정밀 절단 폐 슬라이스는 전 생체 폐 혈관 구조 및 수축 연구를위한 효율적인 도구로

요약

여기에 제시된 PCLS 뮤린 폐 조직의 혈관 수축을 보존하기 위한 프로토콜이 있으며, 그 결과 수많은 절차에 취약한 최대 10일 동안 보존될 수 있는 폐 혈관 및 기도의 정교한 입체 이미지가 생성된다.

초록

뮤린 폐 조직의 시각화는 기본 기도 및 혈관에 관한 귀중한 구조 및 세포 정보를 제공합니다. 그러나, 진정으로 생리 조건을 나타내는 폐 혈관의 보존은 여전히 도전을 제시한다. 또한, 뮤린 폐의 섬세한 구성은 세포 구성과 아키텍처를 모두 보존하는 고품질 이미지에 대한 샘플을 준비하는 기술적 과제를 초래합니다. 유사하게, 세포 수축성 검사는 체외에서혈관 수축에 반응하는 세포의 잠재력을 연구하기 위하여 수행될 수 있습니다, 그러나 이 소약은 그대로 폐의 복잡한 환경을 재현하지 않습니다. 이러한 기술적 문제와는 달리, 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS) 방법은 지역적 편견 없이 폐 조직을 3차원으로 시각화하고 최대 10일 동안 살아있는 대리 수축 모델로 작용할 수 있는 효율적인 대안으로 적용될 수 있다. PCLS를 사용하여 제조된 조직은 구조와 공간 방향을 보존하여 질병 과정을연구하는 것이 이상적입니다. 유도성 tdTomato 리포터 뮤린 모델에서 수확한 PCLS내 내인성 tdTomato 표지 세포의 위치는 공초점 현미경 검사법에 의해 성공적으로 시각화될 수 있다. 혈관 수축에 노출 된 후, PCLS는 시간 경과 모듈에 의해 포착 될 수있는 혈관 수축과 폐 구조 모두의 보존을 보여줍니다. 서부 블롯 및 RNA 분석과 같은 다른 절차와 함께 PCLS는 다양한 장애의 근간을 겪고 폐 혈관 질환의 병리생리학에 대한 더 나은 이해로 이어지는 신호 캐스케이드의 포괄적 인 이해에 기여할 수 있습니다.

서문

해부학 구조를 희생하지 않고 세포 구성 요소를 보존하는 폐 조직의 준비 및 이미징의 발전은 폐 질환에 대한 상세한 이해를 제공합니다. 생리구조를 유지하면서 단백질, RNA 및 기타 생물학적 화합물을 식별하는 능력은 수많은 폐 질환에서 병리학의 이해를 넓힐 수 있는 세포의 공간 적 배치에 대한 중요한 정보를 제공한다. 이 상세한 심상은 폐 동맥 고혈압과 같은 폐 혈관 질병의 더 나은 이해로 이끌어 낼 수 있습니다, 동물 모형에 적용될 때, 잠재적으로 향상한 치료 전략으로 이끌어 냅니다.

기술의 진보에도 불구하고, 뮤린 폐 조직의 고품질 이미지를 얻는 것은 여전히 도전남아있다. 호흡 주기는 흡입¹도중 생성된 음성 내측 압력에 의해 구동됩니다. 전통적으로 생검을 얻고 화상 진찰을 위한 폐 견본을 준비하는 때, 음성 압력 그라데이션은 기도와 혈관의 붕괴의 결과로 손실됩니다, 이는 더 이상 현재 상태에서 자신을 나타내지 않습니다. 현재 상태를 반영하는 사실적인 이미지를 얻으려면 폐기도를 다시 팽창해야 하며, 혈관이 침투하여 동적 폐를 정적 설비로 변경해야 합니다. 이러한 뚜렷한 기술의 적용은 대식세포와 같은 면역 세포를 포함하여 구조적 무결성, 폐 혈관 및 세포 성분을 보존할 수 있게 하여 폐 조직이 가능한 한 생리적 상태에 가깝게 볼 수 있게 합니다.

정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 폐 혈관^2의해부학 및 생리학을 연구하기위한 이상적인 도구입니다. PCLS는 구조 및 세포 성분을 보존하면서 폐 조직의 상세한 이미징을 3차원으로 제공합니다. PCLS는 동물 및 인간 모델에서 3차원으로 세포 기능의 생생, 고해상도 이미지를 허용하여 잠재적인 치료 목표를 연구하고, 작은 기도 수축을 측정하고, COPD, ILD 및 폐암^3과같은 만성 폐 질환의 병리생리학을 연구하는 이상적인 도구입니다. 유사한 기술을 사용하여, 혈관 수축에 PCLS 견본의 노출은 폐 구조물 및 혈관 수축을 보존할 수 있습니다, 체외 조건에서 복제. 수축을 보존하는 것과 함께, 준비된 견본은 정확하게 준비될 때 RNA 시퀀싱, 서양 얼룩 및 유혈 세포측정과 같은 추가 분석을 겪을 수 있습니다. 마지막으로, 폐 수확 후 tdTomato 형광으로 표시된 리포터 색 표시 세포는 마이크로 슬라이스를 준비한 후 라벨을 보존할 수 있어 세포 추적 연구에 이상적입니다. 이러한 기술의 통합은 폐 혈관 질환에서 신호 캐스케이드 및 잠재적 치료 옵션에 대한 보다 상세한 이해로 이어질 수있는 세포 및 혈관 수축의 공간 배열을 보존하는 정교한 모델을 제공합니다.

이 원고에서 PCLS 뮤린 폐 조직은 혈관 수축에 노출되어 보존된 구조적 무결성과 혈관 수축을 입증합니다. 연구 결과는 적당히 준비되고 취급된 조직이 10 일 동안 실행 가능한 남아 있다는 것을 보여줍니다. 이 연구는 또한 내인성 형광(tdTomato)을 가진 세포의 보존을 보여 주며, 샘플이 폐 혈관 및 건축의 고해상도 이미지를 제공할 수 있도록 합니다. 마지막으로, RNA 측정및 근본적인 기계장치를 조사하기 위하여 서쪽 얼룩을 위한 조직 조각을 취급하고 준비하는 쪽이 기술되었습니다.

프로토콜

모든 동물 치료는 보스턴 아동 병원과 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인 프로토콜의 지침에 따라했다. 이 연구에서 사용되는 마우스는 야생 형 C57/B6 마우스와 Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato 교차 마우스입니다.

1. 솔루션 준비

1. 실험 중에 필요한 인산염 완충액(1x PBS) 및 2% 아가로즈 용액을 미리 준비한다.
   1. 아가로즈 파우더 2g을 100mL의 오토클레이브 워터에 섞습니다. 용액이 명확해질 때까지 전자레인지에서 몇 초 만에 가열합니다.
   2. 사용 전까지 42°C의 수조에 용액을 놓습니다.
      참고: PBS와 2% 아가로즈는 몇 주 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.

2. 마우스 폐 추출

1. 이소플루란 과다 복용에 의해 마우스를 안락사. 낮은 수준에서 티슈 페이퍼에 소량의 이소플루란을 배치하고 건조기의 상부 수준에 마우스를 배치하여 이소플루란 과다 복용을 달성. 마우스는 의식이 없는 때까지 건조기에 남아 있습니다.
2. 목에 열등한 압력을 가하고 꼬리에 코달을 당겨 마우스의 죽음을 보장합니다. 마우스를 해부 표면에 가져옵니다.
3. 마우스를 supine 위치에 놓고 접착제 테이프로 테이블에 발과 코를 테이핑하는 장소에 고정합니다.
4. 마우스의 복부 표면을 70% 에탄올로 분사하고 과도한 에탄올을 닦아냅니다.
5. 방광의 위치에 집게로 마우스의 복부 피부를 들어 올리고 외과 가위로 중간라인에서 절단하여 자궁 경부 부위로 우수하게 이동하여 기관지를 노출시합니다.
6. 핀셋으로 기본 근막 층을 들어 올리고 외과 가위로 절단하여 내장 장기와 근간 구획을 노출하고 다시 열등하게 절단하여 우수한 것으로 절단합니다.
7. 심장과 폐를 드러내기 위해 중간선에서 흉골을 자른다.
8. 무딘 해부를 사용하여 횡격막을 간과 복부 칸에서 분리하십시오.
9. 장 아래에 열등한 베나 카바(IVC)를 찾아 IVC를 잘라냅니다.
10. 올바른 심실을 찾습니다.
    참고: 오른쪽 심실은 좌심실에 비해 더 가벼운 외관을 가지며 정맥내 중격을 시각화하여 오른쪽 심실을 좌심실에서 분리해야 합니다.
11. 25-30 G 나비 바늘로 오른쪽 심실에 0.5 mL을 분수한 후 1x PBS(그림 1A)의10-15 mL로 천천히 그러나 꾸준히 플러시하십시오.
    1. 심장을 통해 바늘을 삽입하지 않도록주의하고 중간 구멍에 헤파린을 주입하십시오.
       참고 : 1 x PBS의 주사는 폐 조직을 흰색으로 바꿉니다. 복부 대어에서 사치되는 액체는 명확하고 무색이어야하며 간은 성공적인 홍조 후 외관에 흰색이 될 수 있습니다.
12. 후두를 찾아 무딘 팁 핀셋을 사용하여 주변 근막과 조직을 해부합니다.
13. 수술 봉합사를 기관 아래에 놓고 수술 매듭을 느슨하게 묶습니다.
14. 스트링보다 우수한 기관체에 작은 구멍을 놓고 20 G 무딘 끝 바늘로 캐누레이.
15. 수술 매듭을 사용하여 바늘과 기관 주위의 봉합사를 조입니다.
16. 기관체에 아가로오스 2.5-4 mL을 주입하고 폐의 인플레이션을 모니터링하십시오.
17. 아가로즈가 주입된 후, 차갑고 차가운 1x PBS를 폐 위에 부어 아가로즈를 고화시화합니다.
18. 수술 봉합사보다 우수한 기관지를 자르고 접착과 근막을 제거하여 폐와 심장을 중추에서 해부합니다.
19. 고화 후, 얼음을 유지하기 위해 페트리 접시에 1 x DMEM (조직을 담그기에 충분)에 배치합니다. 진동기계(도 1B)를사용하여 즉시 한 엽을 슬라이스합니다.

3. 정밀 절단 폐 슬라이스

1. 샘플을 슈퍼 접착제로 플랫폼에 부착하여 시료의 내측을 위로 유지합니다.
2. 샘플 컨테이너를 1x PBS로 채우고 샘플이 완전히 침수되도록 합니다.
3. 샘플 컨테이너를 둘러싼 용기를 얼음으로 채우고 PBS주변을 유지하고 차가운 샘플을 채웁니다.
4. 진동을 켜고 아래의 원하는 설정에 맞게 조정합니다.
   1. 두께를 300um으로 설정합니다.
   2. 주파수를 100Hz로 설정합니다.
   3. 진폭을 0.6mm로 설정합니다.
   4. 속도를 5 μm/s로 설정합니다.
5. 알렌 렌치를 사용하여 블레이드 홀더를 안전한 위치로 바꾸고 턱을 열어 블레이드를 삽입합니다.
6. 알렌 렌치로 턱을 조이고 블레이드 홀더를 슬라이스에 적합한 위치로 바꿔 놓습니다.
7. 샘플과 플랫폼을 상자에 놓고 블레이드 앞으로 밉을 놓습니다.
8. 샘플이 잠기면 샘플 플랫폼 주변의 상자를 1x PBS로 채웁니다.
9. 진동 블레이드를 블록 가장자리까지 가져와서 샘플 상단이 될 때까지 블레이드를 수동으로 낮춥습니다.
10. 적절한 설정을 확인하고 진동을 실행합니다(그림2).
11. 신선한 슬라이스가 절단되면 PBS에서 샘플을 제거하고 항생제 항mycotic 1x을 함유한 1x DMEM 10mL로 멸균 페트리 접시에 넣습니다.
12. 완료되면 블레이드를 완전히 회수한 다음 알렌 렌치를 사용하여 블레이드를 안전한 위치로 올립니다.
13. 최대 10일 동안 보존된 생존력으로 37°C의 인큐베이터에 1배 DMEM에 샘플을 저장합니다(아래 생존 가능성 실험 참조).

4. 예 혈관 수축 실험

1. 현미경 슬라이드에 진동 조각을 놓습니다.
2. 슬라이드에 놓기 전에 클리닝 와이프를 사용하여 초과 매체 (PBS)를 제거하십시오.
3. 시료를 위상 대비 현미경 검사법 아래에 놓고 10-20배 배율을 사용하여 혈관을 식별합니다.
4. 60mM KCl 또는 1 μM 엔도텔린-1과 같은 혈관 수축기 500μL을 넣어 슬라이드를 완전히 침수합니다.
5. 30 s-60 s(비디오 1)에대한 녹화하여 비디오를 관찰하고 캡처합니다.

5. PCLS에 RNA 또는 단백질 용해에 대한 조직 준비

1. 실험을 시작하기 전에 작은 폴리스티렌 폼 박스에 액체 질소 1L을 채웁니다.
2. 시작하기 전에 액체 질소가있는 용기에 두 개의 작은 미세 원심 분리기 튜브 (1.5 mL)를 놓습니다.
   참고: 액체 질소는 튜브 외부에서 식혀야 하지만 내부에는 그렇지 않습니다. 액체 질소를 조심스럽게 처리하고 피부를 액체 질소에 노출시키지 마십시오. 집게와 장갑을 사용하여 상자에서 튜브를 배치하고 제거합니다.
3. 박격포 그릇에 4-5 신선한 진동 조각을 놓습니다.
4. 모르타르 그릇에 있는 슬라이스 위에 액체 N25-10mL를 붓습니다.
5. 액체 질소가 증발하기 전에 신속하게 유봉을 사용하여 플래시 동결 조각을 분말로 분쇄합니다.
   참고 : 조직은 미세 분말로 응축해야합니다. 그렇지 않은 경우, 달성 될 때까지 추가 액체 질소를 추가합니다.
6. 강철 실험실 스쿠퍼 (액체 질소로 미리 냉각)를 사용하여 분말을 두 개의 차가운 미세 원심 분리 튜브에 스쿱하십시오.
7. RNA 추출 시약 500 μL을 추가하여 단백질 용액을 진행하기 위해 RIPA 버퍼(1배 프로테아제 억제제 포함)의 500 μL을 진행한다.
8. 추가 RNA 절연, BCA 측정 및 서부 블롯이 될 때까지 샘플을 -80 °C에 저장합니다.

6. 생존 가능성 결정

1. 진동 준비 후, DMEM 배지 450 μL 및 세포 생존 성 시약의 50 μL을 가진 24 웰 배양 판에 두 개의 폐 조각을 놓습니다 (조직이 완전히 침수되었는지 확인하십시오).
2. 샘플은 빛에 최소한의 노출로 하룻밤 사이에 37 °C 인큐베이터에서 5 % CO_2로 다시 놓습니다.
3. 아침에는 색상 변화에 대한 해결책을 관찰하십시오. 조직이 실행 가능할 때 파란색 용액이 분홍색으로 바뀝니다.

7. 세포 라벨 보존

1. TdTomato 라벨 Cre 양성 세포를 유도하기 위해 총 5일 동안 타목시펜(2 mg/day)의 IP 주사를 가진 Ai14 tdTomato 마우스와 교차한 형질Cdh5-CreERT2를 치료한다.
2. 주사 후 1 주일, 위의 단계를 사용하여 폐를 준비 1 받는 사람 3.
3. 정밀 절단 폐 슬라이스의 준비 후, 현미경 슬라이드에 조직을 배치하고 조직의 상단에 커버 슬립을 배치합니다.
4. 공초점 현미경을 사용하여 tdTomato 염색을 감지하십시오(여기 파장 555 nm 사용).

결과

세포 또는 조직에 추가될 때, 생존성 시약은 실행 가능한 조직의 감소 환경에 의해 수정되고 분홍색/빨갛게 되어 높은 형광이 됩니다. 0-1일 및 9-10일째부터 감지된 대표적인 색상 변화는 도 3에서입증된다. 언급했듯이, 솔루션은 파란색으로 시작하여 하룻밤 사이에 분홍색으로 변하여 생존가능성을 보여주었습니다. 색상 변경은 일반적으로 1-4 시간 이내에 발생합니다. 그러?...

토론

본 원고에서, 혈관 구조를 보존하고 실험적 유연성을 최적화하는 뮤린 폐 조직의 고해상도 이미지를 생성하는 향상된 방법이 설명되고, 특히 PCLS의 적용을 사용하여 혈관의 수축도 보존된 3차원에서 볼 수 있는 폐 조직의 미세 슬라이스를 얻을 수 있다. 이 프로토콜은 생존 가능성 시약을 사용하여 신중하게 준비되고 보존된 슬라이스가 1주일 이상 생존력을 유지할 수 있음을 보여줍니다. 마이크?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G