In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

Zusammenfassung

Wir beschreiben hier die Methode zur Abbildung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Schädelknochens lebender Mäuse mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie.

Zusammenfassung

Blutplättchen werden von Megakaryozyten produziert, spezialisierten Zellen im Knochenmark. Die Möglichkeit, Megakaryozyten in Echtzeit und ihre native Umgebung abbilden zu können, wurde vor mehr als 10 Jahren beschrieben und wirft ein neues Licht auf den Prozess der Thrombozytenbildung. Megakaryozyten verlängern längliche Vorsprünge, Pro thrombozyten genannt, durch die Endothelauskleidung von Sinusgefäßen. Dieser Artikel stellt ein Protokoll vor, um gleichzeitig in Echtzeit fluoreszierend markierte Megakaryozyten im Schädelknochenmark und in den Sinusgefäßen abbilden zu können. Diese Technik beruht auf einer kleinen Operation, die den Schädel intakt hält, um Entzündungsreaktionen zu begrenzen. Der Mauskopf wird mit einem Ring immobilisiert, der auf den Schädel geklebt ist, um Bewegungen am Atmen zu hindern.

Mit Hilfe der Zwei-Photonen-Mikroskopie können Megakaryozyten bis zu einigen Stunden visualisiert werden, was die Beobachtung von Zellvorsprüngen und Blutplättchen im Prozess der Dehnung in Sinusgefäßen ermöglicht. Dies ermöglicht die Quantifizierung mehrerer Parameter, die sich auf die Morphologie der Vorsprünge (Breite, Länge, Vorhandensein von Verengungsbereichen) und deren Dehnungsverhalten (Geschwindigkeit, Regelmäßigkeit oder Vorhandensein von Pausen oder Rückzugsphasen) beziehen. Diese Technik ermöglicht auch die gleichzeitige Aufzeichnung von zirkulierenden Blutplättchen in sinusförmigen Gefäßen, um die Thrombozytengeschwindigkeit und die Blutflussrichtung zu bestimmen. Diese Methode ist besonders nützlich, um die Rolle von Genen von Interesse bei der Thrombozytenbildung mit genetisch veränderten Mäusen zu untersuchen und ist auch für pharmakologische Tests (Untersuchung der Mechanismen, Bewertung von Medikamenten bei der Behandlung von Thrombozytenproduktionsstörungen) möglich. Es ist zu einem unschätzbaren Werkzeug geworden, insbesondere zur Ergänzung von In-vitro-Studien, da heute bekannt ist, dass die In-vivo- und In-vitro-Pro thrombozytenbildung auf verschiedenen Mechanismen beruht. Es hat sich beispielsweise gezeigt, dass in vitro Mikrotubuli für die Thrombozytenverlängerung per se benötigt werden. In vivodienen sie jedoch eher als Gerüst, wobei die Dehnung hauptsächlich durch Blutflusskräfte gefördert wird.

Einleitung

Blutplättchen werden von Megakaryozyten-spezialisierten Zellen im Knochenmark produziert. Wie genau Megakaryozyten Blutplättchen im Kreislauf freisetzen, blieb aufgrund der technischen Herausforderung bei der Beobachtung von Echtzeitereignissen durch den Knochen lange unklar. Die Zwei-Photonen-Mikroskopie hat dazu beigetragen, diese Herausforderung zu meistern und zu großen Fortschritten beim Verständnis des Thrombozytenbildungsprozesses geführt. Die ersten in vivo Megakaryozytenbeobachtungen wurden von Andrian und Kollegen im Jahr 2007 gemacht, mit der Visualisierung von fluoreszierenden Megakaryozyten durch den Schädel¹. Dies war möglich, weil die Knochenschicht im frontoparietalen Schädel junger erwachsener Mäuse eine Dicke von einigen zehn Mikrometern aufweist und ausreichend transparent ist, um die Visualisierung fluoreszierender Zellen im darunter liegenden Knochenmark zu ermöglichen².

Nachfolgende Studien wandten dieses Verfahren an, um die Pro thrombozytenbildung unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten und die zugrunde liegenden Mechanismen^3,4^,5,6zu entschlüsseln . Diese Studien lieferten definitive Beweise dafür, dass Megakaryozyten Protrusionen, sogenannte Pro thrombozyten, dynamisch durch die Endothelbarriere der Sinusgefäße verlängern (Abbildung 1). Diese Proplättchen werden dann als lange Fragmente freigesetzt, die mehrere hundert Blutplättchen im Volumen darstellen. Die Blutplättchen werden nach dem Umbau der Blutplättchen in der Mikrozirkulation der nachgeschalteten Organe, insbesondere in der Lunge, gebildet⁷. Bis heute sind der genaue Prozess und die molekularen Mechanismen jedoch weiterhin Gegenstand von Diskussionen. Zum Beispiel unterscheidet sich die vorgeschlagene Rolle der Zytoskelettproteine bei der Verlängerung von Blutplättchen zwischen in vitro und in vivo ³, und Unterschiede in der Pro thrombozytenbildung wurden unter entzündlichen Bedingungen nachgewiesen⁶. Erschwerend kommt hinzu, dass eine kürzlich durchgeführte Studie das prothrombozytengetriebene Konzept in Betracht stellte und vorschlug, dass in vivoBlutplättchen im Wesentlichen durch einen membranbewegenden Mechanismus auf Megakaryozytenebene gebildet werden⁸.

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark aus dem Schädelknochen bei lebenden Mäusen mit einem minimalinvasiven Verfahren vor. Ähnliche Ansätze wurden bereits beschrieben, um andere Markzellen zu visualisieren, insbesondere hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen⁹. Der Fokus liegt hier auf der Beobachtung von Megakaryozyten und Blutplättchen, um einige Parameter zu beschreiben, die gemessen werden können, insbesondere Prothrombozytenmorphologien und Thrombozytengeschwindigkeit. Dieses Protokoll zeigt, wie man einen Katheter in die Jugularvene einführt, um fluoreszierende Tracer und Medikamente zu injizieren und durch den Schädelknochen zu beobachten. Der Calvarialknochen wird durch eine kleinere Operation freigelegt, so dass ein Ring auf den Knochen geklebt wird. Dieser Ring dient dazu, den Kopf zu immobilisieren und Bewegungen durch Atmung zu verhindern und eine mit Kochsalzlösung gefüllte Tasse als Tauchmedium der Linse zu bilden. Diese Technik eignet sich gut, um i) in Echtzeit die Sinusgeometrie und Megakaryozyten zu beobachten, die mit der Gefäßwand interagieren; ii) Megakaryozyten im Prozess der Prothrombozytenbildung, -dehnung und -freisetzung zu verfolgen; und iii) Thrombozytenbewegungen messen, um den komplexen sinusförmigen Blutfluss zu überwachen. Daten, die mit diesem Protokoll gewonnen wurden, wurden kürzlich veröffentlicht³.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den europäischen Normen 2010/63/EU und dem CREMEAS-Ausschuss für die Ethik von Tierversuchen der Universität Straßburg (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility Agreement N°: G67-482-10, Projektvereinbarung Nr.: 2018061211274514) durchgeführt.

1. Vorbereitung von Mäusen und Einsetzen eines Katheters in die Vena jugularis

HINWEIS: Hier wurden männliche oder weibliche, 5-7 Wochen alte mTmG-Reportermäuse verwendet (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}gekreuzt mit Pf4-cre-Mäusen¹¹, was eine intensive grüne Fluoreszenzmarkierung in Megakaryozyten und Blutplättchen ermöglicht¹². Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, heizen Sie die Heizkammer des Mikroskops für einige Stunden vor.

1. Transportieren Sie die Maus in den Bildgebungsraum und fahren Sie mit der Anästhesie fort.
   1. Betäubung der Maus durch intraperitoneale (i.p.) Injektion einer Lösung von Ketamin (Ketamin (100 μg/g) und Xylazin (10 μg/g) (5 μL/g).
      HINWEIS: Die wiederholte Verabreichung von Ketamin / Xylazin wird hier verwendet und funktioniert gut, erfordert jedoch die Unterbrechung der Aufnahme für eine regelmäßige Wiedereinleitung. Alternativ, wenn ein Anästhesiegerät verfügbar ist, kann die Induktion der Anästhesie mit Ketamin / Xylazin durchgeführt und anschließend unter Inhalation von Gasen (Mischung aus Isofluran, Luft und Sauerstoff) aufrechterhalten werden.
   2. Ersetzen Sie das Tier in seinem Käfig, bis es eine tiefe Betäubung erreicht. Legen Sie die Maus für alle nachfolgenden Manipulationen auf eine beheizte Platte, die bei 37 °C erwärmt ist.
      HINWEIS: Während das Tier eine tiefe Betäubung erreicht, schalten Sie das Mikroskop und alle Geräte ein (siehe Abschnitt 4.1) und richten Sie die verschiedenen Parameter ein, die erforderlich sind (siehe Abschnitt 4.2), um das Experiment nach Abschluss der Operation zu starten. Hier dauert der Vorgang nur 3 h und ist terminal. Die Maus wird nach dem Experiment eingeschläfert, ohne aufzuwachen. Daher ist die Ethanoldesinfektion für Haut und Instrumente ausreichend. Abhängig von den institutionellen Richtlinien oder wenn das Verfahren länger dauern würde, sollten jedoch vollständigere Desinfektionsmethoden wie drei abwechselnde Peelings mit Betadin / Povidon und Alkohol verwendet werden.
2. Installieren Sie einen Katheter in der Vena jugularis.
   HINWEIS: Es ist wichtig, eine mikrobielle Kontamination während der Operation so weit wie möglich zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Haut sorgfältig mit 70% Ethanol (EtOH) zu desinfizieren, bevor Sie mit der Operation fortfahren. Verwenden Sie immer sterilisierte Scheren und Pinzetten und spülen Sie sie regelmäßig in 70% EtOH aus. Arbeiten Sie an einem sauberen Ort und tragen Sie eine Gesichtsmaske. Ein 22 G "Over-the-Needle"-Katheter, bestehend aus einer Nadel in einem Kunststoffschlauch, wird für die intravenöse Injektion verwendet (siehe Materialtabelle).
   1. Legen Sie die Maus auf den Rücken und fixieren Sie die vorderen Beine mit chirurgischem Klebeband, um den Hals zu dehnen (Abbildung 2A). Desinfizieren Sie den Hals mit 70% Ethanol.
      HINWEIS: Der Einfachheit halber kann der Hals vor der Operation rasiert werden. Wenn das Verfahren länger dauert, muss eine sorgfältige Rasur für die richtige aseptische Technik durchgeführt werden.
   2. Machen Sie einen 0,7-1 cm großen Schnitt über die rechte oder linke Jugularvene mit einer sterilen Schere. Dehnen Sie das angrenzende Bindegewebe, um die äußere Vena jugularis und die Oberseite des Brustmuskels freizulegen (Abbildung 2A).
   3. Füllen Sie den Katheter mit warmer, steriler physiologischer Kochsalzlösung. Führen Sie den Katheter nach dem Eindringen durch den Brustmuskel in die Vene ein (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Achten Sie darauf, Luftblasen im Katheter zu vermeiden. Es ist wichtig, den Katheter durch den Muskel einzuführen, um Blutungen zu verhindern, da der Muskel einen Kompressionspunkt bildet. Selbst Mäuse mit Hämostasedefekten, wie Itgb3^-/- Mäuse, bluten bei Kathetereinführung mit diesem Ansatz nicht.
   4. Entfernen Sie vorsichtig die Nadel und bewegen Sie den Katheter bei Bedarf vorsichtig tiefer in die Vene. Verbinden Sie die Spritze und stabilisieren Sie den Katheter, indem Sie einen Tropfen chirurgischen Klebstoffs hinzufügen (Materialtabelle).
      HINWEIS: Es ist möglich, einen Katheter in die Schwanzvene einzuführen, obwohl dies etwas Übung erfordert, da die Vene ein kleineres Kaliber hat. Dies ist besonders schwierig bei der Verwendung von Mäusen mit dunklem Haar, deren Schwanzvene kaum sichtbar ist. Aufgrund seines größeren Kalibers kann die Positionierung des Katheters in der Vena jugularis es ermöglichen, größere Volumina oder wiederholte Behandlungen zuverlässiger zu injizieren. Bitte beachten Sie, dass die Spritze zum ersten Mal mit warmer Kochsalzlösung gefüllt wird, und vergessen Sie nicht, das tote Volumen vor dem Injizieren der Arzneimittellösung zu injizieren.
   5. Stellen Sie die Maus vorsichtig in eine Bauchlage zurück (Abbildung 2C). Tragen Sie Gel (Table of Materials) auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.

2. Operation und Installation des Schädelrings

HINWEIS: Die volle Unterstützung für die Mausinstallation besteht aus 4 Teilen, einem Block und einer Platte, dem Ring zum Halten des Mauskopfes und einer Schraube zur Befestigung des Rings am Block (Abbildung 3A). Alle Elemente der Unterstützung wurden aus i.materialise.com durch 3D-Druck erhalten. Die Platte besteht aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)-Polymer, dem Block und der Schraube aus Edelstahl und dem Ring aus hochwertigem Edelstahl (hochdetaillierter Edelstahl) (siehe Ergänzende Abbildung S1 für Abmessungen und ergänzende Materialien für die 3D-Druckdateien). Der Block wird dauerhaft am Träger befestigt, entweder verschraubt oder geklebt. Sobald der Ring am Mausschädel befestigt ist, sollte er an den Blockhalter geschraubt werden (Abbildung 3A).

1. Befeuchten Sie das Haar auf der Kopfhaut mit einem Papiertuch, das zur Desinfektion mit 70% Ethanol nass ist. Entfernen Sie alle losen Haare mit einem nassen Papiertuch.
   HINWEIS: Aus Gründen der Bequemlichkeit kann die Kopfhaut vor der Operation rasiert werden.
2. Schneiden Sie die Kopfhaut ein, indem Sie ein T an der Mittellinie bis zu 1 cm und zwischen den Ohren bilden, um das Kalvarium mit sterilen feinen Scheren und Pinzetten freizulegen.
   HINWEIS: Der Ring wird so positioniert, dass er die Frontal- und Parietalknochen überlappt (Abbildung 3B).
3. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie das Periost vorsichtig mit Schere und Pinzette. Verwenden Sie einen sterilen Wattestäbchen, der mit physiologischer Kochsalzlösung getränkt ist, um das gesamte Periost und alle Ablagerungen oder Haare zu entfernen, die die Bildgebung verändern könnten.
   HINWEIS: Um Entzündungsreaktionen zu begrenzen, achten Sie sehr darauf, den Knochen nicht zu beschädigen.
4. Entfernen Sie alle Blutspuren, indem Sie mit Kochsalzlösung spülen, und trocknen Sie den Knochen schnell mit einem trockenen Wattestäbchen. Tragen Sie das Klebegel auf den Ring auf, positionieren Sie es auf dem freiliegenden Knochen und halten Sie es für einige Sekunden, so dass der Ring fest am Schädel befestigt ist.
   HINWEIS: Es darf kein Klebstoff in das Beobachtungsfeld gelangen, da dies zu unerwünschter Autofluoreszenz führen kann.
5. Befeuchten Sie den Schädel leicht mit einem Wattestäbchen, das in physiologische Kochsalzlösung getaucht ist.
6. Bereiten Sie die Silikon-Dentalpaste vor, indem Sie vorsichtig 1:1 blaue und gelbe Komponenten mischen. Tragen Sie Zahnpaste rund um den Ring zum Versiegeln auf, um ein Auslaufen während der Bildgebung zu verhindern. Entfernen Sie vorsichtig alle Zahnpasten oder Klebstoffe, die möglicherweise in den Ring gelangt sind.
7. Füllen Sie den Ring mit Kochsalzlösung und überprüfen Sie auf Leckagen.
   HINWEIS: Die Kochsalzlösung dient als Tauchmedium für das Mikroskopobjektiv. Blutungen können kritischer sein, wenn Mäuse mit hämostasebedingten Defekten verwendet werden. Es ist wichtig, zu verhindern, dass Blut in den Ring gelangt, da dies die weitere Bildgebung verwischen kann.
8. Setzen Sie die Maus auf den Träger, und schrauben Sie den Ring an den Blockhalter (Abbildung 3C). Legen Sie gefaltete Kompressen unter den Kopf des Tieres, um den Kopf anzuheben und ein Ablösen des Rings vom Schädel zu verhindern.
   HINWEIS: Der Kopf ist direkt fixiert, so dass er Bildbewegungen durch Atmung verhindert.
9. Positionieren Sie die Stütze und die Mausanordnung in der beheizten Mikroskopkammer (Abbildung 3D).
   HINWEIS: Achten Sie darauf, den eingeführten Katheter zu keinem Zeitpunkt zu verdrängen.

3. Nachbeobachtung der betäubten Mäuse bis zum Ende des Experiments

HINWEIS: Die Anästhesie wird alle 35 Minuten durch abwechselnde subkutane (s.c.) Injektionen von Ketamin (25 μg/g) in einem Volumen von 5 μL/g Körpergewicht und einer Mischung aus Ketamin (50 μg/g) und Xylazin (5 μg/g) (1,2 μL/g) erneut induziert. Da es nicht möglich ist, die beheizte Mikroskopkammer während der Erfassung zu öffnen, wird vor und nach der erneuten Verabreichung des Anästhetikums durch Zehenklemmen eine anästhetische Überwachung durchgeführt. In ähnlicher Weise wird vor Beginn jeder neuen Videoaufnahme ein Zehenknen durchgeführt.

1. Stoppen Sie bei Bedarf die Akquise und induzieren Sie die Anästhesie durch s.c. Injektion.
   1. Achten Sie darauf, den Mauskopf nicht zu bewegen, und kneifen Sie die Haut des Rückens zwischen Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Subkutan das Anästhetikum mit der rechten Hand in die Falte der Rückenhaut injizieren (oder umgekehrt bei Linkshändern).
2. Überprüfen Sie das Vorhandensein von Kochsalzlösung im Ring und füllen Sie sie gegebenenfalls mit frischer Kochsalzlösung. Fahren Sie für die nächsten 35 Minuten mit der Aufnahme fort und fahren Sie für die Aufnahmedauer ähnlich fort.
3. Am Ende des Experiments euthanasieren Sie die Maus durch zervikale Luxation, bevor sie aufwacht.
   HINWEIS: Die Maus wird in Absprache mit dem örtlichen Ethik- und Tierschutzkomitee für eine maximale Dauer von 3 h betäubt.

4. Zwei-Photonen-Bildgebung

HINWEIS: Details zum Mikroskop und der zugehörigen Ausrüstung finden Sie in der Materialtabelle. Die Bilder wurden mit einem Resonanzscanner (12 oder 8 kHz) aufgenommen. Der bidirektionale Modus wurde eingerichtet, um die Geschwindigkeitserfassung zu erhöhen, da Pixel in beide Richtungen aufgezeichnet werden. Daher muss jede Diskrepanz in der Phase mit dem Bedienfeld "Phasenkorrektur" korrigiert werden. Schließlich wurde eine angepasste Mittelwertbildung als Kompromiss zwischen Erfassungsgeschwindigkeit und Signal-Rausch-Verhältnis eingerichtet.

1. Schalten Sie das Zwei-Photonen-Mikroskop einschließlich Laser und Resonanzscanner ein (Ausgangslaserleistung normalerweise ~ 1,8-2,5 W je nach Laser).
2. Stellen Sie die geeignete Laserwellenlänge für die ausgewählten Fluorophore ein. Stellen Sie die geeignete Wellenlänge für die Rückgewinnung von emittierten Lichtern ein.
   HINWEIS: Hier wurden eine Wellenlänge von 913 nm und Hybriddetektoren (500-550 nm und 575-625 nm) verwendet, um AlexaFluor-488 bzw. Qtracker-655 gleichzeitig anzuregen und zu detektieren.
3. Injizieren Sie mit dem intrajugulären Katheter den fluoreszierenden Tracer, um das Gefäßsystem zu kennzeichnen (Qtracker-655; Tabelle der Materialien). Injektion von 50 μL/Maus einer Lösung bei 0,2 μM, die einmal pro Stunde für maximal 150 μL/Experiment erneuert wird.
   HINWEIS: Andere Tracer können verwendet werden, wie z.B. dextran¹mit hohem Molekulargewicht. Berücksichtigen Sie in diesem Fall, dass die Blutviskosität durch Dextran verändert werden kann und einige hämorheologische Parameter ändern kann.
4. Platzieren Sie den Mikroskopstand mit der Unterstützung und maus unter das Objektiv des Mikroskops. Überprüfen Sie, ob der Ring immer mit Kochsalzlösung gefüllt ist und tauchen Sie das Objektiv ein. Verwenden Sie Epifluoreszenz, um die Knochenmarkgefäße (rot) und das Vorhandensein von Megakaryozyten (grün) entlang sinusförmiger Gefäße zu lokalisieren.
   HINWEIS: Der Schädelknochen hat eine Dicke von weniger als 100 μm². Das Mark befindet sich unter dem Knochen und ist leicht an den fluoreszierenden grünen Megakaryozyten und den dichten roten anastomosierten Sinusgefäßen zu erkennen, die mit Qtracker-655 markiert sind.
5. Lange Akquisitionen (Megakaryozyten, Blutplättchen)
   1. Suchen Sie nach der Region von Interesse. Wenden Sie die Bilderfassungsparameter wie oben erwähnt an.
   2. Für lange Aufnahmen (z. B. Visualisierung der Pro thrombozytenbildung oder -dehnung) erfassen Sie Z-Stack-Bilder mit optimierten Intervallen (normalerweise zwischen 0,85 und 1,34 μm) mit einem 8 kHz-Resonanzscanner.
      HINWEIS: Ein 12 kHz Resonanzscanner kann die Erfassungsgeschwindigkeit erhöhen.
   3. Erfassen Sie 384 x 384 Pixel bilder, um den gesamten Megakaryozyten und das gesamte Gefäß zu visualisieren. Verwenden Sie die Linienmittelung wie gewünscht für eine schnelle Erfassung mit guter Auflösung. Bestimmen Sie das Zeitintervall der Bildstapelerfassung, normalerweise 10 s oder 30 s für die Proplatelet-Visualisierung.
      HINWEIS: Hier wurde ein Zeilenmittelwert von 8 verwendet, um ein höheres Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, was die Aufnahme von 1 Bild / 10 s mit einem 8 kHz Resonanzscanner ermöglichte. Stellen Sie sicher, dass die Linienmittelung während der Live-Erfassung zulässig ist.
6. Kurze und schnelle Erfassung (Blutplättchen)
   HINWEIS: Für eine kürzere Erfassung schneller Ereignisse, wie z. B. der Thrombozytengeschwindigkeit, ist es wichtig, die Bilderfassungsrate zu maximieren. Durch die Auswahl des richtigen Erfassungstyps wird die Bilderfassungsrate optimiert (d. h. ein Raum-Zeit-Erfassungstyp "xyt").
   1. Minimieren Sie (z. B. 256 x 90 Pixel) und passen Sie die Bildgröße bei Bedarf an das Gefäß an, indem Sie das Bildfeld drehen.
   2. Verwenden Sie die höchste verfügbare Scangeschwindigkeit.
   3. Verwenden Sie bidirektionales Scannen.
      HINWEIS: Stellen Sie beim bidirektionalen Scannen sicher, dass die Phase gut eingestellt ist.
   4. Minimieren Sie die Linienmittelung, um den optimalen Kompromiss zwischen Bilddefinition und Aufnahmeschnelligkeit zu finden.
      HINWEIS: Für Thrombozytengeschwindigkeitsmessungen kann ein pixeliges Bild ausreichen, wenn es dazu beiträgt, die Geschwindigkeit der Erfassung zu erhöhen.
   5. Minimieren Sie den Z-Stack, um die Erfassungsschnelligkeit zu erhöhen. Die Erfassung von nur 1 z-Stack reicht aus, um die Thrombozytengeschwindigkeit zu quantifizieren. Erfassen Sie für 10-20 s, um die Thrombozytengeschwindigkeit zu messen.
      HINWEIS: Unter diesen Bedingungen können mit einem 12 kHz Resonanzscanner maximal 133 Bilder/s erzielt werden. Die Parameter müssen an die Gegebenheiten angepasst werden. In einigen Gefäßen ist die Thrombozytengeschwindigkeit dennoch zu hoch, um die Thrombozytengeschwindigkeit mit diesen Einstellungen zuverlässig zu quantifizieren.
7. Prothrombozytenbreite und Längenmessung
   HINWEIS: Um LIF-Dateien zu laden, die auf Leica Software mit ImageJ erhalten wurden, laden Sie zuerst das LOCI-Plug-in herunter und installieren Sie es auf ImageJ, um den Bio-Formats Importer zu verwenden.
   1. Prothrombozytenbreite
      1. Öffnen Sie den Film mit ImageJ. Um eine Breitenmessung durchzuführen, verwenden Sie nur den Film der Proplättchen ohne das Gefäß. Um die verschiedenen Kanäle zu trennen, klicken Sie auf Bild| Farbe und wählen Sie Kanäle teilen.
      2. Erstellen Sie für einen Z-Stack-Film eine durchschnittliche Z-Projektion für jeden Zeitpunkt, indem Sie auf Bild klicken| Stapeln und Z-Projekt auswählen. Geben Sie für Projektionstyp die durchschnittliche Intensität ein.
      3. Behandeln Sie das Bild, um das Rauschen zu entfernen. Subtrahieren Sie den Hintergrund, indem Sie auf Prozess klicken| Subtrahieren Sie den Hintergrund und wenden Sie den Rollkugelradius an: 50,0 Pixel. Glätten Sie das Bild, indem Sie auf Verarbeiten und Glättenklicken.
      4. Verfolgen Sie eine Linie in der Nähe der Basis des Prothrombozyten (in der Nähe des Megakaryozyten, wobei Sie jedes andere Objekt vermeiden).
         HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die Skalierung des Bildes einzustellen, um den Wert in der gewünschten Einheit zu erhalten, indem Sie auf Analysieren und Maßstab festlegenklicken. Standardmäßig wird die Einheit des Bildes in Pixeln dargestellt.
      5. Zeichnen Sie das Intensitätsprofil, passen Sie eine Gaußsche Kurve an und berechnen Sie die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM). Schreiben Sie dazu das folgende Skript in ein Makro, indem Sie auf Plugins klicken| Neu und wählen Sie Makro und führen Sie es aus, indem Sie auf Makro klicken| Makro ausführen: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gauß",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * Sigma; drucken(FWHM).
         HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass es nur einen einzigen Peak im Zeilenscan gibt, der der Pro thrombozytenintensität entspricht.
      6. Führen Sie die in Schritt 4.7.5 beschriebenen Aktionen auf 1 Slice aus oder wiederholen Sie sie im Laufe der Zeit, um die mittlere Breite des Prothrombozyten zu erhalten.
   2. Prothrombozytenlänge
      1. Verfolgen Sie eine Linie entlang des Prothrombozyten, von der Basis in der Nähe des Megakaryozyten bis zur Spitze. Verwenden Sie eine segmentierte Linie, um der Prothrombozytenform zu folgen. Wiederholen Sie es für jeden Zeitpunkt.
      2. Denken Sie daran, jede Zeile mit dem ROI Manager zu speichern: Klicken Sie auf Analyse | Tools und wählen Sie ROI Manager. Klicken Sie im ROI Manager-Fenster auf Hinzufügen, um jede Zeile wie ausgewählt zum Manager hinzuzufügen. Um alle Zeilen in einem Ordner zu speichern, klicken Sie im ROI Manager auf Auswahl aufheben | Mehr und klicken Sie auf Speichern. Extrahieren Sie aus dem ROI-Manager den Längenwert jeder Zeile (Measure) aus der Ergebnistabelle.
         HINWEIS: Vergessen Sie nicht, die Skalierung des Bildes einzustellen, um den Wert in den gewünschten Einheiten zu erhalten, indem Sie auf Analysieren und Skalieren festlegenklicken. Standardmäßig wird die Einheit des Bildes in Pixeln dargestellt.
8. Thrombozytengeschwindigkeitsmessung
   HINWEIS: Die Thrombozytengeschwindigkeit wird aus der Videoaufzeichnung von fluoreszierenden Blutplättchen berechnet, die über 10-20 s im Inneren des Gefäßes fließen. Eine Erstbildbehandlung wird durchgeführt, um zyklisch wiederholte Zeilenscandaten zu erhalten. Bewegung führt zu Streifen, deren Winkel von der Geschwindigkeit abhängt, was ihre Berechnung ermöglicht. Hier wurde die Geschwindigkeit mit einer Methode berechnet, die die Radontransformation verwendet, die robuster ist als die klassische Singular Value Decomposition (SVD) Methode¹⁵.
   1. Bildbehandlung mit ImageJ
      1. Öffnen Sie den Film mit ImageJ. Wenden Sie einen Gaußschen Weichzeichnerfilter an, indem Sie auf Prozess | klicken Filtern, wählen Sie Gaußsche Weichzeichnerund wenden Sigma (Radius): 2.00an. Wählen Sie einen kleinen Bereich aus, um den Durchfluss zu messen, und verfolgen Sie 3 benachbarte Linien, die der Strömungsrichtung folgen.
         HINWEIS: Vergessen Sie nicht, jede Zeile mit dem ROI Manager zu speichern, indem Sie auf Analyze | Werkzeuge | ROI-Manager. Klicken Sie im ROI Manager-Fenster auf Hinzufügen, um jede Zeile hinzuzufügen und zu speichern. Klicken Sie zuerst auf | deaktivieren Mehr und klicken Sie dann auf Speichern.
      2. Erstellen Sie mit der ImageJ-Zeilenscan-Software einen Kymographen für jede Zeile, indem Sie auf Image | Stapel; Wählen Sie Reslice und wenden Sie die folgenden Parameter an: Ausgangsabstand (Mikrometer): 1.000 / Slice-Anzahl: 1 / Interpolation vermeiden. Speichern Sie die resultierenden Raum-Zeit-Bilder.
         HINWEIS: Das resultierende Bild zeigt Streifen, die der linearen Bewegung der Blutplättchen im Blutfluss im Laufe der Zeit entsprechen. Der Winkel eines Streifens ist eine Funktion der Geschwindigkeit.
   2. Geschwindigkeitsmessung mit Matlab oder GNU Octave Software
      HINWEIS: Die Geschwindigkeit der Blutplättchen im Blutfluss wird aus den Raum-Zeit-Bildern mit einer computergestützten Analysemethode geschätzt, die auf der von Drew und Mitarbeitern beschriebenen Radontransformation basiert¹⁵. Die Beschreibung dieser mathematischen Methode geht über den Rahmen dieser Übersicht hinaus, und der Leser wird auf die Veröffentlichung von Drew et al. für Details zur Berechnung^{verwiesen 15}. Sowohl der Matlab-Code als auch weitere Informationen sind auf ihrer Website https://www.drew-lab.org/code verfügbar.
      1. Öffnen Sie den Code mit Matlab oder GNU Octave Software.
         HINWEIS: Der Code muss möglicherweise an die gewünschte Studie anpasst werden.
      2. Extrahieren Sie den Wert aus den 3 Raum-Zeit-Bildern, die den benachbarten Linien entsprechen, die im selben Gefäßabschnitt gezeichnet sind. Berechnen Sie den mittleren Thrombozytenströmungsgeschwindigkeitswert für diesen Teil des Behälters.
         HINWEIS: Vergessen Sie nicht, das Ergebnis in die richtige Maßeinheit (z. B. μm/s) umzurechnen.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieses Protokolls wurde der fluoreszierende Tracer Qtracker-655 intravenös verabreicht, um anastomosierte Knochensinusgefäße im Schädelknochenmark und die Fließrichtung, wie durch die Pfeile dargestellt, abzubilden (Abbildung 4A, links). Mit mTmG-Mäusen wurden eGFP-fluoreszierende Blutplättchen über 20 s in jedem Gefäßzweig aufgezeichnet und ihre Geschwindigkeit mit ImageJ und GNU Octave-Software gemessen(Abbildung 4A,rechts). Beachten...

Diskussion

Die Mechanismen der Thrombozytenbildung hängen stark von der Knochenmarkumgebung ab. Daher ist die intravitalen Mikroskopie zu einem wichtigen Werkzeug im Feld geworden, um den Prozess in Echtzeit zu visualisieren. Mäuse mit fluoreszierenden Megakaryozyten können durch Kreuzung von Mäusen, die die Cre-Rekombinase in Megakaryozyten exprimieren, mit allen gefloxten Reportermäusen erhalten werden, die eine bedingte fluoreszierende Genexpressionskassette enthalten. Hier wurden mTmG-Reportermäuse (B6.129(Cg)-Gt(ROSA...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent