في فيفو تصوير فوتونين لخلايا ميجاكاريوسيت وبروبليتس في نخاع عظم جمجمة الفأر

Alicia Bornert; Fabien Pertuy; François Lanza; Christian Gachet; Catherine Léon

doi:10.3791/62515

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

نحن نصف هنا طريقة تصوير الخلايا الضخمة واللوحات في نخاع عظم الجمجمة للفئران الحية باستخدام المجهر ثنائي فوتون.

Abstract

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة الخلايا العملاقة ، وهي خلايا متخصصة تقع في نخاع العظام. تم وصف إمكانية تصوير الخلايا الضخمة في الوقت الحقيقي وبيئتهم الأصلية منذ أكثر من 10 سنوات وتلقي ضوءا جديدا على عملية تكوين الصفائح الدموية. تمتد الخلايا الضخمة نتوءات ممدودة ، تسمى الصفائح ، من خلال البطانة البطانية للأوعية الجيبية. تقدم هذه الورقة بروتوكولا للصورة المتزامنة في الوقت الحقيقي للخلايا الضخمة المسماة بالفلورسنت في نخاع عظم الجمجمة والأوعية الجيبية. تعتمد هذه التقنية على جراحة بسيطة تحافظ على الجمجمة سليمة للحد من ردود الفعل الالتهابية. يتم شل رأس الماوس مع حلقة لصقها على الجمجمة لمنع الحركات من التنفس.

باستخدام المجهر ثنائي الفوتون ، يمكن تصور الخلايا الضخمة لمدة تصل إلى بضع ساعات ، مما يتيح مراقبة نتوءات الخلايا واللوحات الأولية في عملية الاستطالة داخل الأوعية الجيبية. وهذا يسمح للقياس الكمي لعدة معلمات تتعلق مورفولوجيا نتوءات (العرض والطول ووجود مناطق الانقباض) وسلوك استطالة (السرعة والانتظام ، أو وجود وقفات أو مراحل التراجع). تسمح هذه التقنية أيضا بالتسجيل المتزامن للصفائح الدموية المتداولة في الأوعية الجيبية لتحديد سرعة الصفائح الدموية واتجاه تدفق الدم. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص لدراسة دور الجينات ذات الاهتمام في تكوين الصفائح الدموية باستخدام الفئران المعدلة وراثيا وهي أيضا قابلة للاختبار الدوائي (دراسة الآليات وتقييم الأدوية في علاج اضطرابات إنتاج الصفائح الدموية). وقد أصبح أداة لا تقدر بثمن، وخاصة لاستكمال الدراسات المختبرية كما هو معروف الآن أن في الجسم الحي وفي المختبر تشكيل البربليتليت تعتمد على آليات مختلفة. وقد ثبت، على سبيل المثال، أن هناك حاجة إلى microtubules في المختبر لاستطالة proplatelet في حد ذاتها. ومع ذلك ، في الجسم الحي، فإنها تعمل بدلا من ذلك سقالة ، ويجري تعزيز الاستطالة بشكل رئيسي من قبل قوات تدفق الدم.

Introduction

يتم إنتاج الصفائح الدموية بواسطة خلايا متخصصة في الخلايا الضخمة الموجودة في نخاع العظام. ظلت الطريقة الدقيقة لإطلاق الخلايا الضخمة الصفائح الدموية في الدورة الدموية غير واضحة منذ فترة طويلة بسبب التحدي التقني في مراقبة الأحداث في الوقت الحقيقي من خلال العظام. وقد ساعد المجهر ثنائي فوتون في التغلب على هذا التحدي وأدى إلى تقدم كبير في فهم عملية تكوين الصفائح الدموية. أول في الجسم الحي megakaryocyte الملاحظات التي أدلى بها فون أندريان وزملاؤه في عام 2007 ، مع تصور megakaryocytes الفلورسنت من خلال الجمجمة¹. وكان ذلك ممكنا لأن طبقة العظام في الجمجمة الأمامية للفئران البالغة الشباب لديها سمك بضع عشرات من الميكرونات وشفافة بما فيه الكفاية للسماح تصور الخلايا الفلورية في نخاع العظام الكامنة².

الدراسات التي تلت ذلك تطبيق هذا الإجراء لتقييم تشكيل البروبليت في ظل ظروف مختلفة وفك الآليات الأساسية³^،⁴^،⁵^،⁶. قدمت هذه الدراسات دليلا قاطعا على أن الخلايا العملاقة توسع بشكل ديناميكي نتوءات ، تسمى الصفائح ، من خلال الحاجز البطاني للأوعية الجيبية(الشكل 1). ثم يتم تحرير هذه الصفائح الدموية كشظايا طويلة تمثل عدة مئات من الصفائح الدموية في الحجم. سيتم تشكيل الصفائح الدموية بعد إعادة عرض الصفائح في دوران الأوعية الدقيقة لأعضاء المصب ، ولا سيما في الرئتين⁷. غير أن العملية الدقيقة والآليات الجزيئية لا تزال حتى الآن موضع نقاش. على سبيل المثال ، يختلف الدور المقترح للبروتينات الهيكل الخلوي في استطالة الصفائح الدموية بين المختبر وفي ظروف الجسم الحي ³، وقد أظهرت الاختلافات في تكوين البروبليتليت في ظل الظروف الالتهابية⁶. ومما يزيد الأمور تعقيدا، أن دراسة حديثة اعترضت على المفهوم القائم على البربليتليت واقترحت أنه في الجسم الحي،تتشكل الصفائح الدموية بشكل أساسي من خلال آلية ناشئة عن الأغشية على مستوى الخلايا العملاقة^8.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لمراقبة الخلايا العملاقة واللوحات البربليتية في نخاع العظم من عظم الجمجمة في الفئران الحية ، باستخدام إجراء طفيف التوغل. وقد وصفت نهج مماثلة سابقا لتصور خلايا النخاع الأخرى, لا سيما الجذعية الدموية والخلايا السلف⁹. ينصب التركيز هنا على مراقبة الخلايا الضخمة والصفائح الدموية لتفصيل بعض المعلمات التي يمكن قياسها ، ولا سيما مورفولوجيا الصفائح الدموية وسرعة الصفائح الدموية. يقدم هذا البروتوكول كيفية إدخال قسطرة في الوريد الوداجي لحقن المقتفيات الفلورية والمخدرات ومراقبة من خلال عظم الجمجمة. يتم الكشف عن عظم الجلجلة باستخدام جراحة بسيطة بحيث يتم لصقها على حلقة إلى العظام. يعمل هذا الخاتم على شل حركة الرأس ومنع الحركات بسبب التنفس وتشكيل كوب مليء بالمحلول الملحي كوسيلة غمر للعدسة. هذه التقنية هي مناسبة تماما ل i) مراقبة في الوقت الحقيقي هندسة الجيوب الأنفية وmegakaryocytes التفاعل مع جدار السفينة. ii) اتبع megakaryocytes في عملية تشكيل البروبليت، استطالة، والإفراج؛ و3) قياس حركات الصفائح الدموية لرصد تدفق الدم الجيوب الأنفية المعقدة. البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول تم نشرها مؤخرا³.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمعايير الأوروبية 2010/63/EU ولجنة CREMEAS المعنية بأخلاقيات التجارب الحيوانية في جامعة ستراسبورغ (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg، اتفاق مرفق الحيوان N°: G67-482-10، اتفاق المشروع N°: 2018061211274514).

1. إعداد الفئران وإدخال قسطرة في الوريد الوداجي

ملاحظة: هنا، ذكر أو أنثى، 5-7 أسابيع من العمر mTmG الفئران مراسل استخدمت (B6.129 (CG)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato،-EGFP)Luo10)}عبرت مع الفئران Pf4-cre^11،مما يسمح مكثفة الفلورسينس الأخضر وضع العلامات في الخلايا الضخمة والصفائح الدموية¹². قبل بدء التجربة، سخني غرفة التدفئة في المجهر لبضع ساعات.

نقل الماوس إلى غرفة التصوير والمضي قدما إلى التخدير.
1. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق (أي p.) من محلول الكيتامين (الكيتامين (100 ميكروغرام / غرام) وإكسيلازين (10 ميكروغرام / غرام) (5 ميكرولتر / غرام).
  ملاحظة: يستخدم الإدارة المتكررة للكيتامين / xylazine هنا ويعمل بشكل جيد ولكن يتطلب انقطاع التسجيل لإعادة التكفير العادية. بدلا من ذلك، إذا كان جهاز التخدير متوفرا، يمكن إجراء تحريض التخدير مع الكيتامين / الإكسيلازين والحفاظ عليه لاحقا تحت استنشاق الغازات (خليط من الأيزوفلوران والهواء والأوكسجين).
2. استبدل الحيوان في قفصه حتى يصل إلى تخدير عميق. ضع الماوس على لوحة ساخنة ساخنة عند 37 درجة مئوية لجميع التلاعبات اللاحقة.
  ملاحظة: بينما يصل الحيوان إلى التخدير العميق، قم بتشغيل المجهر وجميع المعدات (انظر القسم 4.1) وإعداد المعلمات المختلفة اللازمة (انظر القسم 4.2) لبدء التجربة بمجرد إجراء الجراحة. هنا، الإجراء يستمر فقط 3 ساعة وهو محطة. يتم قتل الفأر بعد التجربة دون الاستيقاظ. وبالتالي ، فإن تطهير الإيثانول للبشرة والأدوات يكفي. ومع ذلك ، اعتمادا على المبادئ التوجيهية المؤسسية ، أو إذا كان الإجراء سيستمر لفترة أطول ، يجب استخدام طرق تطهير أكثر اكتمالا مثل ثلاثة فرك بالتناوب مع بيتادين / بوفيدوني والكحول.
تثبيت قسطرة في الوريد الوداجي.
ملاحظة: من المهم تجنب التلوث الميكروبي أثناء الجراحة قدر الإمكان. احرص على تطهير الجلد بعناية باستخدام الإيثانول بنسبة 70٪ (EtOH) قبل الشروع في الجراحة. استخدم دائما المقص المعقم والملاقط، وشطفها بانتظام بنسبة 70٪ EtOH. العمل في مكان نظيف، وارتداء قناع الوجه. يتم استخدام قسطرة 22 G "فوق الإبرة" ، تتكون من إبرة داخل أنبوب بلاستيكي ، للحقن الوريدي (انظر جدول المواد).
1. ضع الماوس على ظهره، وإصلاح الساقين الأمامية مع الشريط الجراحي لتمتد الحلق(الشكل 2A). تطهير الحلق مع الإيثانول 70٪.
  ملاحظة: للراحة، قد يتم حلق الحلق قبل الجراحة. إذا استمر الإجراء لفترة أطول ، فيجب إجراء حلاقة دقيقة لتقنية العقيم المناسبة.
2. قم بعمل شق 0.7-1 سم على الوريد الوداجي الأيمن أو الأيسر باستخدام مقص معقم. تمتد النسيج الضام المجاورة لفضح الوريد الوداجي الخارجي وأعلى العضلات الصدرية (الشكل 2A).
3. ملء القسطرة مع الحارة، والملوحة الفسيولوجية العقيمة. أدخل القسطرة في الوريد بعد اختراق العضلات الصدرية (الشكل 2B).
  ملاحظة: الحرص على تجنب فقاعات الهواء داخل القسطرة. من المهم إدخال القسطرة من خلال العضلات لمنع النزيف حيث ستشكل العضلات نقطة ضغط. حتى الفئران التي تعاني من عيوب في الهموستاسي، مثل Itgb3^-/- الفئران، لا تنزف عند إدخال القسطرة مع هذا النهج.
4. قم بإزالة الإبرة برفق، وإذا لزم الأمر، قم بتحريك القسطرة بعناية إلى عمق الوريد. ربط حقنة وتحقيق الاستقرار في القسطرة عن طريق إضافة قطرة من الغراء الجراحية (جدول المواد).
  ملاحظة: من الممكن إدخال قسطرة داخل الوريد الذيل، على الرغم من أنه يتطلب بعض الممارسة لأن الوريد لديه عيار أصغر. هذا أمر صعب بشكل خاص عند استخدام الفئران ذات الشعر الداكن ، والتي لا يكاد يكون وريد ذيلها مرئيا. نظرا لعيارها الأكبر ، قد يسمح وضع القسطرة داخل الوريد الوداجي بحقن كميات أكبر أو علاجات متكررة بشكل أكثر موثوقية. يرجى ملاحظة أن الحقنة يتم ملؤها في المرة الأولى بالمحلول الملحي الدافئ ، ولا تنسى حقن الحجم الميت قبل حقن محلول الدواء.
5. إعادة الماوس بعناية إلى موضع عرضة(الشكل 2C). تطبيق هلام (جدول المواد) على العينين لمنع جفاف.

2. جراحة وتركيب حلقة الجمجمة

ملاحظة: الدعم الكامل لتركيب الماوس يتكون من 4 قطع، كتلة ولوحة، حلقة لعقد رأس الماوس، ومسمار لإصلاح حلقة إلى كتلة(الشكل 3A). تم الحصول على كافة عناصر الدعم من i.materialise.com بواسطة الطباعة ثلاثية الأبعاد. يتكون الطبق من أكريلونتريل بوتاديين ستايرين (ABS) البوليمر، كتلة والمسمار من الفولاذ المقاوم للصدأ، وحلقة من الفولاذ المقاوم للصدأ عالية الجودة (الفولاذ المقاوم للصدأ عالية التفصيل) (انظر الشكل التكميلي S1 للأبعاد والمواد التكميلية لملفات الطباعة 3D). يتم إصلاح الكتلة بشكل دائم إلى الدعم ، إما مشدود أو لصقها. مرة واحدة يتم إصلاح الحلقة على الجمجمة الماوس، ينبغي أن يكون ثمل إلى حامل كتلة(الشكل 3A).

ترطيب الشعر على فروة الرأس مع منشفة ورقية مبللة مع الإيثانول 70٪ للتطهير. إزالة كل الشعر فضفاضة مع منشفة ورقية مبللة.
ملاحظة: للراحة، قد يتم حلق فروة الرأس قبل الجراحة.
قطع فروة الرأس عن طريق تشكيل T في خط الوسط تصل إلى 1 سم وبين الأذنين لفضح الجلجلة باستخدام مقص غرامة معقمة وملاقط.
ملاحظة: سيتم وضع الحلقة لتداخل العظام الأمامية والبارية(الشكل 3B).
استخدام ملاقط معقمة لفضح الجمجمة. إزالة بعناية periosteum مع مقص وملاقط. استخدم مسحة قطنية معقمة غارقة في المالحة الفسيولوجية لإزالة جميع البيريوستيوم وأي حطام أو شعر ، مما قد يغير التصوير.
ملاحظة: للحد من ردود الفعل الالتهابية، يجب الحرص الشديد على عدم تلف العظام.
إزالة أي آثار الدم عن طريق الشطف مع المالحة، وتجفيف العظام بسرعة مع مسحة القطن الجاف. تطبيق هلام الغراء على الحلبة، وضعه على العظام المكشوفة، والحفاظ عليه لبضع ثوان بحيث يتم إرفاق الحلقة بقوة إلى الجمجمة.
ملاحظة: لا يجب إدخال الغراء في مجال المراقبة لأنها قد تؤدي إلى autofluorescence غير مرغوب فيه.
ترطيب طفيفة الجمجمة مع مسحة القطن مغمورة في المالحة الفسيولوجية.
إعداد عجينة الأسنان السيليكون عن طريق خلط بعناية 1:1 المكونات الزرقاء والصفراء. تطبيق معجون الأسنان في جميع أنحاء الحلبة لختم لمنع التسرب أثناء التصوير. إزالة بعناية أي عجينة الأسنان أو الغراء التي قد دخلت الحلبة.
ملء الحلبة مع المالحة والتحقق من وجود تسرب.
ملاحظة: المالحة بمثابة وسيط الغمر لهدف المجهر. قد يكون النزيف أكثر أهمية عند استخدام الفئران التي تعاني من عيوب متعلقة بالهموستاسي. من الضروري منع الدم من دخول الحلبة لأنه قد يطمس المزيد من التصوير.
ضع الماوس على الدعم، والمسمار الحلقة على حامل كتلة (الشكل 3C). ضع كمادات مطوية تحت رأس الحيوان لرفع الرأس ومنع انفصال الحلقة عن الجمجمة.
ملاحظة: يتم إصلاح الرأس مباشرة بحيث يمنع حركات الصورة بسبب التنفس.
وضع الدعم وتجميع الماوس في غرفة المجهر ساخنة (الشكل 3D).
ملاحظة: يجب الحرص على عدم إزاحة القسطرة المدرجة في أي وقت.

3. متابعة الفئران المخدرة حتى نهاية التجربة

ملاحظة: يتم إعادة تحريض التخدير كل 35 دقيقة عن طريق تناوب حقن تحت الجلد (s.c.) من الكيتامين (25 ميكروغرام / غرام) في حجم 5 ميكرولتر / غرام وزن الجسم وخليط من الكيتامين (50 ميكروغرام / غرام) وزين (5 ميكروغرام / غرام) (1.2 ميكرولتر / غرام). كما أنه ليس من الممكن لفتح غرفة المجهر ساخنة أثناء الحصول على, يتم إجراء رصد مخدر قبل وبعد إعادة إدارة التخدير عن طريق قرص إصبع القدم. وبالمثل، يتم تنفيذ قرصة إصبع القدم قبل البدء في كل تسجيل فيديو جديد.

إذا لزم الأمر، وقف اكتساب وإعادة حث التخدير عن طريق الحقن s.c.
1. الحرص على عدم تحريك رأس الماوس، قرصة الجلد من الظهر بين الإبهام والسبابة من اليد اليسرى. حقن تحت الجلد مخدر في طية الجلد الخلفي باستخدام اليد اليمنى (أو العكس بالعكس للناس أعسر).
تحقق من وجود المالحة في الحلبة، وإذا لزم الأمر، ملء مع المالحة الطازجة. استمر في التسجيل لمدة 35 دقيقة التالية ، و استمر بالمثل لمدة التسجيل.
في نهاية التجربة، قتل الفأر عن طريق خلع عنق الرحم قبل أن يستيقظ.
ملاحظة: يتم الاحتفاظ بالفأرة مخدرة لمدة أقصاها 3 ساعة، بالاتفاق مع لجنة الأخلاقيات المحلية ورعاية الحيوان.

4. التصوير اثنين من فوتون

ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول المجهر والمعدات ذات الصلة. تم تسجيل الصور باستخدام ماسحة ضوئية رنانة (12 أو 8 كيلوهرتز). تم إعداد الوضع ثنائي الاتجاه لزيادة اكتساب السرعة حيث يتم تسجيل وحدات البكسل في كلا الاتجاهين؛ وبالتالي، يجب تصحيح أي عدم تطابق في المرحلة مع لوحة التحكم "تصحيح المرحلة". وأخيرا، وضع متوسط مكيف كحل وسط بين سرعة الاقتناء ونسبة الإشارة إلى الضوضاء.

قم بتشغيل مجهر الفوتونين، بما في ذلك الليزر والماسح الضوئي الرنانة (طاقة الليزر الناتجة عادة ~ 1.8-2.5 واط اعتمادا على الليزر).
تعيين الطول الموجي الليزر المناسب للفلوروفوريس المختار. تعيين الطول الموجي المناسب لاستعادة الأضواء المنبعثة.
ملاحظة: هنا، تم استخدام الطول الموجي من 913 نانومتر وكاشفات الهجين (500-550 نانومتر و 575-625 نانومتر) لإثارة واكتشاف في وقت واحد AlexaFluor-488 وQtracker-655، على التوالي.
باستخدام القسطرة داخل الشرايين، قم بحقن متتبع الفلورسنت لتسمية الأوعية الدموية (Qtracker-655؛ جدول المواد). حقن 50 ميكرولتر/فأرة من محلول في 0.2 ميكرومتر، تجدد مرة واحدة كل ساعة بحد أقصى 150 ميكرولتر/ تجربة.
ملاحظة: يمكن استخدام التتبعات الأخرى مثل ارتفاع الوزن الجزيئي dextran¹. في هذه الحالة، النظر في أن لزوجة الدم يمكن تغييرها عن طريق dextran وتعديل بعض المعلمات الهيلورفولوجية.
وضع مرحلة المجهر مع الدعم والفأر تحت الهدف من المجهر. تأكد من أن الحلقة مليئة دائما بالمحلول الملحي وتزج الهدف. استخدام epifluorescence لتحديد موقع الأوعية نخاع العظام (الأحمر) ووجود megakaryocytes (الأخضر) الانحياز على طول الأوعية الجيوب الأنفية.
ملاحظة: عظم الجمجمة سمك أقل من 100 ميكرومتر². يقع النخاع تحت العظام ويتم التعرف عليه بسهولة من قبل الخلايا العملاقة الخضراء الفلورية والأوعية الجيوب الأنفية الحمراء الكثيفة التي تحمل اسم Qtracker-655.
عمليات استحواذ طويلة (خلايا عملاقة، صفائح)
1. ابحث عن المنطقة ذات الاهتمام. تطبيق معلمات الحصول على الصورة كما ذكر أعلاه.
2. بالنسبة لعمليات الاستحواذ الطويلة (على سبيل المثال، تصور تكوين البروبليت أو الاستطالة)، احصل على صور z-stack مع فترات زمنية محسنة (عادة بين 0.85 إلى 1.34 ميكرومتر) باستخدام ماسح ضوئي رنان 8 كيلوهرتز.
  ملاحظة: يمكن للماسح الرنانة 12 كيلو هرتز زيادة سرعة الامتلاك.
3. الحصول على صور 384 × 384 بكسل لتصور كامل megakaryocyte والسفينة. استخدام خط المتوسط، على النحو المطلوب، للحصول السريع مع دقة جيدة. تحديد الفاصل الزمني لاقتناء كومة الصورة، عادة 10 s أو 30 s التصور proplatelet.
  ملاحظة: هنا، تم استخدام خط متوسط 8 للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء أعلى، مما سمح بالحصول على صورة واحدة/10 ثانية مع ماسح ضوئي رنانة 8 كيلوهرتز. تأكد من السماح بمتوسط الخط أثناء الاستحواذ المباشر.
اقتناء قصيرة وسريعة (الصفائح الدموية)
ملاحظة: للحصول على أقصر للأحداث السريعة، مثل سرعة الصفائح الدموية، فمن الضروري لتحقيق أقصى قدر من معدل اكتساب الإطار. سيؤدي اختيار نوع الامتلاك المناسب إلى تحسين معدل اكتساب الإطار (أي نوع اكتساب الزمان والمكان "xyt").
1. قلل (على سبيل المثال، 256 × 90 بكسل) واضبط حجم الصورة على السفينة عن طريق تدوير حقل التصوير، إذا لزم الأمر.
2. استخدم أعلى سرعة مسح متاحة.
3. استخدم المسح ثنائي الاتجاه.
  ملاحظة: للمسح ثنائي الاتجاه، تأكد من أن المرحلة تم ضبطها بشكل جيد.
4. تقليل متوسط الخط إلى أدنى حد لإيجاد الحل الوسط الأمثل بين تعريف الصورة وسرعة الاستحواذ.
  ملاحظة: بالنسبة لقياسات سرعة الصفيحات، قد تكون الصورة المنقطة كافية إذا ساعدت على زيادة سرعة الاقتناء.
5. تصغير z-المكدس لزيادة سرعة الاستحواذ. الحصول على 1 فقط z-كومة كافية لقياس سرعة الصفائح الدموية. الحصول على 10-20 ق لقياس سرعة الصفائح الدموية.
  ملاحظة: يمكن الحصول على 133 إطارا/ثانية كحد أقصى باستخدام هذه الشروط باستخدام ماسح ترددي 12 كيلوهرتز. يجب أن تتكيف المعلمات مع الظروف. في بعض السفن، ومع ذلك سرعة الصفائح الدموية مرتفعة جدا لقياس سرعة الصفائح الدموية مع هذه الإعدادات بشكل موثوق.
قياس العرض والطول للصفائح
ملاحظة: لتحميل LIF-الملفات التي تم الحصول عليها على برنامج لايكا مع ImageJ، تحميل وتثبيت LOCI المكونات الإضافية على ImageJ لاستخدام "مستورد تنسيقات الحيوية".
1. عرض البروبليت
  1. افتح الفيلم باستخدام ImageJ. لإجراء قياس العرض، استخدم فقط فيلم الألواح بدون السفينة. لفصل القنوات المختلفة، انقر على الصورة| لون وحدد تقسيم القنوات.
  2. بالنسبة لفيلم z-stack، قم بعمل متوسط إسقاط z لكل نقطة زمنية بالنقر على Image| مكدسات وحدد Z Project. لنوع الإسقاط، أدخل متوسط الكثافة.
  3. تعامل مع الصورة لإزالة الضوضاء. طرح الخلفية عن طريق النقر على عملية| طرح الخلفية وتطبيق دائرة نصف قطرها الكرة المتداول: 50.0 بكسل. قم بتجانس الصورة بالنقر على عملية وسلس.
  4. تتبع خط قريب من قاعدة البروبليت (بالقرب من megakaryocyte ، وتجنب أي كائن آخر).
    ملاحظة: لا تنسى لتعيين مقياس الصورة للحصول على القيمة في الوحدة المطلوبة بالنقر فوق تحليل وتعيين مقياس. بشكل افتراضي، تكون وحدة الصورة بالبكسل.
  5. رسم ملف تعريف كثافة، تناسب منحنى غاوسي، وحساب العرض الكامل في نصف الحد الأقصى (FWHM). لذلك، اكتب السيناريو التالي في ماكرو بالنقر فوق الإضافات| جديد وحدد ماكرو وتشغيله بالنقر فوق ماكرو| تشغيل ماكرو: y = getProfile(); x=Array.getSequence(y.length)؛ Fit.doFit ("غاوسيان"،x،y)؛ Fit.plot()؛ سيغما = Fit.p(3)؛ FWHM = (2 * متر مربع ( 2 * سجل (2) ) ) * سيغما ؛ طباعة(FWHM).
    ملاحظة: تأكد من وجود ذروة واحدة فقط في مسح الخط، تتوافق مع كثافة الصفائح.
  6. تنفيذ الإجراءات الموضحة في الخطوة 4.7.5 على شريحة واحدة أو تكرارها مع مرور الوقت للحصول على متوسط عرض البروبليتليت
2. طول البروبليت
  1. تتبع خط على طول البروبليتليت، من قاعدة قريبة من megakaryocyte إلى الأعلى. استخدم خط مقسم لمتابعة شكل البروبليت. كرر ذلك لكل نقطة زمنية.
  2. تذكر أن تحفظ كل سطر باستخدام مدير عائد الاستثمار: انقر على تحليل | الأدوات وحدد مدير عائد الاستثمار. انقر على إضافة في إطار إدارة عائد الاستثمار لإضافة كل سطر إلى المدير كما هو محدد. لحفظ كافة الأسطر في مجلد، انقر فوق في إدارة عائد الاستثمار على إلغاء تحديد | المزيد وانقر على حفظ. من إدارة عائد الاستثمار، استخراج قيمة طول كل سطر(قياس)من جدول النتائج.
    ملاحظة: لا تنسى لتعيين مقياس الصورة للحصول على القيمة في الوحدات المطلوبة بالنقر فوق تحليل وتعيين مقياس. بشكل افتراضي، تكون وحدة الصورة بالبكسل.
قياس سرعة الصفيحات
ملاحظة: يتم حساب سرعة الصفائح الدموية من تسجيل الفيديو من الصفائح الفلورية المتدفقة داخل السفينة أكثر من 10-20 s. يتم إجراء علاج الصورة الأولى للحصول على بيانات مسح الخط المتكررة دوريا. الحركة تؤدي إلى الشرائط التي تعتمد زاويتها على السرعة، مما يسمح بحسابها. هنا، تم حساب السرعة بطريقة تستخدم تحويل الرادون، وهو أكثر قوة من الطريقة الكلاسيكية لتحلل القيمة المفردة (SVD)¹⁵.
1. علاج الصورة مع ImageJ
  1. افتح الفيلم باستخدام ImageJ. تطبيق مرشح طمس الغاوسية عن طريق النقر على عملية | مرشحات، حدد غاوسي طمس، وتطبيق سيغما (نصف قطرها) : 2.00. اختر منطقة صغيرة لقياس التدفق، وتتبع 3 خطوط متجاورة تتبع اتجاه التدفق.
    ملاحظة: لا تنسى حفظ كل سطر باستخدام إدارة عائد الاستثمار بالنقر فوق تحليل | أدوات | مدير عائد الاستثمار. انقر على إضافة في إطار إدارة عائد الاستثمار لإضافة كل سطر وحفظها؛ انقر أولا على إلغاء تحديد | المزيد ثم انقر على حفظ.
  2. باستخدام برنامج ImageJ لمسح الخط ، قم ببناء kymograph لكل سطر من خلال النقر على image | مكدسات; حدد Reslice وتطبيق المعلمات التالية: تباعد الإخراج (ميكرون): 1.000 / عدد الشرائح: 1 / تجنب الاستيفاء. حفظ الصور الناتجة عن الزمان والمكان.
    ملاحظة: تظهر الصورة الناتجة خطوطا مطابقة للحركة الخطية للصفائح الدموية في تدفق الدم بمرور الوقت. زاوية خط هو دالة للسرعة.
2. قياس السرعة باستخدام برنامج Matlab أو GNU Octave
  ملاحظة: تقدر سرعة الصفائح الدموية في تدفق الدم من الصور الفضائية باستخدام طريقة تحليل حسابية على أساس تحويل الرادون الذي وصفه درو والمتعاونون¹⁵. وصف هذه الطريقة الرياضية خارج نطاق هذا الاستعراض ، ويشار إلى القارئ المنشور من قبل درو وآخرون للحصول على تفاصيل بشأن حساب¹⁵. كل من رمز Matlab والمزيد من المعلومات متوفرة على موقعه على الانترنت https://www.drew-lab.org/code.
  1. افتح الرمز باستخدام برنامج Matlab أو GNU Octave.
    ملاحظة: قد يتطلب الرمز التكيف وفقا للدراسة المطلوبة.
  2. استخراج القيمة من الصور 3 مساحة الوقت، المقابلة للخطوط المجاورة رسمها في الجزء السفينة نفسها. حساب متوسط قيمة سرعة تدفق الصفائح الدموية لهذا الجزء من السفينة.
    ملاحظة: لا تنسى تحويل النتيجة في وحدة القياس الصحيحة (على سبيل المثال، μm/s).

النتائج

باستخدام هذا البروتوكول، تم إعطاء التتبع الفلوري Qtracker-655 عن طريق الوريد لتصوير الأوعية الأنفية النخاعية في نخاع عظم الجمجمة واتجاه التدفق كما هو موضح في الأسهم(الشكل 4A، إلى اليسار). باستخدام الفئران mTmG، سجلت الصفائح الدموية eGFP-الفلورسنت أكثر من 20 ثانية في كل فرع سفينة، وتم...

Discussion

تعتمد آليات تكوين الصفائح الدموية بشكل كبير على بيئة نخاع العظم. ومن ثم، أصبح الفحص المجهري داخل الفيتية أداة هامة في الميدان لتصور العملية في الوقت الحقيقي. يمكن الحصول على الفئران ذات الخلايا الضخمة الفلورية عن طريق عبور الفئران التي تعبر عن إعادة دمج Cre في الخلايا الضخمة مع أي فئران مرا...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا فلوريان غايرتنر (معهد العلوم والتكنولوجيا في النمسا، كلوستيرنيوبورغ، النمسا) على مشورته الخبيرة بشأن تجارب المجهر ثنائي الفوتون في الوقت الذي أنشأنا فيه هذه التقنية في المختبر، وإيف لوتز في مركز التصوير IGBMC/CBI (إيلكيرش، فرنسا) على خبرته ومساعدته في المجهر ذو الفوتونين. كما نشكر جان إيف رينكل على مساعدته التقنية وإينس غينار على رسم المخطط في الشكل 1. ونشكر جمعية منظمة أطباء بلا حدود ومنظمة سانت بوبليك على دعمها في اقتناء المجهر ثنائي الفوتون. وقد تم دعم AB من خلال زمالات ما بعد الدكتوراه من Etablissement Français du Sang (APR2016) ومن وكالة الأنباء الوطنية دي لا ريشرش (ANR-18-CE14-0037-01).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent

References

Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
Mazo, I. B., et al. Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1. Journal of Experimenal Medicine. 188 (3), 465-474 (1998).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. , (2020).
Zhang, L., et al. Sphingosine kinase 2 (Sphk2) regulates platelet biogenesis by providing intracellular sphingosine 1-phosphate (S1P). Blood. 122 (5), 791-802 (2013).
Kowata, S., et al. Platelet demand modulates the type of intravascular protrusion of megakaryocytes in bone marrow. Thrombosis and Haemostasis. 112 (4), 743-756 (2014).
Nishimura, S., et al. IL-1alpha induces thrombopoiesis through megakaryocyte rupture in response to acute platelet needs. Journal of Cell Biology. 209 (3), 453-466 (2015).
Lefrancais, E., et al. The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for haematopoietic progenitors. Nature. 544 (7648), 105-109 (2017).
Potts, K. S., et al. Membrane budding is a major mechanism of in vivo platelet biogenesis. Journal of Experimental Medicine. 217 (9), 20191206 (2020).
Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (91), e51683 (2014).
Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
Tiedt, R., Schomber, T., Hao-Shen, H., Skoda, R. C. Pf4-Cre transgenic mice allow the generation of lineage-restricted gene knockouts for studying megakaryocyte and platelet function in vivo. Blood. 109 (4), 1503-1506 (2007).
Pertuy, F., et al. Broader expression of the mouse platelet factor 4-cre transgene beyond the megakaryocyte lineage. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 13 (1), 115-125 (2015).
Calaminus, S. D., et al. Lineage tracing of Pf4-Cre marks hematopoietic stem cells and their progeny. PLoS One. 7 (12), 51361 (2012).
Stegner, D., et al. Thrombopoiesis is spatially regulated by the bone marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 127 (2017).
Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of Computational Neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
Nakagawa, T., et al. Ketamine suppresses platelet aggregation possibly by suppressed inositol triphosphate formation and subsequent suppression of cytosolic calcium increase. Anesthesiology. 96 (5), 1147-1152 (2002).
Kim, S., Lin, L., Brown, G. A. J., Hosaka, K., Scott, E. W. Extended time-lapse in vivo imaging of tibia bone marrow to visualize dynamic hematopoietic stem cell engraftment. Leukemia. 31 (7), 1582-1592 (2017).
Kohler, A., Geiger, H., Gunzer, M. Imaging hematopoietic stem cells in the marrow of long bones in vivo. Methods in Molecular Biology. 750, 215-224 (2011).
Lewandowski, D., et al. In vivo cellular imaging pinpoints the role of reactive oxygen species in the early steps of adult hematopoietic reconstitution. Blood. 115 (3), 443-452 (2010).
Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nature Communications. 8 (1), 2153 (2017).
Chen, Y., Maeda, A., Bu, J., DaCosta, R. Femur window chamber model for in vivo cell tracking in the murine bone marrow. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (113), e542205 (2016).
Guesmi, K., et al. Dual-color deep-tissue three-photon microscopy with a multiband infrared laser. Light Science & Applications. 7, 12 (2018).
Wang, T., et al. Three-photon imaging of mouse brain structure and function through the intact skull. Nature Methods. 15 (10), 789-792 (2018).
Kim, J., Bixel, M. G. Intravital multiphoton imaging of the bone and bone marrow environment. Cytometry A. 97 (5), 496-503 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

173

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: