In Vivo Fare Kafatası Kemik İliği'nde Megakaryositlerin ve Proplateletlerin İki FotonLu Görüntülemesi

Özet

Burada iki fotonlu mikroskopi kullanarak canlı farelerin kafatası kemiğinin iliğindeki megakaryositleri ve proplateletleri görüntüleme yöntemini açıklıyoruz.

Özet

Trombositler, kemik iliğinde bulunan özel hücreler olan megakaryositler tarafından üretilir. Megakaryositleri gerçek zamanlı olarak ve doğal ortamlarında görüntüleme imkanı 10 yıldan daha uzun bir süre önce tanımlanmış ve trombosit oluşum sürecine yeni bir ışık tutmaktadır. Megakaryositler, sinüzoid damarların endotel astarı yoluyla proplatlet adı verilen uzun çıkıntıları uzatır. Bu makale, kafatası kemik iliği ve sinüzoid damarlardaki gerçek zamanlı floresan etiketli megakaryositlerde aynı anda görüntü vermek için bir protokol sürmektedir. Bu teknik, enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kafatasını sağlam tutan küçük bir ameliyata dayanır. Fare kafası, hareketlerin nefes almasını önlemek için kafatasına yapıştırılmış bir halka ile hareketsiz hale getirilir.

İki fotonlu mikroskopi kullanılarak, megakaryositler birkaç saate kadar görselleştirilerek sinüzoid damarların içindeki uzama sürecinde hücre çıkıntılarının ve proplatletlerin gözlemlenmesi sağlanabilir. Bu, çıkıntıların morfolojisi (genişlik, uzunluk, daralma alanlarının varlığı) ve uzama davranışları (hız, düzenlilik veya duraklama veya geri çekme aşamalarının varlığı) ile ilgili çeşitli parametrelerin ölçülmesine izin verir. Bu teknik aynı zamanda trombosit hızını ve kan akışı yönünü belirlemek için sinüzoid damarlarda dolaşan trombositlerin eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. Bu yöntem özellikle genetiği değiştirilmiş fareler kullanarak trombosit oluşumunda ilgi çekici genlerin rolünü incelemek için yararlıdır ve farmakolojik testlere de açıktır (mekanizmaları inceleyin, trombosit üretim bozukluklarının tedavisinde ilaçları değerlendirin). In vivo ve in vitro proplatlet oluşumunun farklı mekanizmalara dayandığı bilindiği için özellikle in vitro çalışmaları tamamlamak için paha biçilmez bir araç haline gelmiştir. Örneğin, proplatlet uzaması için in vitro mikrotübüllerin gerekli olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, in vivo, esas olarak kan akış kuvvetleri tarafından teşvik edilen bir iskele olarak hizmet ederler.

Giriş

Trombositler kemik iliğinde bulunan megakaryositlere özel hücreler tarafından üretilir. Megakaryositlerin dolaşımdaki trombositleri serbest bırakmasının kesin yolu, kemikten gerçek zamanlı olayları gözlemlemedeki teknik zorluk nedeniyle uzun süre belirsiz kalmıştır. İki fotonlu mikroskopi bu zorluğun üstesinden gelmeye yardımcı oldu ve trombosit oluşum sürecini anlamada büyük ilerlemelere yol açtı. İlk in vivo megakaryosit gözlemleri 2007 yılında von Andrian ve meslektaşları tarafından yapıldı, floresan megakaryositlerin kafatasından görselleştirilmesi^{ile 1}. Bu mümkündü, çünkü genç yetişkin farelerin frontoparietal kafatasındaki kemik tabakası birkaç on mikron kalınlığa sahiptir ve alttaki kemik iliğindeki floresan hücrelerin görselleştirilmesine izin vermek için yeterince^{şeffaftır 2}.

Daha sonra yapılan çalışmalarda proplatelet oluşumunun çeşitli koşullar altında değerlendirilmesi ve alttaki mekanizmaların deşifre edilmesi için 3 ,^4,5,6. Bu çalışmalar, megakaryositlerin proplatlet adı verilen çıkıntıları sinüzoid damarların endotel bariyeri yoluyla dinamik olarak genişlettiklerine dair kesin kanıtlar sağlamıştır(Şekil 1). Bu proplateletler daha sonra hacim olarak birkaç yüz trombosit temsil eden uzun parçalar olarak serbest bırakılır. Trombositler, özellikle akciğerlerde olmak üzere aşağı akış organlarının mikrosirkülasyonunda proplateletlerin yeniden şekillendirilmesinden sonra oluşacaktır⁷. Ancak bugüne kadar kesin süreç ve moleküler mekanizmalar tartışılmaya devam etmektedir. Örneğin, sitoskeletal proteinlerin proplatletlerin uzamasındaki önerilen rolü in vitro ve in vivo koşullar arasında farklılık gösterir³ve proplatlet oluşumundaki farklılıklar enflamatuar koşullar altında gösterilmiştir⁶. İşleri daha da karmaşık hale getiren, yeni bir çalışma proplatelet güdümlü konsepte itiraz etti ve in vivo, trombositlerin esasen megakaryosit seviyesinde bir membran tomurcuklama mekanizması ile oluştur olduğunu önerdi⁸.

Bu makale, canlı farelerde kafatası kemiğinden kemik iliğindeki megakaryositlerin ve proplatletlerin minimal invaziv bir prosedür kullanılarak gözlemlenmesi için bir protokol sunun. Benzer yaklaşımlar daha önce hematopoetik kök ve progenitör hücreler başta olmak üzere diğer ilik hücrelerini görselleştirmek için^{tanımlanmıştır 9}. Burada, özellikle proplatlet morfolojileri ve trombosit hızı olmak üzere ölçülebilen bazı parametreleri detaylandırmak için megakaryositlerin ve trombositlerin gözlemlenmesi üzerinde durulmaktadır. Bu protokol, floresan izleyiciler ve ilaçlar enjekte etmek ve kafatası kemiğinden gözlemlemek için şahdamarına bir kateterin nasıl yerleştirılacağını sunar. Kalvarial kemik küçük bir ameliyat kullanılarak maruz kalır, böylece kemiğe bir halka yapıştırılır. Bu halka, başı hareketsiz hale getirmek ve nefes almaya bağlı hareketleri önlemek ve lensin daldırma ortamı olarak tuzlu su dolu bir bardak oluşturmak için hizmet eder. Bu teknik i) sinüsoid geometrisini ve damar duvarı ile etkileşime giren megakaryositleri gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için çok uygundur; ii) proplatlet oluşumu, uzama ve salınım sürecinde megakaryositleri takip edin; ve iii) karmaşık sinüzoid kan akışını izlemek için trombosit hareketlerini ölçmek. Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler yakın zamanda yayımlanmıştır³.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Avrupa standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi 2010/63/EU ve CREMEAS Strazburg Üniversitesi Hayvan Deneyleri Etik Komitesi (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Hayvan Tesisi sözleşmesi N°: G67-482-10, proje anlaşması N°: 2018061211274514).

1. Farelerin hazırlanması ve şahdamarına kateter yerleştirilmesi

NOT: Burada, erkek veya dişi, 5-7 haftalık mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10}) Pf4-girit fareleri¹¹ile geçti , megakaryositlerde ve trombositlerde yoğun yeşil floresan etiketlemesine izin verdi¹². Deneye başlamadan önce, mikroskobun ısıtma odasını birkaç saat önceden ısıtın.

1. Fareyi görüntüleme odasına taşıyın ve anesteziye devam edin.
   1. Fareyi ketamin (100 μg/g) ve ksilazin (10 μg/g) (5 μL/g) çözeltisinin intraperitoneal (i.p.) enjeksiyonu ile uyuşturun.
      NOT: Ketamin/ksilazinin tekrarlanan yönetimi burada kullanılır ve iyi çalışır, ancak düzenli reenjeksiyon için kaydın kesilmesini gerektirir. Alternatif olarak, bir anestezi makinesi varsa, anestezi indüksiyonu ketamin/ ksilazin ile yapılabilir ve daha sonra gazların solunması altında tutulabilir (izofluran, hava ve oksijen karışımı).
   2. Hayvanı derin anesteziye ulaşana kadar kafesinde değiştirin. Fareyi sonraki tüm manipülasyonlar için 37 °C'de ısıtılmış ısıtılmış bir tabağa yerleştirin.
      NOT: Hayvan derin anesteziye ulaşırken, mikroskobu ve tüm ekipmanları çalıştırın (bölüm 4.1'e bakın) ve ameliyat yapıldıktan sonra deneye başlamak için gereken farklı parametreleri ayarlayın (bkz. bölüm 4.2). Burada, prosedür sadece 3 saat sürer ve terminaldir. Fare, deneyden sonra uyanmadan ötenaziye tabir edilir. Bu nedenle, cilt ve aletler için etanol dezenfeksiyonı yeterlidir. Bununla birlikte, kurumsal yönergelere bağlı olarak veya prosedür daha uzun sürecekse, betadin / povidone ve alkol içeren üç alternatif önlük gibi daha eksiksiz dezenfeksiyon yöntemleri kullanılmalıdır.
2. Şahdamarına bir kateter takın.
   NOT: Ameliyat sırasında mikrobiyal kontaminasyondan mümkün olduğunca kaçınmak önemlidir. Ameliyata devam etmeden önce cildi % 70 etanol (EtOH) ile dikkatlice dezenfekte etmeye özen edin. Her zaman sterilize makas ve cımbız kullanın ve düzenli olarak% 70 EtOH'da durulayın. Temiz bir yerde çalışın ve yüz maskesi takın. İntravenöz enjeksiyon için plastik bir tüpün içindeki bir iğneden oluşan 22 G'lik "iğnenin üzerinde" kateter kullanılır (bkz. Malzeme Tablosu).
   1. Fareyi sırtına yerleştirin ve ön bacakları boğazı germek için cerrahi bantla sabitleyin (Şekil 2A). Boğazı% 70 etanol ile dezenfekte edin.
      NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce boğaz tıraş edilebilir. İşlem daha uzun sürerse, uygun aseptik teknik için dikkatli tıraş yapılmalıdır.
   2. Steril makas kullanarak sağ veya sol şahdamarı üzerinde 0,7-1 cm'lik bir kesi yapın. Dış şahdamarını ve pektoral kasın üst kısmını ortaya çıkarmak için bitişik bağ dokusunu uzatın (Şekil 2A).
   3. Kateteri ılık, steril fizyolojik salin ile doldurun. Göğüs kasına nüfuz ettikten sonra kateteri damara yerleştirin (Şekil 2B).
      NOT: Kateterin içindeki hava kabarcıklarından kaçınmaya özen edin. Kas bir sıkıştırma noktası oluşturacağından kanamayı önlemek için kateterin kastan yerleştirilmesi önemlidir. Itgb3^-/- fareler gibi hemostaz defektleri olan fareler bile bu yaklaşımla kateter takılması üzerine kanamaz.
   4. İğneyi yavaşça çıkarın ve gerekirse kateteri damarın daha derinlerine dikkatlice hareket ettinin. Şırınnayı bağlayın ve bir damla cerrahi yapıştırıcı ( Malzeme Masası ) ekleyerek kateteri stabilizeetti.
      NOT: Damar daha küçük bir kalibreye sahip olduğu için biraz pratik gerektirse de kuyruk damarına kateter takmak mümkündür. Bu, kuyruk damarı neredeyse hiç görünmeyen koyu saçlı fareleri kullanırken özellikle zordur. Daha büyük kalibresi nedeniyle, kateterin şahdamarı içinde konumlandırılması, daha büyük hacimlerde veya tekrarlanan tedavilerin daha güvenilir bir şekilde enjekte edilmesine izin verebilir. Şırındıcın ilk kez ılık salinle doldurduğunu lütfen unutmayın ve ilaç çözeltisini enjekte etmeden önce ölü hacmi enjekte etmeyi unutmayın.
   5. Fareyi dikkatlice eğilimli bir konuma getirin (Şekil 2C). Kuruluğu önlemek için gözlere jel (Malzeme Tablosu) uygulayın.

2. Kranial halkanın ameliyatı ve montajı

NOT: Fare kurulumu için tam destek 4 adet, bir blok ve bir plaka, fare kafasını tutmak için halka ve halkayı bloğa sabitlemek için bir vidadan oluşur (Şekil 3A). Desteğin tüm unsurları 3D baskı ile i.materialise.com elde edilmiştir. Plaka akrilonitril bütadien stiren (ABS) polimer, paslanmaz çelik blok ve vida ve yüksek dereceli paslanmaz çelik halka (yüksek ayrıntılı paslanmaz çelik) yapılmıştır (Bkz. Boyutlar için Ek Şekil S1 ve 3D baskı dosyaları için Ek Malzemeler). Blok, vidalı veya yapıştırılmış olarak desteğe kalıcı olarak sabitlenir. Halka fare kafatasına sabitlendikten sonra, blok tutucuya vidalanmalıdır (Şekil 3A).

1. Saç derisindeki saçları dezenfeksiyon için% 70 etanol ile ıslanmış bir kağıt havlu ile nemlendirin. Tüm gevşek saçları ıslak bir kağıt havlu ile çıkarın.
   NOT: Kolaylık sağlamak için ameliyattan önce kafa derisi tıraş edilebilir.
2. Kalvarium'u steril ince makas ve cımbız kullanarak ortaya çıkarmak için orta çizgide 1 cm'ye kadar ve kulakların arasında bir T oluşturarak kafa derisini kuluçkaya yatırın.
   NOT: Halka ön ve parietal kemikler üst üste gelecek şekilde konumlandırılacaktır (Şekil 3B).
3. Kafatasını ortaya çıkarmak için steril cımbız kullanın. Periosteumu makas ve cımbızla dikkatlice çıkarın. Görüntülemeyi değiştirebilecek tüm periosteumu ve herhangi bir döküntüyü veya saçı çıkarmak için fizyolojik salin ile ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanın.
   NOT: enflamatuar reaksiyonları sınırlamak için kemiğe zarar vermemeye çok dikkat edin.
4. Salin ile durulayarak kan izlerini çıkarın ve kemiği kuru bir pamuklu çubukla hızla kurutun. Tutkal jelini halkaya uygulayın, açıkta kalan kemiğe yerleştirin ve halkanın kafatasına sıkıca tutturulması için birkaç saniye saklayın.
   NOT: Gözlem alanına istenmeyen otofluoresansa yol açabileceği için tutkal girmemelidir.
5. Kafatasını fizyolojik saline batırılmış pamuklu çubukla hafifçe nemlendirin.
6. 1:1 mavi ve sarı bileşenleri dikkatlice karıştırarak silikon diş macunu hazırlayın. Görüntüleme sırasında sızıntıyı önlemek için sızdırmazlık için halkanın etrafına diş macunu uygulayın. Halkaya girmiş olabilecek herhangi bir diş macunu veya yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarın.
7. Yüzüğü tuzlu suyla doldurun ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin.
   NOT: Salin, mikroskop hedefi için daldırma aracı görevi görür. Hemostazla ilgili kusurları olan fareler kullanırken kanama daha kritik olabilir. Daha fazla görüntülemeyi bulanıklaştırabileceğinden kanın halkaya girmesini önlemek önemlidir.
8. Fareyi desteğin üzerine yerleştirin ve halkayı blok tutucuya vidala(Şekil 3C). Başı kaldırmak ve yüzüğün kafatasından kopmasını önlemek için hayvanın başının altına katlanmış kompres yerleştirin.
   NOT: Kafa, nefes alma nedeniyle görüntü hareketlerini önleyecek şekilde doğrudan sabitlenir.
9. Destek ve fare tertibatını ısıtılmış mikroskop haznesindekonumlandırın (Şekil 3D).
   NOT: Takılan kateteri herhangi bir zamanda yerinden çıkarmamaya dikkat edin.

3. Anestezi yapılan farelerin deney sonuna kadar takibi

NOT: Anestezi, 5 μL/g vücut ağırlığı hacminde ve ketamin.c (50 μg/g) ve kslazin (5 μg/g) (1,2 μL/g) karışımında ketin (25 μg/g) enjeksiyonlarının değiştirilmesiyle her 35 dakikada bir yeniden indüklendirilir. Isıtılmış mikroskop odasının edinim sırasında açılması mümkün olmadığı için anestezik izleme, anestezinin tekrar yapılmasından önce ve sonra parmak sıkışması ile gerçekleştirilir. Benzer şekilde, her yeni video kaydına başlamadan önce parmak sıkışması gerçekleştirilir.

1. Gerekirse, s.c. enjeksiyonu ile alımı durdurun ve anesteziyi yeniden teşvik edin.
   1. Fare kafasını hareket ettirmemeye dikkat etmenin, sırtın derisini sol elin başparmağı ve işaret parmağı arasında kıstırın. Deri altı anesteziyi sağ eli kullanarak arka cildin kıvrımlarına enjekte edin (veya solaklar için tam tersi).
2. Halkada salin olup olmadığını kontrol edin ve gerekirse taze salinle doldurun. Sonraki 35 dakika boyunca kayda devam edin ve kayıt süresi boyunca benzer şekilde devam edin.
3. Deneyin sonunda, fareyi uyanmadan önce servikal çıkık ile ötenazi yapın.
   NOT: Fare, yerel etik ve hayvan refahı komitesi ile aynı fikirde olarak maksimum 3 saat boyunca uyuşturulur.

4. İki fotonlu görüntüleme

NOT: Mikroskop ve ilgili ekipman hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosuna bakın. Görüntüler rezonans tarayıcı (12 veya 8 kHz) ile kaydedildi. Pikseller her iki yönde de kaydedildikçe hız alımını artırmak için çift yönlü mod kuruldu; bu nedenle, fazdaki herhangi bir uyumsuzluk kontrol paneli "faz düzeltme" ile düzeltilmelidir. Son olarak, satın alma hızı ile sinyal-gürültü oranı arasında bir uzlaşma olarak uyarlanmış bir ortalama kuruldu.

1. Lazer ve rezonans tarayıcı da dahil olmak üzere iki foton mikroskobu kapatın (çıkış lazer gücü genellikle lazere bağlı olarak ~1.8-2.5 W).
2. Seçilen floroforlar için uygun lazer dalga boylarını ayarlayın. Yayılan ışıkların geri kazanımı için uygun dalga boylarını ayarlayın.
   NOT: Burada, AlexaFluor-488 ve Qtracker-655'i aynı anda heyecanlandırmak ve tespit etmek için sırasıyla 913 nm dalga boyu ve hibrit dedektörler (500-550 nm ve 575-625 nm) kullanıldı.
3. İntrajuguler kateteri kullanarak, vaskülatları etiketlemek için floresan izleyiciyi enjekte edin (Qtracker-655; Malzeme Masası). Maksimum 150 μL/deney için saatte bir yenilenen 0,2 μM'de bir çözeltinin 50 μL/faresi enjekte edin.
   NOT: Yüksek moleküler ağırlıklı dektran¹gibi diğer izleyiciler kullanılabilir. Bu durumda, kan viskozitesi dekstran ile değiştirilebilir ve bazı hemoheolojik parametreleri değiştirebilirsiniz.
4. Mikroskop aşamasını destek ve fare ile mikroskop hedefinin altına yerleştirin. Yüzüğün her zaman tuzlu suyla dolu olup olmadığını kontrol edin ve hedefi daldırin. Sinüzoid damarlar boyunca hizalanmış kemik iliği damarlarını (kırmızı) ve megakaryositlerin (yeşil) varlığını bulmak için epifluoresans kullanın.
   NOT: Kafatası kemiği 100 μm^2'dendaha düşük bir kalınlığa sahiptir. İlik kemiğin altında bulunur ve floresan yeşil megakaryositler ve Qtracker-655 ile etiketlenmiş yoğun kırmızı anastomozlu sinüzoid damarlar tarafından kolayca tanınır.
5. Uzun satın almalar (megakaryositler, proplateletler)
   1. İlgi çekici bölgeyi arayın. Yukarıda belirtildiği gibi görüntü alma parametrelerini uygulayın.
   2. Uzun alımlar için (örneğin, proplatelet oluşumunun veya uzamasının görselleştirilmesi), 8 kHz rezonans tarayıcı kullanarak optimize edilmiş aralıklarla (genellikle 0,85 ila 1,34 μm arasında) z yığını görüntüler elde edin.
      NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı alım hızını artırabilir.
   3. Tüm megakaryosit ve tekneyi görselleştirmek için 384 x 384 piksel görüntü alın. İyi çözünürlükte hızlı alım için istenildiği gibi hat ortalamasını kullanın. Proplatelet görselleştirme için genellikle 10 s veya 30 s olmak üzere görüntü yığını alımının zaman aralığını belirleyin.
      NOT: Burada, 8 kHz rezonans tarayıcı ile 1 görüntü/10 sn elde etmeyi sağlayan daha yüksek bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için ortalama 8 hat kullanıldı. Canlı edinme sırasında hat ortalamasına izin verildiğine emin olun.
6. Kısa ve hızlı alım (trombositler)
   NOT: Trombosit hızı gibi hızlı olayların daha kısa sürede eldeılması için kare alma oranını en üst düzeye çıkarmak önemlidir. Uygun alım türünün seçilmesi, kare alım hızını (örneğin, "xyt" alan-zaman alım türü) optimize edecektir.
   1. Simge durumuna küçültün (örneğin, 256 x 90 piksel) ve gerekirse görüntüleme alanını döndürerek görüntü boyutunu damara ayarlayın.
   2. Mevcut en yüksek tarama hızını kullanın.
   3. Çift yönlü tarama kullanın.
      NOT: Çift yönlü tarama için fazın iyi ayarlandığından emin olun.
   4. Görüntü tanımı ve edinmenin hızlılığı arasındaki en uygun uzlaşmayı bulmak için çizgi ortalamasını en aza indirin.
      NOT: Trombosit hızı ölçümleri için, elde edinme hızını artırmaya yardımcı oluyorsa pikselleştirilmiş bir görüntü yeterli olabilir.
   5. Edinme hızlılığını artırmak için z yığınını en aza indirin. Trombosit hızını ölçmek için yalnızca 1 z yığını elde etmek yeterlidir. Trombosit hızını ölçmek için 10-20 s'ye alın.
      NOT: 12 kHz rezonans tarayıcı ile bu koşullar kullanılarak en fazla 133 kare/sn elde edilebilir. Parametreler koşullara uyarlanmalıdır. Bazı gemilerde trombosit hızı, trombosit hızını bu ayarlarla güvenilir bir şekilde ölçmek için çok yüksektir.
7. Proplatelet genişliği ve uzunluğu ölçümü
   NOT: Leica yazılımında elde edilen LIF dosyalarını ImageJ ile yüklemek için, önce Bio-Formats Importer'ı kullanmak üzere ImageJ'e LOCI eklentisini indirip yükleyin.
   1. Proplatelet genişliği
      1. Filmi ImageJ ile açın. Genişlik ölçümü yapmak için, sadece proplateletlerin filmini kapsız kullanın. Farklı kanalları ayırmak için Görüntü'ye tıklayın| Kanalları renklendir ve Böl 'useçin.
      2. Z yığını filmi için Görüntü'ye tıklayarak her zaman noktası için ortalama bir z-projeksiyonu yapın| Yığınlar ve Z Projesi 'niseçin. Projeksiyon türü için, ortalama Yoğunlukgirin.
      3. Gürültüyü kaldırmak için görüntüyü tedavi edin. İşlem'e tıklayarak arka planı çıkarın| Arka planı çıkarın ve Yuvarlanan top yarıçapını uygulayın: 50,0 piksel. İşlem ve Düzgünleştir 'e tıklayarak görüntüyü pürüzsüzleştirin.
      4. Proplatetin tabanına yakın bir çizgiyi takip edin (megakaryosit yakınında, başka bir nesneden kaçınarak).
         NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla 'ya tıklayarak istenen birimdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayıunutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir.
      5. Yoğunluk profilini çizin, gauss eğrisini takın ve Tam Genişliği Yarım Maksimum (FWHM) olarak hesaplayın. Bunun için, Eklentiler'e tıklayarak aşağıdaki komut dosyasını bir makroya yazın| Yeni'yi seçin ve Makro'yu tıklatarak çalıştırın| Makro çalıştır: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussian",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * kare( 2 * log(2) ) * sigma; yazdır(FWHM).
         NOT: Hat taramasında proplatelet yoğunluğuna karşılık gelen tek bir tepe noktası olduğundan emin olun.
      6. Proplatetin ortalama genişliğini elde etmek için 1 dilim üzerinde 4.7.5 adımında açıklanan veya zaman içinde tekrarlanan eylemleri gerçekleştirin
   2. Proplatelet uzunluğu
      1. Proplatlet boyunca, megakaryosit'e yakın tabandan üste doğru bir çizgi takip edin. Proplatelet şeklini izlemek için parçalı bir çizgi kullanın. Her zaman noktası için tekrarlayın.
      2. Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın: Analiz | tıklayın Araçlar'ı seçin ve Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni seçin. Bir klasördeki tüm satırları kaydetmek için Seçimi Kaldır'daki Yatırım Getirisi Yöneticisi'ni | Daha fazla ve tıklayın Kaydet. Yatırım Getirisi Yöneticisi'nden, sonuçlar tablosundan her satırın uzunluk değerini (Ölçü) ayıklayın.
         NOT: Analiz Et ve Ölçeği Ayarla'ya tıklayarak istenen birimlerdeki değeri elde etmek için görüntünün ölçeğini ayarlamayı unutmayın. Varsayılan olarak, görüntünün birimi piksel cinsindendir.
8. Trombosit hızı ölçümü
   NOT: Trombosit hızı, geminin içinde 10-20 sn'nin üzerinde akan floresan trombositlerin video kaydından hesaplanır. Döngüsel olarak tekrarlanan hat tarama verilerini elde etmek için ilk görüntü tedavisi gerçekleştirilir. Hareket, açısı hıza bağlı olan çizgilere yol açar ve hesaplanmasına izin verir. Burada hız, klasik Tekil Değer Ayrışması (SVD) yöntemi^15'tendaha sağlam olan Radon dönüşümünü kullanan bir yöntemle hesaplanmıştır.
   1. ImageJ ile görüntü muamelesi
      1. Filmi ImageJ ile açın. İşlem | tıklayarak Gauss Bulanıklaştırma filtresi uygulama Filtreler, Gauss Bulanıklığı'nın öğesini seçin ve Sigma (Yarıçapı): 2,00uygulayın. Akışı ölçmek için küçük bir bölge seçin ve akış yönünü izleyen 3 bitişik çizgiyi izleme.
         NOT: Analiz | tıklayarak yatırım getirisi yöneticisini kullanarak her satırı kaydetmeyi unutmayın Araçlar | Yatırım Getirisi Yöneticisi. Her satırı eklemek ve kaydetmek için Yatırım Getirisi Yöneticisi penceresinde Ekle'yi tıklatın; Seçimi Kaldır | önce tıklayın daha fazla ve sonra Tıklayın Kaydet.
      2. ImageJ hat tarama yazılımını kullanarak, Resim | tıklayarak her satır için bir kimograf oluşturun Yığınlar; Yeniden Kaydır'ı seçin ve aşağıdaki parametreleri uygulayın: Çıkış aralığı (mikronlar): 1.000 / Dilim sayısı: 1 / İnterpolasyondan kaçının. Elde eden uzay-zaman görüntülerini kaydedin.
         NOT: Elde eden görüntü, zaman içinde kan akışındaki trombositlerin doğrusal hareketine karşılık gelen çizgileri gösterir. Bir çizginin açısı hızın bir işlevidir.
   2. Matlab veya GNU Octave yazılımı kullanarak hız ölçümü
      NOT: Kan akışındaki trombositlerin hızı, Drew ve işbirlikçileri tarafından açıklanan Radon dönüşümüne dayanan bir hesaplama analizi yöntemi kullanılarak uzay-zaman görüntülerinden tahmin edilmektedir¹⁵. Bu matematiksel yöntemin açıklaması bu incelemenin kapsamı dışındadır ve okuyucu, hesaplama¹⁵ile ilgili ayrıntılar için Drew ve ark. Hem Matlab kodu hem de daha fazla bilgi https://www.drew-lab.org/code web sitelerinde mevcuttur.
      1. Matlab veya GNU Octave yazılımını kullanarak kodu açın.
         NOT: Kod, istenen çalışmaya göre adaptasyon gerektirebilir.
      2. Değeri, aynı kap kısmında çizilen bitişik çizgilere karşılık gelen 3 uzay-zaman görüntüsünden çıkarın. Geminin bu kısmı için ortalama trombosit akış hızı değerini hesaplayın.
         NOT: Sonucu doğru ölçü birimine (örneğin, μm/s) dönüştürmeyi unutmayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak, floresan izleyici Qtracker-655, kafatası kemik iliğindeki anastomoz ilik sinüzoid damarlarını ve okların tasvir ettiği akış yönünü görüntülemek için intravenöz olarak uygulandı (Şekil 4A, sol). mTmG fareleri kullanılarak, eGFP floresan trombositler her gemi dalında 20 sn'nin üzerinde kaydedildi ve hızları ImageJ ve GNU Octave yazılımı kullanılarak ölçüldü (Şekil 4A, sağ). Akış hızı ve yönündeki h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Trombosit oluşum mekanizmaları kemik iliği ortamına oldukça bağlıdır. Bu nedenle intravital mikroskopi, süreci gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için sahada önemli bir araç haline gelmiştir. Floresan megakaryositli fareler, Cre rekombinazını megakaryositlerde ifade eden fareleri koşullu floresan gen ifade kaseti içeren herhangi bir floxed muhabir fare ile geçerek elde edilebilir. Burada, mTmG muhabir fareleri kullanıldı (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent