם עכברי C57/B6 מסוג בר ו- Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato חצה עכברים.

1. הכנת פתרונות

1. הכן פתרון חיץ פוספט (1x PBS) ופתרון אגרוז 2% הנדרש במהלך הניסוי מראש.
   1. מערבבים 2 גרם אבקת אגרוז ל-100 מ"ל של מים משועבדים אוטומטית. מחממים אותו במיקרוגל כמה שניות בכל פעם עד הפתרון ברור.
   2. מניחים את הפתרון באמבט מים ב 42 °C (50 °F) עד השימוש.
      הערה: ניתן לאחסן הן PBS והן 2% אגרוז בטמפרטורת החדר במשך שבועות.

2. מיצוי של ריאה העכבר

1. להרדים את העכבר על ידי מנת יתר איזופלוריין. להשיג מנת יתר איזופלורן על ידי הצבת כמות קטנה של איזופלוראן על נייר טישו במפלס התחתון והצבת העכבר במפלס העליון בחיטוי. העכבר נשאר בחיטוי עד שהוא מחוסר הכרה.
2. להבטיח את מותו של העכבר על ידי הפעלת לחץ נחות על הצוואר ומשיכת caudal על הזנב. הבא את העכבר למשטח הניתוח.
3. הנח את העכבר בתנוחת העפר והבטח אותו במקום הדבקת כפות רגליים ואף לשולחן עם סרט הדבקה.
4. לרסס את פני השטח הגחון של העכבר עם 70% אתנול ולנגב את האתנול עודף.
5. הרם את עור הבטן של העכבר עם מלקחיים במיקום של שלפוחית השתן לחתוך בקו האמצע עם מספריים כירורגיים, נע מעולה לאזור צוואר הרחם, חשיפת קנה הנשימה.
6. הרם את השכבה הפאשיאלית הבסיסית עם פינצטה וחתוך עם מספריים כירורגיים כדי לחשוף איברים קרביים ותא mediastinal, שוב חיתוך נחות מעולה.
7. תחתוך את החזה בקו האמצע כדי לחשוף את הלב והריאה.
8. באמצעות ניתוח קהה, לנתק את הסרעפת מן הכבד ותא הבטן.
9. אתר את הוועד הנעית הנחות (IVC) מתחת למעיים וחתוך את ה- IVC.
10. אתר את החדר הימני.
    הערה: החדר הימני יהיה מראה קל יותר בהשוואה לחדר השמאלי ואת המחיצה intraventricular צריך להיות חזותי, הפרדת החדר הימני מן החדר השמאלי.
11. הזריקו 0.5 מ"ל של הפרין חלקי של 1% לחדר הימני עם מחט פרפר 25-30 גרם ואז שטפו לאט אך בהתמדה עם 10-15 מ"ל של 1x PBS(איור 1A).
    1. היזהר לא להכניס את המחט דרך הלב ולהזריק הפרין לתוך חלל החציון.
       הערה: ההזרקה של 1x PBS הופכת את רקמת הריאה ללבן. נוזל extravasating מאבי העורקים הבטן צריך להיות ברור וחסר צבע הכבד עשוי להיות לבן במראה לאחר שטיפה מוצלחת.
12. אתר את הגרון ונותח את הפאסיה והרקמות שמסביב באמצעות פינצטה קהה.
13. מניחים את התבר הכירורגי מתחת קנה הנשימה וקושרים קשר כירורגי באופן רופף.
14. מניחים חור קטן בקנה הנשימה עדיף על חוט ו canulate עם 20 G מחט קהה.
15. הדקו את התיל סביב המחט ו קנה הנשימה באמצעות קשר כירורגי.
16. הזריקו 2.5-4 מ"ל של אגרוז לתוך קנה הנשימה ופקחו על אינפלציית הריאה.
17. לאחר אגרוז הוא החדיר, לשפוך קר, מצונן 1x PBS מעל הריאה כדי לחזק את אגרוז.
18. חותכים את קנה הנשימה העליון על התפר כירורגי לנתח את הריאה והלב מן mediastinum על ידי הסרת כל הידבקויות fascia.
19. לאחר התגבשות, מניחים ב- 1x DMEM (מספיק כדי להטביע רקמה) בצלחת פטרי כדי לשמור על קרח. פרוס מיד אונה אחת באמצעות מכונת ויברטום(איור 1B).

3. פרוסות ריאות חתוכות במדויק

1. חבר את המדגם לפלטפורמה באמצעות דבק-על, תוך שמירה על הצד המהודד של המדגם פונה כלפי מעלה.
2. מלא את מיכל המדגם עם 1x PBS, להבטיח כי המדגם הוא שקוע לחלוטין.
3. מלא את המיכל המקיף את מיכל הדגימה בקרח כדי לשמור על PBS שמסביב לדגום קר.
4. הפעל את הוויברטום והסתגל להגדרות הרצויות להלן.
   1. הגדר את העובי ל 300um.
   2. הגדר את התדר ל- 100 הרץ.
   3. הגדר את המשרעת ל 0.6 מ"מ.
   4. הגדר את המהירות ל 5 מיקרומטר /s.
5. בעזרת מפתח ברגים של אלן, הפכו את מחזיק הלהב לתנוחה הבטוחה ופתחו את הלסתות כדי להכניס להב.
6. הדקו את הלסתות עם מפתח ברגים של אלן והפכו את מחזיק הלהב לתנוחה המתאימה לתחינה.
7. הנח את הדגימה ואת הפלטפורמה על הקופסה והחליק לפני הלהב.
8. מלא את התיבה סביב פלטפורמת המדגם ב- 1x PBS עד שהדגימה שקועה.
9. מביאים את להב הוויברטום לקצה הבלוק ומנמיכים ידנית את הלהב עד שהוא אפילו עם החלק העליון של הדגימה.
10. אשרו את ההגדרות המתאימות והפעילו את הוויברטום(איור 2).
11. כאשר פרוסות טריות נחתכות, הסר את הדגימות מן PBS ומניחים אותם לתוך צלחת פטרי סטרילי עם 10 מ"ל של 1x DMEM המכיל 1x אנטי-ממיקוטי אנטישמי.
12. בסיום, לסגת הלהב לחלוטין ולאחר מכן להשתמש מפתח ברגים אלן להרים את הלהב למצב בטוח.
13. לאחסן את הדגימות ב 1x DMEM באינקובטור ב 37 °C עם הכדאיות נשמר עד 10 ימים (ראה ניסוי קיימא להלן).

4. ניסוי נסוקונסטרי לדוגמה

1. הנח פרוסת רטט על שקופית מיקרוסקופ.
2. לפני הנחתו על השקופית, השתמש במחיק ניקוי כדי להיפטר מהמדיום העודף (PBS).
3. מקם את המדגם תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה והשתמש בהגדלה של פי 10-20 כדי לזהות כלי שיט.
4. שים 500 μL של vasoconstrictors, כגון 60 mM KCl או 1 μM אנדותלין-1 כדי להטביע לחלוטין את השקופית.
5. צפה ולכוד את הווידאו על ידי הקלטה עבור 30 s-60 s(וידאו 1).

5. הכנת הרקמה ל-RNA או לתזה של חלבון ב-PCLS

1. לפני תחילת הניסוי, מלאו קופסת קצף פוליסטירן קטנה ב-1 ליטר של חנקן נוזלי.
2. מניחים שני צינורות מיקרוצנטריפוגה קטנים (1.5 מ"ל) במיכל עם חנקן נוזלי לפני תחילת.
   הערה: חנקן נוזלי צריך להתקרר מחוץ לצינורות, עם זאת, לא להיות בפנים. הקפד לטפל חנקן נוזלי בזהירות ולא לחשוף את העור חנקן נוזלי. השתמש במלקחיים ובכפפות כדי למקם ולהסיר צינורות מהקופסה.
3. מניחים 4-5 פרוסות רטט טריות בקערת מרגמה.
4. יוצקים 5-10 מ"ל של N2 נוזלי על גבי הפרוסות בקערת המרגמה.
5. השתמשו במהירות במעלה כדי לטחון את פרוסות ההקפאה של הפלאש לאבקה לפני שהחנקן הנוזלי מתאדה.
   הערה: רקמה צריכה לדחוס לאבקה דקה. אם לא, מוסיפים חנקן נוזלי נוסף עד להשגת.
6. בעזרת כף מדידה של מעבדת פלדה (עם חנקן נוזלי), יש לגרוף את האבקה לתוך שני צינורות המיקרוצנטריפוגה המצוננים.
7. Lyse האבקה על ידי הוספת 500 μL של ריאגנט מיצוי RNA להמשיך עם בידוד RNA או 500 μL של מאגר RIPA (מכיל מעכבי פרוטאז 1x) כדי להמשיך עם תמוגת חלבון.
8. יש לאחסן את הדגימות ב-80 °C (80 °F) עד לבידוד RNA נוסף, מדידת BCA וכתם מערבי.

6. קביעת הכדאיות

1. לאחר הכנת ויברטום, מניחים שתי פרוסות ריאות לתוך צלחת תרבית 24-well עם 450 μL של מדיה DMEM ו 50 μL של ריאגנט הכדאיות התא (להבטיח כי הרקמה שקועה לחלוטין).
2. מחזירים את הדגימות ל-5% CO₂ באינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם חשיפה מינימלית לאור.
3. בבוקר, התבונן בפתרון לשינוי צבע. הפתרון הכחול הופך ורוד כאשר הרקמה היא בת קיימא.

7. שימור תיוג תאים

1. לטפל Cdh5-CreERT2 מהונדס חצה עם עכבר Ai14 tdTomato עם הזרקת IP של טמוקסיפן (2 מ"ג ליום) במשך סך של 5 ימים (מינון כולל 10 מ"ג טמוקסיפן) כדי לגרום tdTomato תווית Cre תאים חיוביים.
2. שבוע לאחר ההזרקה, להכין את הריאות באמצעות השלבים לעיל 1 עד 3.
3. לאחר הכנת פרוסת הריאות החתכה במדויק, מניחים את הרקמה על שקופית מיקרוסקופ ומניחים כיסוי על גבי הרקמה.
4. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לזהות כתמי tdTomato (באמצעות אורך גל עירור 555 ננומטר).

תוצאות

כאשר נוסף לתאים או רקמה, ריאגנט הכדאיות משתנה על ידי הסביבה המפחיתה של רקמה בת קיימא והופך ורוד / אדום, הופך פלואורסצנטי מאוד. שינויי הצבעים המייצגים שזוהו מהיום 0-1 ומהיום 9-10 מוצגים באיור 3. כאמור, הפתרון התחיל בכחול והפך ורוד בן לילה, והפגין כדאיות. שינוי צבע מתרחש בדרך כלל ב?...

Discussion

בכתב יד זה, שיטה משופרת לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמת ריאה מורינה המשמרת את מבנה כלי הדם ומייעלת את הגמישות הניסיונית מתוארת, במיוחד באמצעות היישום של PCLS כדי להשיג microslices של רקמת ריאה שניתן לראות בשלושה ממדים עם התכווצות השתמרה של כלי הדם. באמצעות ריאגנט הכדאיות, הפרוטוקול מדגים כי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G