Corte de precisão Fatias pulmonares como uma ferramenta eficiente para ex vivo estrutura de vasos pulmonares e estudos de contratibilidade

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para preservar a contração vascular do tecido pulmonar murino PCLS, resultando em uma imagem tridimensional sofisticada da vasculatura pulmonar e das vias aéreas, que pode ser preservada por até 10 dias suscetíveis a inúmeros procedimentos.

Resumo

A visualização do tecido pulmonar murino fornece informações estruturais e celulares valiosas sobre as vias aéreas subjacentes e a vasculatura. No entanto, a preservação de vasos pulmonares que realmente representam condições fisiológicas ainda apresenta desafios. Além disso, a delicada configuração dos pulmões murinos resulta em desafios técnicos na preparação de amostras para imagens de alta qualidade que preservam tanto a composição celular quanto a arquitetura. Da mesma forma, ensaios de contrailidade celular podem ser realizados para estudar o potencial das células para responder aos vasoconstritores in vitro,mas esses ensaios não reproduzem o ambiente complexo do pulmão intacto. Em contraste com essas questões técnicas, o método de corte de precisão da fatia pulmonar (PCLS) pode ser aplicado como uma alternativa eficiente para visualizar o tecido pulmonar em três dimensões sem viés regional e servir como um modelo de contração de substituto vivo por até 10 dias. Tecido preparado com PCLS tem estrutura preservada e orientação espacial, tornando-se ideal para estudar processos de doença ex vivo. A localização de células etiquetadas tdTomato endógenas em PCLS colhidas a partir de um modelo de murina tdTomato indutível pode ser visualizada com sucesso por microscopia confocal. Após a exposição aos vasoconstritores, o PCLS demonstra a preservação tanto da contração do vaso quanto da estrutura pulmonar, que pode ser capturada por um módulo de lapso de tempo. Em combinação com os outros procedimentos, como a análise da mancha ocidental e do RNA, o PCLS pode contribuir para a compreensão abrangente das cascatas sinalizadoras que sustentam uma ampla variedade de distúrbios e levam a uma melhor compreensão da fisiopatologia em doenças vasculares pulmonares.

Introdução

Avanços na preparação e imagem do tecido pulmonar que preserva componentes celulares sem sacrificar a estrutura anatômica fornecem uma compreensão detalhada das doenças pulmonares. A capacidade de identificar proteínas, RNA e outros compostos biológicos, mantendo a estrutura fisiológica, oferece informações vitais sobre o arranjo espacial das células que podem ampliar a compreensão da fisiopatologia em inúmeras doenças pulmonares. Essas imagens detalhadas podem levar a uma melhor compreensão de doenças vasculares pulmonares, como a hipertensão arterial pulmonar, quando aplicadas a modelos animais, potencialmente levando a melhores estratégias terapêuticas.

Apesar dos avanços tecnológicos, a obtenção de imagens de alta qualidade do tecido pulmonar murino continua sendo um desafio. O ciclo respiratório é impulsionado por uma pressão intratorácica negativa gerada durante a inalação¹. Ao tradicionalmente obter biópsias e preparar amostras pulmonares para imagem, o gradiente de pressão negativa é perdido resultando no colapso das vias aéreas e da vasculatura, que não se representa mais em seu estado atual. Para alcançar imagens realistas refletindo as condições atuais, as vias aéreas pulmonares devem ser reinfladas, e a vasculatura perfundida, transformando o pulmão dinâmico em uma luminária estática. A aplicação dessas técnicas distintas permite a preservação da integridade estrutural, vasculatura pulmonar e componentes celulares, incluindo células imunes, como macrófagos, permitindo que o tecido pulmonar seja visto o mais próximo possível de seu estado fisiológico.

O corte de precisão do corte pulmonar (PCLS) é uma ferramenta ideal para estudar a anatomia e a fisiologia da vasculatura pulmonar². O PCLS fornece imagens detalhadas do tecido pulmonar em três dimensões, preservando componentes estruturais e celulares. O PCLS tem sido usado em modelos animais e humanos para permitir imagens vivas e de alta resolução de funções celulares em três dimensões, tornando-se uma ferramenta ideal para estudar potenciais alvos terapêuticos, medir a contração das pequenas vias aéreas e estudar a fisiopatologia de doenças pulmonares crônicas como DPOC, ILD e câncer de pulmão³. Utilizando técnicas semelhantes, a exposição de amostras de PCLS a vasoconstritores pode preservar a estrutura pulmonar e a contratilidade do vaso, replicando condições in vitro. Juntamente com a preservação da contratilidade, as amostras preparadas podem passar por análises adicionais, como sequenciamento de RNA, mancha ocidental e citometria de fluxo quando preparadas corretamente. Finalmente, as células rotuladas de cor repórter marcadas com fluorescência tdTomato após a colheita pulmonar podem preservar a rotulagem após o preparo de microslices, tornando-a ideal para estudos de rastreamento celular. A integração dessas técnicas proporciona um modelo sofisticado preservando o arranjo espacial das células e da contratude dos vasos que podem levar a uma compreensão mais detalhada das cascatas sinalizadoras e potenciais opções terapêuticas na doença da vasculatura pulmonar.

Neste manuscrito, o tecido pulmonar murino PCLS é exposto a vasoconstritores, demonstrando integridade estrutural preservada e contratlidade do vaso. O estudo demonstra que o tecido preparado e manuseado adequadamente pode permanecer viável por 10 dias. O estudo também demonstra a preservação de células com fluorescência endógena (tdTomato), permitindo que as amostras forneçam imagens de alta resolução da vasculatura pulmonar e da arquitetura. Finalmente, foram descritas formas de manusear e preparar fatias de tecido para a medição do RNA e da mancha ocidental para investigar mecanismos subjacentes.

Protocolo

Todos os cuidados com animais estavam de acordo com as diretrizes do Hospital Infantil de Boston e do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais aprovou protocolos. Os camundongos utilizados neste estudo são ratos do tipo selvagem C57/B6 e camundongos cruzados Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Preparação de soluções

1. Prepare a solução tampão fosfato (1x PBS) e a solução de 2% de agarose necessária durante o experimento com antecedência.
   1. Misture 2 g de pó de agarose em 100 mL de água autoclavada. Aqueça-o no micro-ondas alguns segundos de cada vez até que a solução esteja clara.
   2. Coloque a solução em um banho de água a 42 °C até usar.
      NOTA: Tanto o PBS quanto a 2% de agarose podem ser armazenados à temperatura ambiente por semanas.

2. Extração do pulmão do camundongo

1. Eutanize o rato por overdose de isoflurane. Obter overdose de isoflurane colocando uma pequena quantidade de isoflurane no papel de tecido no nível inferior e colocando o rato no nível superior em um dessecador. O rato permanece no desiccator até inconsciente.
2. Certifique-se da morte do mouse aplicando pressão inferior no pescoço e puxando caudal na cauda. Leve o mouse para a superfície de dissecação.
3. Coloque o mouse na posição supina e fixe-o no lugar batendo patas e nariz à mesa com fita adesiva.
4. Pulverize a superfície ventral do mouse com 70% de etanol e limpe o excesso de etanol.
5. Levante a pele abdominal do camundongo com fórceps na localização da bexiga e corte na linha média com uma tesoura cirúrgica, movendo-se superiormente para a região cervical, expondo a traqueia.
6. Levante a camada fascial subjacente com pinças e corte com tesoura cirúrgica para expor órgãos viscerais e compartimento mediastinal, cortando novamente inferiormente para superior.
7. Corte o esterno no meio da linha para expor o coração e o pulmão.
8. Usando dissecção sem cortes, retire o diafragma do fígado e do compartimento abdominal.
9. Localize a veia cava inferior (IVC) sob os intestinos e corte o IVC.
10. Localize o ventrículo direito.
    NOTA: O ventrículo direito terá uma aparência mais leve em comparação com o ventrículo esquerdo e o septo intraventricular deve ser visualizado, separando o ventrículo direito do ventrículo esquerdo.
11. Injete 0,5 mL de heparina fracionada de 1% no ventrículo direito com uma agulha borboleta de 25-30 G e depois lave lentamente, mas firmemente com 10-15 mL de 1x PBS(Figura 1A).
    1. Tenha cuidado para não inserir a agulha através do coração e injetar heparina na cavidade mediastinal.
       NOTA: A injeção de 1x PBS torna o tecido pulmonar branco. O fluido extravasado da aorta abdominal deve ser claro e incolor e o fígado pode ficar branco na aparência após o sucesso da descarga.
12. Localize a laringe e disseque a fáscia e o tecido ao redor usando pinças de ponta cega.
13. Coloque a sutura cirúrgica sob a traqueia e amarre um nó cirúrgico.
14. Coloque um pequeno orifício na traqueia superior à corda e canulate com agulha de 20 G sem corte.
15. Aperte a sutura ao redor da agulha e da traqueia usando um nó cirúrgico.
16. Injete 2,5-4 mL de agarose na traqueia e monitore a inflação do pulmão.
17. Depois que a agarose é incutida, despeje frio, resfriado 1x PBS sobre o pulmão para solidificar a ágarose.
18. Corte a traqueia superior à sutura cirúrgica e disseque o pulmão e o coração do mediastino removendo quaisquer aderências e fáscia.
19. Após a solidificação, coloque em 1x DMEM (suficiente para submergir tecido) em uma placa de Petri para manter no gelo. Corte imediatamente um lobo usando uma máquina de vibratome(Figura 1B).

3. Cortes de precisão de fatias pulmonares

1. Conecte a amostra à plataforma com supercola, mantendo o lado medial da amostra voltado para cima.
2. Encha o recipiente de amostra com 1x PBS, garantindo que a amostra esteja completamente submersa.
3. Encha o recipiente ao redor do recipiente de amostra com gelo para manter o PBS circundante e prove frio.
4. Ligue o vibratome e ajuste-se às configurações desejadas abaixo.
   1. Coloque a espessura em 300um.
   2. Defina a frequência para 100 Hz.
   3. Defina a amplitude para 0,6 mm.
   4. Defina a velocidade para 5 μm/s.
5. Usando uma chave Allen, gire o suporte da lâmina na posição segura e abra as mandíbulas para inserir uma lâmina.
6. Aperte as mandíbulas com uma chave Allen e gire o suporte da lâmina na posição apropriada para cortar.
7. Coloque a amostra e a plataforma sobre a caixa e deslize na frente da lâmina.
8. Encha a caixa ao redor da plataforma de amostra com 1x PBS até que a amostra esteja submersa.
9. Leve a lâmina vibratome até a borda do bloco e baixe manualmente a lâmina até que esteja mesmo com a parte superior da amostra.
10. Confirme as configurações apropriadas e execute o vibratome(Figura 2).
11. À medida que as fatias frescas são cortadas, remova as amostras do PBS e coloque-as em uma placa de Petri estéril com 10 mL de 1x DMEM contendo 1x antibiótico-antimíctico.
12. Quando terminar, retraia a lâmina inteiramente e, em seguida, use a chave Allen para levantar a lâmina em uma posição segura.
13. Armazene as amostras em 1x DMEM em uma incubadora a 37 °C com viabilidade preservada por até 10 dias (veja experiência de viabilidade abaixo).

4. Exemplo de experimento vasoconstritor

1. Coloque uma fatia de vibratome em um slide de microscópio.
2. Antes de colocá-lo no slide, use uma limpeza para se livrar do meio de excesso (PBS).
3. Coloque a amostra sob microscopia de contraste de fase e use ampliação de 10-20x para identificar um vaso.
4. Coloque 500 μL de vasoconstritores, como 60 mM KCl ou 1 μM Endothelin-1 para submergir completamente o slide.
5. Observe e capture o vídeo gravando para 30 s-60 s(Vídeo 1).

5. Preparando o tecido para RNA ou lise proteica no PCLS

1. Antes de começar o experimento, encha uma pequena caixa de espuma de poliestireno com 1 L de nitrogênio líquido.
2. Coloque dois pequenos tubos de microcentrifuutura (1,5 mL) no recipiente com nitrogênio líquido antes de iniciar.
   NOTA: O nitrogênio líquido deve esfriar fora dos tubos, no entanto, não estar dentro. Certifique-se de manusear nitrogênio líquido com cuidado e não exponha a pele a nitrogênio líquido. Use fórceps e luvas para colocar e remover tubos da caixa.
3. Coloque 4-5 fatias frescas de vibratome em uma tigela de argamassa.
4. Despeje 5-10 mL de líquido N2 em cima das fatias na tigela de argamassa.
5. Use rapidamente o pilão para moer as fatias de congelamento de flash em pó antes que o nitrogênio líquido evapore.
   NOTA: O tecido deve condensar em um pó fino. Se não, adicione nitrogênio líquido adicional até ser alcançado.
6. Usando um scooper de laboratório de aço (pré-eded com nitrogênio líquido), colher o pó nos dois tubos de microcentrifuuge refrigerados.
7. Lise o pó adicionando 500 μL de reagente de extração de RNA para prosseguir com o isolamento de RNA ou 500 μL de tampão RIPA (contém 1x inibidores de protease) para prosseguir com a lise proteica.
8. Armazene as amostras a -80 °C até o isolamento adicional do RNA, medição de BCA e mancha ocidental.

6. Determinando a viabilidade

1. Após a preparação do vibratome, coloque duas fatias pulmonares em uma placa de cultura de 24 poços com 450 μL de mídia DMEM e 50 μL de reagente de viabilidade celular (certifique-se de que o tecido está totalmente submerso).
2. Coloque as amostras de volta em 5% de CO₂ a 37 °C da incubadora durante a noite com exposição mínima à luz.
3. Pela manhã, observe a solução para a mudança de cor. A solução azul fica rosa quando o tecido é viável.

7. Preservação da rotulagem celular

1. Trate um Cdh5-CreERT2 transgênico cruzado com o mouse Ai14 tdTomato com uma injeção IP de Tamoxifen (2 mg/dia) por um total de 5 dias (dose total de 10 mg tamoxifen) para induzir células positivas de rótulo TdTomato.
2. Uma semana após a injeção, prepare os pulmões usando os passos acima 1 a 3.
3. Após a preparação da fatia pulmonar cortada com precisão, coloque o tecido em uma lâmina de microscópio e coloque uma mancha de cobertura em cima do tecido.
4. Use um microscópio confocal para detectar a coloração do TdTomato (usando comprimento de onda de excitação 555 nm).

Resultados

Quando adicionado às células ou tecidos, o reagente de viabilidade é modificado pelo ambiente redutor do tecido viável e fica rosa/vermelho, tornando-se altamente fluorescente. As alterações de cor representativas detectadas a partir do dia 0-1 e do dia 9-10 são demonstradas na Figura 3. Como observado, a solução começou azul e ficou rosa da noite para o dia, demonstrando viabilidade. A mudança de cor normalmente ocorre dentro de 1-4 h; no entanto, um tempo maior pode ser necessá...

Discussão

Neste manuscrito, descreve-se um método aprimorado para produzir imagens de alta resolução do tecido pulmonar murino que preserva a estrutura vascular e otimiza a flexibilidade experimental, utilizando especificamente a aplicação do PCLS para obter microsapos de tecido pulmonar que podem ser visualizados em três dimensões com contrariedade preservada da vasculatura. Usando o reagente de viabilidade, o protocolo demonstra que fatias cuidadosamente preparadas e preservadas podem reter viabilidade por mais de uma sem...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5cc of fractionated heparin in syringe	BD	100 USP units per mL
1X PBS	Corning	21-040-CM
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation	Cml Supply	90120050D
30cc syringe	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Automated vibrating blade microtome	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocal	Zeiss	880
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortar and Pestle	Amazon
RIPA lysis and extraction buffer	Thermoscientific	89900
Surgical suture 6/0	FST	18020-60
TRIzol Reagent	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G	BD	25-30G