인 비보 마우스 두개골 골수에 있는 메가카르요세포와 프로플라틀의 2광화상

요약

우리는 여기에서 2개의 광자 현미경 검사를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈의 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet를 화상 진찰하는 방법을 설명합니다.

초록

혈소판은 골수에 위치한 특수 세포인 거대 카르요세포에 의해 생성됩니다. 10년 이상 전에 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화할 수 있는 가능성과 그들의 토착 환경은 혈소판 형성 과정에 새로운 빛을 비추고 있습니다. 메가카요세포는 부비동성 혈관의 내피 안대기를 통해 프로플라틀레라고 불리는 길쭉한 돌출부를 확장합니다. 이 논문은 두개골 골수와 부비동성 용기에 형광으로 표기된 메가카요사이클을 실시간으로 이미지화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 염증 반응을 제한하기 위해 두개골을 그대로 유지하는 사소한 수술에 의존합니다. 마우스 헤드는 호흡의 움직임을 방지하기 위해 두개골에 붙어 링으로 고정됩니다.

2광자 현미경을 사용하여 거대 카르요세포는 최대 몇 시간 동안 시각화할 수 있으므로 부비동성 혈관 내부의 신장 과정에서 세포 돌출 및 프로플라츠를 관찰할 수 있습니다. 이를 통해 돌출의 형태(너비, 길이, 수축 영역의 존재)와 그들의 신장 동작(속도, 규칙성 또는 일시 정지 또는 후퇴 단계의 존재)과 관련된 여러 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 이 기술은 또한 혈소판 속도 및 혈류 방향을 결정하기 위해 부비동성 용기에서 순환 혈소판의 동시 기록을 허용합니다. 이 방법은 유전자 변형 마우스를 사용하여 혈소판 형성에 대한 관심있는 유전자의 역할을 연구하는 데 특히 유용하며 약리학적 테스트 (메커니즘을 연구하고 혈소판 생산 장애의 치료에 있는 약물을 평가). 그것은 매우 귀중 한 도구가 되었다, 그것은 지금 생체 내 및 체 외 프로 플라틀릿 형성 다른 메커니즘에 의존 알려져 있다 으로 체 외 연구를 보완 하기 위해. 예를 들어, 시험관 내 마이크로투부레는 연막 연도에 필요하다는 것이 나타났다. 그러나, 생체 내에서,그들은 오히려 비계 역할을, 신장은 주로 혈류력에 의해 추진되고.

서문

혈소판은 골수에 위치한 메가카요세포 전문 세포에 의해 생성된다. 메가카요세포가 혈소판을 순환에서 방출하는 정확한 방법은 뼈를 통해 실시간 이벤트를 관찰하는 기술적 도전으로 인해 오랫동안 불분명하게 남아 있습니다. 2광자 현미경 검사는 이 도전을 극복하는 것을 도왔고 혈소판 형성 과정을 이해하는 중요한 발전으로 이끌어 냈습니다. 생체 내 첫 번째 생체 내 메가카요세포 관측은 2007년 폰 안드리안과 동료들이 두개골^1을통해 형광 메가카요사이클을 시각화하여 만들어졌다. 이는 젊은 성인 마우스의 전두엽 두개골에 있는 뼈 층이 수십 개의 미크론의 두께를 가지고 있고 근본적인 골수^2에서형광 세포의 시각화를 허용하기에 충분히 투명하기 때문에 가능하였다.

후속 연구는 다양한 조건하에서 프로플라틀 형성을 평가하고 기본^{메커니즘을}해독하기 위해이 절차를 적용^3,4,5,6. 이러한 연구는 거대 카르요세포가 부비동성 혈관의 내피 장벽을 통해 프로플라틀레라고 불리는 돌출부를 동적으로 확장한다는 확실한 증거를제공했다(도 1). 이 프로플라슬은 그 때 부피에 있는 수백개의 혈소판을 나타내는 긴 조각으로 풀어 놓입니다. 혈소판은 다운스트림 장기의 미세 순환, 특히 폐^7에서프로플라톤의 리모델링 후 형성될 것이다. 현재까지, 그러나, 정확한 프로세스 및 분자 기계장치는 논쟁의 대상이 남아 있습니다. 예를 들어, 프로플라슬의 신장에서 세포골격 단백질의 제안된 역할은 시험관 내 및 생체 내^조건(3)사이에 다르며, 프로플라츠톤 형성의 차이는 염증조건^6하에서입증되었다. 더 복잡한 것, 최근 연구는 프로 플라츠판 구동 개념에 이의를 제기하고 생체 내에서,혈소판은 본질적으로 메가 카요세포 수준^8에서막 신진 메커니즘을 통해 형성된다는 것을 제안했다.

이 논문은 최소한의 침습 적 절차를 사용하여 살아있는 마우스의 두개골 뼈에서 골수에 있는 거대 karyocytes 및 proplatelet의 관찰을 위한 프로토콜을 제시합니다. 유사한 접근법은 이전에 다른 골수 세포, 특히 조혈 줄기 및 선조 세포^9를시각화하기 위해 설명되었습니다. 여기서 초점은 측정 할 수있는 몇 가지 매개 변수를 자세히 메가 karyocytes 및 혈소판의 관찰에, 특히 proplatelet 형태와 혈소판 속도. 이 프로토콜은 형광 추적자와 약물을 주입하고 두개골 뼈를 통해 관찰하기 위해 경정맥에 카테터를 삽입하는 방법을 제시합니다. 칼변종 뼈는 반지가 뼈에 붙어 있도록 경미한 수술을 사용하여 노출됩니다. 이 링은 머리를 고정하고 호흡으로 인한 움직임을 방지하고 렌즈의 침수 매체로서 식염수로 채워진 컵을 형성하는 역할을합니다. 이 기술은 i) 용기 벽과 상호 작용하는 부비동 형상 및 거대 카르요세포가 실시간으로 관찰하는 데 적합합니다. ii) 프로플라츠 형성, 신장 및 방출 과정에서 메가카요세포체를 따릅니다. 및 iii) 혈소판 움직임을 측정하여 복잡한 부비동성 혈류를 모니터링합니다. 이 프로토콜을 사용하여 얻은 데이터는 최근에^3로게시되었습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 유럽 표준 2010/63/EU및 스트라스부르 대학의 동물 실험 윤리에 대한 CREMEAS 위원회 (코미테 레지오날 디티크 앙 마티에르 디티크 앙 마티에르 디티크 앙 마티에르 데테마포션 애니멀 스트라스부르, 동물 시설 계약 N°:G67-482-10 프로젝트, N67-482-10 프로젝트)2018061211274514 에 따라 수행되었습니다.

1. 쥐의 준비와 경정맥에 카테터 삽입

참고: 여기, 남성 또는 여성, 5-7 주 된 mTmG 기자 마우스 사용 되었다 (B6.129 (Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}Pf4-cre 마우스와 교차 11,강렬한 녹색 형광 라벨을 허용^11. 실험을 시작하기 전에 현미경의 가열 챔버를 몇 시간 동안 예열하십시오.

1. 마우스를 이미징 룸으로 운반하고 마취로 진행합니다.
   1. 케타민(케타민(100 μg/g) 및 자일라진(10μg/g) (5 μL/g)의 용액을 주입하여 마우스를 마취한다.
      참고 : 케타민 / 자일라진의 반복 투여는 여기에서 사용되며 잘 작동하지만 정기적 인 재주입을위한 기록중단이 필요합니다. 또는 마취 기계를 사용할 수 있는 경우 마취의 유도는 케타민/자일라진으로 수행되고 이후에 가스 흡입(이소플루란, 공기 및 산소의 혼합물)에서 유지될 수 있다.
   2. 깊은 마취에 도달 할 때까지 케이지에있는 동물을 교체하십시오. 모든 후속 조작을 위해 37°C에서 따뜻하게 가열된 접시에 마우스를 놓습니다.
      참고: 동물이 깊은 마취에 도달하는 동안 현미경 및 모든 장비(섹션 4.1 참조)를 켜고 수술이 완료되면 실험을 시작하기 위해 필요한 다양한 매개 변수(섹션 4.2 참조)를 설정합니다. 여기서, 절차는 단지 3 시간 지속되고 단자입니다. 마우스는 깨어나지 않고 실험 후 안락사됩니다. 따라서 피부와 기기에 대한 에탄올 소독은 충분합니다. 그러나, 기관 지침에 따라, 또는 절차가 더 오래 지속될 경우, 베타딘 / 포비도네 및 알코올과 세 번갈아 스크럽과 같은 더 완전한 소독 방법을 사용해야합니다.
2. 경정맥에 카테터를 설치합니다.
   참고: 가능한 한 수술 중 미생물 오염을 피하는 것이 중요합니다. 수술을 진행하기 전에 70 %의 에탄올 (EtOH)으로 피부를 조심스럽게 소독하십시오. 항상 살균 된 가위와 핀셋을 사용하고 정기적으로 70 % EtOH로 헹구습니다. 깨끗한 곳에서 작업하고 얼굴 마스크를 착용하십시오. 플라스틱 튜브 내부의 바늘로 구성된 22 G "오버 더 니들" 카테터는 정맥 주사에 사용됩니다(재료표참조).
   1. 마우스를 등에 놓고 수술용 테이프로 전방 다리를 고정하여 목구멍을 늘립니다(그림2A). 70%의 에탄올로 목을 소독합니다.
      참고: 편의를 위해 수술 전에 목을 면도할 수 있습니다. 절차가 더 오래 지속되는 경우 적절한 무균 기술을 위해 주의 깊게 면도해야합니다.
   2. 멸균 가위를 사용하여 오른쪽 또는 왼쪽 경정맥에 0.7-1cm 절개를 합니다. 인접한 결합 조직을 스트레칭하여 외부 경정맥과 가슴 근육의 상단을 노출시한다(도2A).
   3. 카테터를 따뜻하고 멸균된 생리식염수로 채웁니다. 가슴 근육을 관통 한 후 정맥에 카테터를 삽입(도 2B).
      참고: 카테터 내부의 기포를 피하십시오. 근육이 압축 점을 형성하기 때문에 출혈을 방지하기 위해 근육을 통해 카테터를 삽입하는 것이 중요합니다. Itgb3^{-/-마우스와} 같은 혈종 결함을 가진 마우스조차도 이 접근법으로 카테터 삽입시 출혈하지 않습니다.
   4. 바늘을 부드럽게 제거하고 필요한 경우 카테터를 정맥 깊숙이 이동하십시오. 주사기를 연결하고 수술 접착제(재료의 표)의한 방울을 추가하여 카테터를 안정화.
      참고: 정맥이 더 작은 구경을 가지고 있기 때문에 몇 가지 연습이 필요하지만 꼬리 정맥 내부에 카테터를 삽입 할 수 있습니다. 이것은 꼬리 정맥이 거의 보이지 않는 어두운 머리를 가진 마우스를 사용할 때 특히 어렵습니다. 그것의 더 큰 구경 때문에, 경정맥 안쪽에 카테터를 배치하는 것은 더 큰 볼륨 또는 반복한 처리가 더 안정적으로 주입될 수 있습니다. 주사기는 처음에는 따뜻한 식염수로 채워져 있으며 약물 용액을 주입하기 전에 죽은 양을 주입하는 것을 잊지 마십시오.
   5. 마우스를 조심스럽게 쉬운위치(도 2C)로되돌려 놓습니다. 건조를 방지하기 위해 눈에 젤(재료 의 표)를적용합니다.

2. 두개골 반지의 수술 및 설치

참고: 마우스 설치를 위한 전폭적인 지원은 4개, 블록 및 플레이트, 마우스 헤드를 고정하는 링 및링(그림 3A)으로구성된다. 지원의 모든 요소는 i.materialise.com 3D 프린팅에 의해 얻어졌습니다. 플레이트는 아크릴로니톨 부타디엔 스티렌(ABS) 폴리머, 스테인리스 스틸의 블록 및 나사, 고급 스테인리스 스틸(고상한 스테인리스 스틸) 링(3D 프린팅 파일용 치수 및 보충 재료에 대한 보충 도면 S1 참조)으로 만들어집니다. 블록은 나사 또는 접착된 지지대에 영구적으로 고정됩니다. 반지가 마우스 두개골에 고정되면 블록 홀더(그림 3A)에나사해야합니다.

1. 소독을 위해 70%의 에탄올로 젖은 종이 타월로 두피에 머리카락을 적시다. 젖은 종이 타월로 느슨한 머리카락을 모두 제거하십시오.
   참고: 편의를 위해 수술 전에 두피를 면도할 수 있습니다.
2. 두피를 최대 1cm의 미드라인에서 형성하여 귀 사이에 멸균 미세 가위와 핀셋을 사용하여 칼바륨을 노출시합니다.
   참고: 링은 전두엽 및 정수리뼈(그림 3B)와겹치기 위해 배치됩니다.
3. 멸균 핀셋을 사용하여 두개골을 노출하십시오. 가위와 핀셋으로 골막을 조심스럽게 제거합니다. 생리식염수에 담근 멸균 면봉을 사용하여 모든 폐막염과 이미징을 바꿀 수있는 파편이나 머리카락을 제거하십시오.
   참고: 염증 반응을 제한하려면 뼈를 손상시키지 않도록 주의하십시오.
4. 식염수로 헹구어 혈액 흔적을 제거하고 마른 면봉으로 뼈를 빠르게 건조시합니다. 접착제 젤을 반지에 바르고 노출된 뼈에 놓고 몇 초 동안 유지하여 반지가 두개골에 단단히 부착되도록 하십시오.
   참고: 바람직하지 않은 자동 발광으로 이어질 수 있으므로 접착제가 관측장에 들어가지 않아야 합니다.
5. 생리식염수에 담그고 면봉으로 두개골을 가볍게 촉촉하게 합니다.
6. 1:1 블루와 옐로우 성분을 조심스럽게 혼합하여 실리콘 치과 페이스트를 준비합니다. 이미징 중 누출을 방지하기 위해 밀봉을 위해 링 주위에 치과 페이스트를 적용하십시오. 고리에 들어갔을 수 있는 치과 페이스트 나 접착제를 조심스럽게 제거하십시오.
7. 벨린으로 링을 채우고 누출을 확인합니다.
   참고: 식염수는 현미경 목표에 대한 침지 배지 역할을 합니다. 출혈은 혈증 관련 결함을 가진 마우스를 사용할 때 더 중요할 지도 모릅니다. 혈액이 더 많은 이미징을 흐리게 할 수 있으므로 혈액이 고리에 들어가는 것을 방지하는 것이 필수적입니다.
8. 마우스를 지지에 놓고 블록홀더(그림 3C)에링을 나사로 놓습니다. 접힌 압축을 동물의 머리 아래에 놓고 머리를 들어 올리고 두개골에서 반지의 분리를 방지합니다.
   참고: 머리가 직접 고정되어 호흡으로 인한 이미지 움직임을 방지합니다.
9. 가열된 현미경챔버(도 3D)에지지체 및 마우스 어셈블리를 배치합니다.
   참고: 삽입된 카테터를 언제든지 빼내지 않도록 주의하십시오.

3. 실험이 끝날 때까지 마취된 마우스의 후속 조치

참고: 마취는 케타민(s.c.) 주사를 5 μL/g의 부피와 케타민(50 μg/g) 및 자일라진(5μg/g)(5μg/g)의 혼합물로 번갈아 가며 35분마다 재유도된다. 취득 시 가열된 현미경 챔버를 열 수 없는 만큼, 발가락 꼬집기로 마취제를 재투여하기 전과 후에 마취 모니터링이 수행됩니다. 마찬가지로 각 새 비디오 녹화를 시작하기 전에 발가락 핀치가 수행됩니다.

1. 필요한 경우, 주사를 .c 주사에 의한 마취를 획득 중지하고 다시 유도하십시오.
   1. 마우스 머리를 움직이지 않도록 주의하기 때문에 왼손의 엄지와 검지 손가락 사이에 뒷면의 피부를 꼬집습니다. 피하 주사제를 오른손을 사용하여 백 스킨의 접에 마취제를 주입합니다 (또는 왼손잡이 사람들을위한 그 반대의 경우도 마찬가지입니다).
2. 링에 식염수의 존재를 확인하고 필요한 경우 신선한 식염수를 채웁니다. 다음 35분 동안 녹음을 하고 녹음 기간 동안 비슷하게 진행합니다.
3. 실험이 끝나면 깨어나기 전에 자궁 경부 탈구로 마우스를 안락사시합니다.
   참고: 마우스는 지역 윤리 및 동물 복지 위원회에 동의하여 최대 3시간 동안 마취됩니다.

4. 2광자 이미징

참고: 현미경 및 관련 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 이미지는 공진 스캐너(12 또는 8kHz)로 기록되었습니다. 양방향으로 픽셀이 기록됨에 따라 양방향 모드가 설정되어 속도 획득속도를 높였습니다. 따라서 단계의 불일치는 제어판 "위상 보정"으로 수정되어야 합니다. 마지막으로, 적응된 평균은 획득 속도와 신호 대 잡음 비율 사이의 타협으로 설정되었습니다.

1. 레이저 및 공진 스캐너를 포함한 2광자 현미경을 켭니다(레이저에 따라 레이저 출력은 보통 ~1.8-2.5W).
2. 선택한 형광에 적합한 레이저 파장을 설정합니다. 방출된 조명의 복구를 위해 적절한 파장을 설정합니다.
   참고: 여기서, 913nm 및 하이브리드 검출기(500-550 nm 및 575-625 nm)의 파장이 각각 알렉사플루어-488 및 Qtracker-655를 동시에 흥분시키고 검출하는 데 사용되었습니다.
3. 관내 카테터를 사용하여, 형광 추적기를 주입하여 혈관에 라벨을 붙입니다(Qtracker-655; 재료의 표). 0.2 μM에 용액의 50 μL/마우스를 주입하고, 최대 150 μL/실험을 위해 매시간 한 번씩 갱신됩니다.
   참고: 다른 트레이서는 고분자량 dextran^1과같은 다른 추적자를 사용할 수 있습니다. 이 경우 혈액 점도가 dextran에 의해 변경될 수 있다는 것을 고려하고 일부 출혈성 매개 변수를 수정하십시오.
4. 현미경의 목적하에 지지체와 마우스로 현미경 단계를 배치합니다. 링이 항상 식염수로 채워져 있는지 확인하고 목표를 몰입하십시오. 부비동산 혈관을 따라 정렬된 골수 혈관(빨간색)과 거대 카르요세포(녹색)의 존재를 찾기 위해 에피플루오를 사용합니다.
   참고: 두개골 뼈의 두께는 100 μm^2보다낮습니다. 골수는 뼈 아래에 위치하며 형광 녹색 거대 카르요사이클과 Qtracker-655에 의해 표지된 조밀한 붉은 해부학 부비동성 용기에 의해 쉽게 인식됩니다.
5. 긴 인수(메가카요사이클, 프로플라판)
   1. 관심 영역을 검색합니다. 위에서 설명한 대로 이미지 수집 매개 변수를 적용합니다.
   2. 긴 획득(예: 프플래틀렛 형성 또는 신장의 시각화)의 경우 8kHz 공진 스캐너를 사용하여 최적화된 간격(일반적으로 0.85~1.34 μm 사이)으로 z 스택 이미지를 획득합니다.
      참고: 12kHz 공진 스캐너는 획득 속도를 높일 수 있습니다.
   3. 384 x 384 픽셀 이미지를 획득하여 전체 메가카요세포와 선박을 시각화합니다. 원하는 대로 라인 평균을 사용하여 신속한 해결을 위해 사용하십시오. 프로플라츠렛 시각화를 위해 이미지 스택 획득의 시간 간격, 일반적으로 10 s 또는 30 초를 결정합니다.
      참고: 여기서는 8kHz 공진 스캐너로 1개의 이미지/10s를 획득할 수 있는 더 높은 신호 대 잡음 비율을 얻기 위해 평균 8개의 라인을 사용했습니다. 라이브 인수 시 라인 평균이 허용되는지 확인합니다.
6. 짧고 빠른 획득 (혈소판)
   참고: 혈소판 속도와 같은 급속한 이벤트를 더 짧게 획득하려면 프레임 획득 속도를 극대화하는 것이 필수적입니다. 적절한 획득 유형을 선택하면 프레임 획득 속도가 최적화됩니다(예: 시공간 획득 유형 "xyt").
   1. 필요한 경우 이미징 필드를 회전하여 이미지 크기를 최소화(예: 256 x 90픽셀)를 최소화하고 이미지 크기를 용기에 맞게 조정합니다.
   2. 사용 가능한 가장 높은 스캐닝 속도를 사용합니다.
   3. 양방향 스캐닝을 사용합니다.
      참고: 양방향 스캐닝의 경우 위상이 잘 조정되었는지 확인합니다.
   4. 이미지 정의와 빠른 수집 사이의 최적의 타협을 찾기 위해 라인 평균을 최소화합니다.
      참고: 혈소판 속도 측정의 경우, 획득의 급속성을 높이는 데 도움이 된다면 픽셀화된 이미지가 충분할 수 있습니다.
   5. z 스택을 최소화하여 획득 의 급속성을 높입니다. 단 1개의 z-스택만 획득하면 혈소판 속도를 정량화하기에 충분합니다. 혈소판 속도를 측정하기 위해 10-20 s를 획득하십시오.
      참고: 12kHz 공진 스캐너가 있는 이러한 조건을 사용하여 최대 133프레임/s를 얻을 수 있습니다. 매개 변수는 조건에 맞게 조정되어야 합니다. 일부 선박에서는 혈소판 속도는 그럼에도 불구하고 이러한 설정으로 혈소판 속도를 안정적으로 정량화하기에는 너무 높습니다.
7. 프로플라틀릿 너비 및 길이 측정
   참고: ImageJ와 라이카 소프트웨어에서 얻은 LIF 파일을 로드하려면 먼저 IMAGEJ에 LOCI 플러그인을 다운로드하여 설치하여 바이오 포맷 수입업체를 사용합니다.
   1. 프로플라틀너비
      1. ImageJ로 영화를 엽니다. 폭 측정을 수행하려면 용기없이 프로 플라츠판의 영화만 사용하십시오. 다른 채널을 분리하려면 이미지를 클릭합니다| 색상 및 분할 채널을 선택합니다.
      2. z 스택 영화의 경우 이미지를 클릭하여 각 시간 별 평균 z 프로젝션을 만듭니다| 스택 및 Z 프로젝트를 선택합니다. 투영 유형의경우 평균 강도를입력합니다.
      3. 이미지를 처리하여 노이즈를 제거합니다. 프로세스를 클릭하여 배경을 뺍니다| 배경을 빼고 롤링 볼 반경: 50.0 픽셀을 적용합니다. 프로세스를 클릭하여 이미지를 부드럽게하고 부드럽게합니다.
      4. 프로 플라틀렛 의 기지 에 가까운 선을 추적 (메가 카요사이클트 근처, 다른 개체를 피하기).
         참고: 분석 및 설정 배율을클릭하여 원하는 단위에서 값을 얻기 위해 이미지의 배율을 설정하는 것을 잊지 마십시오. 기본적으로 이미지 단위는 픽셀에 있습니다.
      5. 강도 프로파일을 플롯하고, 가우시안 곡선에 맞고, 전체 폭을 절반 최대(FWHM)로 계산합니다. 이를 위해 플러그인을 클릭하여 다음 스크립트를 매크로에 작성합니다| 매크로를 새로 선택하고 매크로를 클릭하여 실행합니다| 매크로 실행: y=getProfile(); x=Array.getSequence(예. 길이); Fit.doFit ("가우시안", x,y); Fit.plot(); 시그마=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt (2 * 로그 (2) ) * 시그마; 인쇄(FWHM).
         참고: 프로플래틀 강도에 해당하는 라인 스캔에 단 하나의 피크만 있는지 확인합니다.
      6. 1 슬라이스에 4.7.5 단계로 설명된 작업을 수행하거나 시간이 지남에 따라 반복되어 프롬플라톤의 평균 폭을 얻을 수 있습니다.
   2. 프로플라틀 길이
      1. 프로 플라틀렛을 따라 선을 추적, 상단에 메가 카요 사이클에 가까운 기지에서. 분할된 선을 사용하여 프로플라틀렛 모양을 따릅니다. 각 시간 지점에 대해 반복합니다.
      2. ROI 관리자를 사용하여 각 줄을 저장해야 합니다: 분석 | 클릭하십시오. 도구 및 ROI 관리자를 선택합니다. ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하여 선택한 대로 각 줄을 관리자에 추가합니다. 폴더에 있는 모든 선을 저장하려면 선택 취소|의 ROI 관리자를 클릭합니다. 더 많은 및 저장을클릭합니다. ROI 관리자로부터 결과 표에서 각줄(측정)의길이 값을 추출합니다.
         참고: 분석 및 설정 배율을클릭하여 원하는 단위로 값을 얻기 위해 이미지의 배율을 설정하는 것을 잊지 마십시오. 기본적으로 이미지 단위는 픽셀에 있습니다.
8. 혈소판 속도 측정
   참고: 혈소판 속도는 10-20s 이상 용기 내부에 흐르는 형광 혈소판의 비디오 녹화에서 계산됩니다. 주기적으로 반복되는 라인 스캔 데이터를 얻기 위해 첫 번째 이미지 처리가 수행됩니다. 모션은 각도가 속도에 따라 달라지므로 계산을 허용하는 줄무늬로 이어집니다. 여기서, 속도는 고전 단수 값 분해(SVD)^{방법(15)보다}더 강력한 라돈 변환을 사용하는 방법으로 계산되었다.
   1. ImageJ와 이미지 처리
      1. ImageJ로 영화를 엽니다. 프로세스 | 클릭하여 가우시안 블러 필터를 적용 필터, 가우시안 블러를선택하고 시그마(반경)를 적용: 2.00. 흐름을 측정하기 위해 작은 영역을 선택하고 유동 방향에 따라 인접한 3선을 추적합니다.
         참고: 분석 | 클릭하여 ROI 관리자를 사용하여 각 줄을 저장하는 것을 잊지 마십시오. 도구 | ROI 매니저. ROI 관리자 창에서 추가를 클릭하여 각 줄을 추가하고 저장합니다. | 선택 취소에서 먼저 클릭하십시오. 더 많은 다음 저장을클릭합니다.
      2. ImageJ 라인 스캔 소프트웨어를 사용하여 이미지 | 클릭하여 각 줄에 대한 kymograph을 빌드합니다. 스택; 다시 슬라이스를 선택하고 다음 매개 변수를 적용 : 출력 간격 (미크론): 1.000 / 슬라이스 카운트 : 1 / 보간 을 피하십시오. 생성된 시공간 이미지를 저장합니다.
         참고: 결과 이미지는 시간이 지남에 따라 혈소판의 선형 모션에 대응하는 줄무늬를 보여줍니다. 줄무늬의 각도는 속도의 함수입니다.
   2. Matlab 또는 GNU 옥타브 소프트웨어를 사용하여 속도 측정
      참고: 혈류내의 혈소판의 속도는 Drew 및 공동^{작업자(15)에}의해 기술된 라돈 변환에 기초한 계산 분석 방법을 사용하여 시시간 이미지로부터 추정된다. 이 수학 방법에 대한 설명은 이 검토의 범위를 벗어났으며, 판독기는 Drew 등에서^{계산(15)에}대한 세부 정보를 참조합니다. Matlab 코드와 자세한 정보는 https://www.drew-lab.org/code 웹사이트에서 확인할 수 있습니다.
      1. Matlab 또는 GNU 옥타브 소프트웨어를 사용하여 코드를 엽니다.
         참고: 코드는 원하는 스터디에 따라 적응해야 할 수 있습니다.
      2. 동일한 용기 부분에 그려진 인접한 선에 대응하는 3개의 시공간 이미지에서 값을 추출합니다. 선박의 이 부분에 대한 평균 혈소판 흐름 속도 값을 계산합니다.
         참고: 올바른 측정 단위(예: μm/s)에서 결과를 변환하는 것을 잊지 마십시오.

결과

이 프로토콜을 사용하여 형광 추적기 Qtracker-655는 두개골 골수및 화살표에 의해 묘사된 흐름 방향에서 해부학된 골수 부비동성 혈관을 심상으로 투여하였다(그림4A,왼쪽). mTmG 마우스를 사용하여, eGFP 형광 혈소판은 각 혈관 분지에서 20s 이상 기록되었고, 그들의 속도는 ImageJ 및 GNU 옥타브 소프트웨어(도 4A,오른쪽)를 사용하여 측정되었다. 흐름 속도와 ?...

토론

혈소판 형성의 메커니즘은 골수 환경에 크게 의존한다. 따라서, 인트라바이탈 현미경 검사는 실시간으로 프로세스를 시각화하는 분야에서 중요한 도구가되었습니다. 형광 메가카요세포가 있는 마우스는 조건부 형광 유전자 발현 카세트를 함유하는 어떤 플로스기자 마우스와 함께 메가카요사이클로 Cre 재조합을 발현하는 마우스를 교차시킴으로써 얻을 수 있다. 여기서, mTmG 기자 마우스는 (B6.129(...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent