Прецизионная резка легких срезов как эффективный инструмент для исследования структуры и сократимости легочных сосудов Ex vivo

Резюме

Здесь представлен протокол сохранения сосудистой сократимости ткани легких мышей PCLS, в результате чего получается сложное трехмерное изображение легочной сосудистой системы и дыхательных путей, которое может сохраняться до 10 дней, подверженных многочисленным процедурам.

Аннотация

Визуализация мышиной легочной ткани предоставляет ценную структурную и клеточную информацию о нижележащих дыхательных путях и сосудистой сети. Тем не менее, сохранение легочных сосудов, которые действительно представляют физиологические условия, по-прежнему представляет проблемы. Кроме того, деликатная конфигурация мышиных легких приводит к техническим проблемам при подготовке образцов для высококачественных изображений, которые сохраняют как клеточный состав, так и архитектуру. Аналогичным образом, анализы клеточной сократимости могут быть выполнены для изучения потенциала клеток реагировать на сосудосуживатели in vitro,но эти анализы не воспроизводят сложную среду неповрежденного легкого. В отличие от этих технических проблем, метод прецизионного разреза легочного среза (PCLS) может применяться в качестве эффективной альтернативы для визуализации легочной ткани в трех измерениях без регионального смещения и служить живой суррогатной моделью сократимости на срок до 10 дней. Ткань, приготовленная с использованием PCLS, имеет сохраненную структуру и пространственную ориентацию, что делает ее идеальной для изучения болезненных процессов ex vivo. Расположение эндогенных tdTomato-меченых клеток в PCLS, собранных из индуцируемой tdTomato репортерной мышиной модели, может быть успешно визуализировано с помощью конфокальной микроскопии. После воздействия сосудосуживающих средств PCLS демонстрирует сохранение как сократимости сосудов, так и структуры легких, которые могут быть захвачены модулем замедленной съемки. В сочетании с другими процедурами, такими как вестерн-блот и анализ РНК, PCLS может способствовать всестороннему пониманию сигнальных каскадов, которые лежат в основе широкого спектра расстройств и приводят к лучшему пониманию патофизиологии при заболеваниях легочных сосудов.

Введение

Достижения в области подготовки и визуализации легочной ткани, которая сохраняет клеточные компоненты без ущерба для анатомической структуры, обеспечивают подробное понимание легочных заболеваний. Способность идентифицировать белки, РНК и другие биологические соединения при сохранении физиологической структуры предлагает жизненно важную информацию о пространственном расположении клеток, которая может расширить понимание патофизиологии при многочисленных легочных заболеваниях. Эти подробные изображения могут привести к лучшему пониманию заболеваний легочных сосудов, таких как гипертония легочной артерии, при применении к животным моделям, что потенциально приводит к улучшению терапевтических стратегий.

Несмотря на достижения в области технологий, получение высококачественных изображений мышиной легочной ткани остается проблемой. Дыхательный цикл обусловлен отрицательным внутриторакальным давлением, создаваемым при вдохе^1. При традиционном получении биопсии и подготовке образцов легких к визуализации теряется отрицательный градиент давления, что приводит к коллапсу дыхательных путей и сосудистой среды, которая больше не проявляет себя в своем нынешнем состоянии. Для достижения реалистичных изображений, отражающих текущие условия, легочные дыхательные пути должны быть повторно надуты, а сосудистая система перфузирована, превращая динамическое легкое в статическую арматуру. Применение этих различных методов позволяет сохранить структурную целостность, легочную сосудистую систему и клеточные компоненты, включая иммунные клетки, такие как макрофаги, что позволяет рассматривать легочную ткань как можно ближе к ее физиологическому состоянию.

Прецизионная разрезанная нарезка легких (PCLS) является идеальным инструментом для изучения анатомии и физиологии легочной сосудистой жидкости^2. PCLS обеспечивает детальную визуализацию легочной ткани в трех измерениях с сохранением структурных и клеточных компонентов. PCLS был использован в моделях животных и человека, чтобы обеспечить живые изображения клеточных функций с высоким разрешением в трех измерениях, что делает его идеальным инструментом для изучения потенциальных терапевтических целей, измерения небольшого сокращения дыхательных путей и изучения патофизиологии хронических заболеваний легких, таких как ХОБЛ, ILD и рак легких^3. Используя аналогичные методы, воздействие образцов PCLS на сосудосуживающих средств может сохранить структуру легких и сократимость сосудов, воспроизводя условия in vitro. Наряду с сохранением сократимости, подготовленные образцы могут подвергаться дополнительному анализу, такому как секвенирование РНК, вестерн-блот и проточная цитометрия при правильном приготовлении. Наконец, клетки с маркировкой репортерного цвета, отмеченные флуоресценцией tdTomato после сбора урожая в легких, могут сохранять маркировку после подготовки микросрезов, что делает ее идеальной для исследований отслеживания клеток. Интеграция этих методов обеспечивает сложную модель, сохраняющую пространственное расположение клеток и сократимость сосудов, что может привести к более детальному пониманию сигнальных каскадов и потенциальных терапевтических вариантов при заболевании легочной сосудистой системы.

В этой рукописи ткань легких мыса PCLS подвергается воздействию сосудосуживающих средств, демонстрируя сохраненную структурную целостность и сократимость сосудов. Исследование показывает, что ткань, подготовленная и обработанная надлежащим образом, может оставаться жизнеспособной в течение 10 дней. Исследование также демонстрирует сохранение клеток с эндогенной флуоресценцией (tdTomato), что позволяет образцам предоставлять изображения с высоким разрешением легочной сосудистой области и архитектуры. Наконец, были описаны способы обработки и подготовки срезов тканей для измерения РНК и вестерн-блотта для исследования основных механизмов.

протокол

Весь уход за животными соответствовал руководящим принципам Бостонской детской больницы и утвержденным Комитетом по институциональным уходу и использованию животных протоколов. Мыши, используемые в этом исследовании, являются дикими мышами типа C57 / B6 и скрещенными мышами Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Приготовление растворов

1. Заранее готовят фосфатный буферный раствор (1x PBS) и 2% раствор агарозы, необходимый во время эксперимента.
   1. Смешайте 2 г порошка агарозы в 100 мл автоклавной воды. Нагревайте его в микроволновой печи несколько секунд за раз, пока раствор не очистится.
   2. Поместите раствор на водяную баню при 42 °C до использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как PBS, так и 2% агароза могут храниться при комнатной температуре в течение нескольких недель.

2. Извлечение легкого мыши

1. Усыпить мышь при передозировке изофлурана. Достичь передозировки изофлурана, поместив небольшое количество изофлурана на папиросную бумагу на нижнем уровне и поместив мышь на верхний уровень в осушитель. Мышь остается в адсорбаторе до потери сознания.
2. Обеспечьте гибель мыши, применяя нижнее давление на шею и вытягивая каудаль на хвост. Поднесите мышь к рассекающей поверхности.
3. Поместите мышь в положение лежа на спине и закрепите ее на месте, приклеив лапы и нос к столу скотчем.
4. Опрыскайте вентральную поверхность мыши 70% этанолом и вытрите избыток этанола.
5. Поднимите брюшную кожу мыши щипцами в месте расположения мочевого пузыря и разрезайте по средней линии хирургическими ножницами, двигаясь выше шейного отдела, обнажая трахею.
6. Поднимите подстилающей фасциальный слой пинцетем и разрезайте хирургическими ножницами, чтобы обнажить висцеральные органы и медиастинальный компартмент, снова разрезая ниже верхнего.
7. Отрежьте грудину по средней линии, чтобы обнажить сердце и легкие.
8. Используя тупое рассечение, отделяют диафрагму от печени и брюшного отсека.
9. Найдите нижнюю полую вену (IVC) под кишечником и отрежьте IVC.
10. Найдите нужный желудочек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Правый желудочек будет иметь более светлый вид по сравнению с левым желудочком, и внутрижелудочковая перегородка должна быть визуализирована, отделяя правый желудочек от левого желудочка.
11. Вводят 0,5 мл 1% фракционированного гепарина в правый желудочек иглой бабочки 25-30 г, а затем медленно, но неуклонно смывают 10-15 мл 1x PBS(рисунок 1A).
    1. Соблюдайте осторожность, чтобы не вводить иглу через сердце и вводить гепарин в полость средостения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция 1x PBS делает легочную ткань белой. Жидкость, экстравазируя из брюшной аорты, должна быть прозрачной и бесцветной, а печень может стать белой на вид после успешного гиперемия.
12. Найдите гортань и рассекайте окружающую фасцию и ткань с помощью тупого пинцета.
13. Наложите хирургический шов под трахею и свободно завяжите хирургический узел.
14. Поместите небольшое отверстие в трахее выше струны и канулируйте с помощью 20 г тупой иглы.
15. Затяните шов вокруг иглы и трахеи с помощью хирургического узла.
16. Вводят 2,5-4 мл агарозы в трахею и контролируют инфляцию легких.
17. После того, как агароза закапывается, льют холодным, охлажденным 1x PBS над легким, чтобы затвердеть агарозу.
18. Разрезать трахею выше хирургического шва и рассечь легкие и сердце от средостения путем удаления любых спаек и фасций.
19. После затвердевания поместите в 1x DMEM (достаточно, чтобы погрузить ткань) в чашку Петри, чтобы держать на льду. Немедленно разрезайте одну мякоть с помощью вибратомной машины(рисунок 1B).

3. Прецизионная резка легких ломтиков

1. Прикрепите образец к платформе с помощью суперклея, удерживая медиальную сторону образца лицом вверх.
2. Заполните контейнер для образцов 1x PBS, убедив, что образец полностью погружен.
3. Заполните контейнер, окружающий контейнер с образцами, льдом, чтобы сохранить окружающий PBS и образец холодными.
4. Включите вибратом и отрегулируйте нужные настройки ниже.
   1. Установите толщину 300м.
   2. Установите частоту 100 Гц.
   3. Установите амплитуду 0,6 мм.
   4. Установите скорость 5 мкм/с.
5. Используя гаечный ключ Allen, поверните держатель лезвия в безопасное положение и откройте челюсти, чтобы вставить лезвие.
6. Затяните челюсти гаечным ключом Аллена и поверните держатель лезвия в соответствующее положение для нарезки.
7. Поместите образец и платформу на коробку и скользите перед лезвием.
8. Заполните поле вокруг платформы образца 1x PBS, пока образец не будет погружен.
9. Поднесите лезвие вибратома к краю блока и вручную опустите лезвие до тех пор, пока оно не сравняется с верхней частью образца.
10. Подтвердите соответствующие настройки и запустите вибратом(рисунок 2).
11. Когда свежие ломтики будут нарезаны, извлеките образцы из PBS и поместите их в стерильную чашку Петри с 10 мл 1x DMEM, содержащей 1x антибиотик-антимикотик.
12. Когда закончите, полностью втяните лезвие, а затем используйте гаечный ключ Allen, чтобы поднять лезвие в безопасное положение.
13. Храните образцы в 1x DMEM в инкубаторе при 37 °C с сохранением жизнеспособности до 10 дней (см. эксперимент по жизнеспособности ниже).

4. Пример сосудосуживляющее эксперимента

1. Поместите срез вибратома на слайд микроскопа.
2. Прежде чем поместить его на слайд, используйте чистящую салфетку, чтобы избавиться от лишней среды (PBS).
3. Поместите образец под фазоконтрастную микроскопию и используйте 10-20-кратное увеличение для идентификации сосуда.
4. Поместите 500 мкл сосудосуживающих средств, таких как 60 мМ KCl или 1 мкМ эндотелина-1, чтобы полностью погрузить затвор.
5. Наблюдайте и захватывайте видео, записывая в течение 30 с-60 с(Видео 1).

5. Подготовка ткани к РНК или белковой лизисе на PCLS

1. Перед началом эксперимента заполните небольшую пенополистирольный коробочка 1 л жидкого азота.
2. Перед запуском поместите две небольшие микроцентрифужные трубки (1,5 мл) в емкость с жидким азотом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкий азот должен охлаждаться снаружи трубок, однако не должен быть внутри. Обязательно бережно обращаетесь с жидким азотом и не подвергайте кожу воздействию жидкого азота. Используйте щипцы и перчатки, чтобы поместить и извлечь трубки из коробки.
3. Поместите 4-5 свежих ломтиков вибратома в ступку.
4. Вылейте 5-10 мл жидкости N2 поверх ломтиков в ступке.
5. Быстро используйте пестик для измельчения ломтиков замораживания в порошок до того, как жидкий азот испарится.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ткань должна конденсироваться в мелкий порошок. Если нет, добавьте дополнительный жидкий азот до тех пор, пока это не будет достигнуто.
6. Используя стальной лабораторный совок (предварительно охлажденный жидким азотом), зачерпните порошок в две охлажденные микроцентрифужные трубки.
7. Лизируйте порошок путем добавления 500 мкл реагента экстракции РНК для продолжения выделения РНК или 500 мкл буфера RIPA (содержит 1x ингибиторов протеазы), чтобы продолжить лизис белка.
8. Храните образцы при -80 °C до дополнительной изоляции РНК, измерения BCA и вестерн-блотт.

6. Определение жизнеспособности

1. После приготовления вибратома поместите два среза легких в 24-луночную культурную пластину с 450 мкл среды DMEM и 50 мкл реагента жизнеспособности клеток (убедитесь, что ткань полностью погружена).
2. Поместите образцы обратно в 5% CO₂ при 37 °C инкубаторе на ночь с минимальным воздействием света.
3. Утром наблюдают раствор для изменения цвета. Синий раствор становится розовым, когда ткань жизнеспособна.

7. Сохранение маркировки клеток

1. Лечить трансгенный Cdh5-CreERT2, скрещенный с мышью Ai14 tdTomato, с помощью IP-инъекции Тамоксифена (2 мг / сут) в течение в общей сложности 5 дней (общая доза 10 мг Тамоксифена), чтобы индуцировать метки tdTomato Cre положительные клетки.
2. Через неделю после инъекции подготовьте легкие, используя вышеуказанные шаги 1-3.
3. После приготовления прецизионного разрезанного среза легкого поместите ткань на слайд микроскопа и поместите крышку поверх ткани.
4. Используйте конфокальный микроскоп для обнаружения окрашивания tdTomato (с использованием длины волны возбуждения 555 нм).

Результаты

При добавлении к клеткам или тканям реагент жизнеспособности модифицируется восстанавливающей средой жизнеспособной ткани и становится розовым / красным, становясь высокофлуоресцентным. Репрезентативные изменения цвета, обнаруженные с 0-1 и 9-10 дня, демонстрируются на рису...

Обсуждение

В этой рукописи описан усовершенствованный метод получения изображений легочной ткани мыса с высоким разрешением, который сохраняет сосудистую структуру и оптимизирует экспериментальную гибкость, в частности с использованием применения PCLS для получения микросрезов легочной ткани, ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G