ב-Vivo הדמיה דו-פוטונית של מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם של גולגולת העכבר

Summary

אנו מתארים כאן את השיטה להדמיית מגהקריוציטים ופרופלטלטים במח העצם הגולגולתית של עכברים חיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית.

Abstract

טסיות מיוצרות על ידי megakaryocytes, תאים מיוחדים הממוקמים במח העצם. האפשרות לדמיין megakaryocytes בזמן אמת ואת הסביבה הטבעית שלהם תוארה לפני יותר מ -10 שנים ושופכת אור חדש על תהליך היווצרות טסיות הדם. Megakaryocytes להאריך בליטות מוארכות, הנקראות proplatelets, דרך רירית אנדותל של כלי סינוסואיד. מאמר זה מציג פרוטוקול לתמונה בו זמנית בזמן אמת שכותרתו מגהקריוציטים במח העצם של הגולגולת ובכלי הסינוסואידים. טכניקה זו מסתמכת על ניתוח קטן השומר על הגולגולת שלמה כדי להגביל את התגובות הדלקתיות. ראש העכבר משותק עם טבעת המודבקת לגולגולת כדי למנוע מתנועות לנשום.

באמצעות מיקרוסקופיה דו פוטונית, ניתן לדמיין מגהקריוציטים עד כמה שעות, ומאפשר תצפית של בליטות תאים והתפשטות בתהליך התארכות בתוך כלי הסינוסואידים. זה מאפשר כימות של מספר פרמטרים הקשורים למורפולוגיה של בליטות (רוחב, אורך, נוכחות של אזורי התכווצות) והתנהגות התארכותם (מהירות, סדירות או נוכחות של הפסקות או שלבי נסיגה). טכניקה זו מאפשרת גם הקלטה סימולטנית של טסיות דם במחזור בכלי הסינוסואידים כדי לקבוע את מהירות טסיות הדם ואת כיוון זרימת הדם. שיטה זו שימושית במיוחד כדי לחקור את תפקידם של גנים מעניינים בהיווצרות טסיות דם באמצעות עכברים מהונדסים גנטית והיא גם נוחה לבדיקות פרמקולוגיות (חקר המנגנונים, הערכת תרופות בטיפול בהפרעות ייצור טסיות דם). זה הפך להיות כלי לא יסולא בפז, במיוחד כדי להשלים את המחקרים במבחנה כפי שהוא ידוע כיום כי היווצרות vivo ו אין ויטרו proplatelet להסתמך על מנגנונים שונים. הוכח, למשל, כי מיקרוטובולות במבחנה נדרשות להתארכות פרופלטלט כשלעצמה. עם זאת, ב vivo, הם מעדיפים לשמש פיגום, התארכות להיות מקודם בעיקר על ידי כוחות זרימת הדם.

Introduction

טסיות דם מיוצרות על ידי תאים מיוחדים megakaryocytes הממוקם במח העצם. הדרך המדויקת שבה מגהקריוציטים משחררים טסיות דם במחזור כבר מזמן לא ברורה בשל האתגר הטכני בהתבוננות באירועים בזמן אמת דרך העצם. מיקרוסקופיה דו-פוטונית סייעה להתגבר על אתגר זה והובילה להתקדמות משמעותית בהבנת תהליך היווצרות טסיות הדם. התצפיות הראשונות ב- vivo megakaryocyte נעשו על ידי פון אנדריאן ועמיתיו בשנת 2007, עם הדמיה של מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים דרך הגולגולת¹. זה היה אפשרי כי שכבת העצם בגולגולת הקדמית של עכברים צעירים יש עובי של כמה עשרות מיקרון והוא שקוף מספיק כדי לאפשר הדמיה של תאים פלואורסצנטיים במח העצם הבסיסי².

מחקרים שלאחר מכן יישמו הליך זה כדי להעריך היווצרות proplatelet בתנאים שונים ולפענח את המנגנונים הבסיסיים^3,4,5,6. מחקרים אלה סיפקו ראיות חותכות לכך שמקריוציטים מרחפים באופן דינמי בליטות, הנקראות מפיץ, דרך המחסום האנדיותל של כלי הסינוסואידים (איור 1). מרחיבים אלה משתחררים לאחר מכן כמו שברים ארוכים המייצגים כמה מאות טסיות בנפח. טסיות הדם ייווצרו לאחר שיפוץ של ההתפשטות במיקרו-מחזור של איברים במורד הזרם, במיוחד בריאות⁷. עם זאת, עד כה, התהליך המדויק והמנגנונים המולקולריים עדיין נתונים לדיון. לדוגמה, התפקיד המוצע של חלבונים שלד ציטו בהארכת פרופלטלטים שונה בין במבחנה לבין in vivo תנאים³, והבדלים בהיווצרות פרופלטלט הוכחו בתנאים דלקתיים⁶. מסבך את הדברים עוד יותר, מחקר שנערך לאחרונה ערער על הרעיון מונע פרופלטלט והציע כי ב vivo, טסיות נוצרות למעשה באמצעות מנגנון ניצני ממברנה ברמה megakaryocyte⁸.

מאמר זה מציג פרוטוקול לתצפית של megakaryocytes ו proplatelets במח העצם מעצם הגולגולת בעכברים חיים, באמצעות הליך זעיר פולשני. גישות דומות תוארו בעבר כדי לדמיין תאי מח עצם אחרים, במיוחד גזע hematopoietic ותאי אבות⁹. ההתמקדות כאן היא על תצפית של megakaryocytes וטסיות כדי לפרט כמה פרמטרים שניתן למדוד, במיוחד מורפולוגיות proplate ומהירות טסיות דם. פרוטוקול זה מציג כיצד להכניס קטטר לתוך הווריד הצווארי כדי להזריק מעקבים פלואורסצנטיים וסמים ולהתבונן דרך עצם הגולגולת. עצם השוק חשוף באמצעות ניתוח קטין, כך טבעת מודבקת לעצם. טבעת זו משמשת כדי לשתק את הראש ולמנוע תנועות עקב נשימה וליצור מלאה מלוחים כאמצעי טבילה של העדשה. טכניקה זו מתאימה היטב i) להתבונן בזמן אמת גיאומטריה סינוסואידי megakaryocytes אינטראקציה עם קיר כלי; ii) לעקוב אחר megakaryocytes בתהליך של היווצרות proplatelet, התארכות, ושחרור; ו- iii) למדוד תנועות טסיות דם כדי לפקח על זרימת הדם הסינוסואידית המורכבת. נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו לאחרונה³.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לתקנים האירופיים 2010/63/EU וועדת CREMEAS לאתיקה של ניסויים בבעלי חיים של אוניברסיטת שטרסבורג (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, הסכם מתקן לבעלי חיים N°: G67-482-10, הסכם פרויקט N° : 2018061211274514).

1. הכנת עכברים והכנסת קטטר בווריד הצוואר

הערה: כאן, זכר או נקבה, עכברי כתב mTmG בן 5-7 שבועות שימשו (B6.129(Cg)-GT(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}חצו עם עכברי Pf4-cre¹¹, המאפשר תיוג פלואורסצנטיות ירוקה אינטנסיבית במגקריוציטים וטסיות דם¹². לפני תחילת הניסוי, לחמם את תא החימום של המיקרוסקופ במשך כמה שעות.

1. להעביר את העכבר לחדר ההדמיה ולהמשיך להרדמה.
   1. להרגיז את העכבר על ידי הזרקה תוך-פריתוניאלית (i.p.) של פתרון של קטמין (קטמין (100 מיקרוגרם/גרם) וקסילאצין (10 מיקרוגרם/גרם) (5 μL/g).
      הערה: ניהול חוזר ונשנה של קטמין / קסילסין משמש כאן ועובד היטב אך דורש את ההפרעה של הקלטה עבור reinjection רגיל. לחלופין, אם מכונת הרדמה זמינה, אינדוקציה של הרדמה עשויה להתבצע עם קטמין / קסילסין ולאחר מכן נשמר תחת שאיפה של גזים (תערובת של איזופלוראן, אוויר, וחמצן).
   2. החלף את החיה בכלוב שלה עד שהוא מגיע להרדמה עמוקה. מניחים את העכבר על צלחת מחוממת מחומם ב 37 °C (50 °F) עבור כל המניפולציות הבאות.
      הערה: בעוד החיה מגיעה להרדמה עמוקה, הפעל את המיקרוסקופ ואת כל הציוד (ראה סעיף 4.1) והגדר את הפרמטרים השונים הדרושים (ראה סעיף 4.2) כדי להתחיל את הניסוי לאחר הניתוח. כאן, ההליך נמשך רק 3 שעות והוא סופני. העכבר מורדם לאחר הניסוי מבלי להתעורר. לפיכך, חיטוי אתנול לעור ומכשירים מספיק. עם זאת, בהתאם להנחיות המוסדיות, או אם ההליך יימשך זמן רב יותר, יש להשתמש בשיטות חיטוי מלאות יותר כגון שלושה סקראבס לסירוגין עם betadine / povidone ואלכוהול.
2. התקן קטטר בווריד הצוואר.
   הערה: חשוב להימנע מזיהום מיקרוביאלי במהלך הניתוח ככל האפשר. יש להקפיד לחטא בזהירות את העור עם 70% אתנול (EtOH) לפני שתמשיך בניתוח. השתמש תמיד במספריים ובפינצטה מעוקרים, ושטוף אותם באופן קבוע ב-70% EtOH. לעבוד במקום נקי, וללבוש מסכת פנים. 22 גרם "מעל המחט" קטטר, המורכב מחט בתוך צינור פלסטיק, משמש להזרקה תוך ורידי (ראה טבלת החומרים).
   1. הנח את העכבר על גבו, ותקן את הרגליים האחוריות עם סרט ניתוחי כדי למתוח את הגרון(איור 2A). לחטא את הגרון עם 70% אתנול.
      הערה: לנוחות, ניתן לגלח את הגרון לפני הניתוח. אם ההליך נמשך זמן רב יותר, גילוח זהיר חייב להתבצע עבור טכניקה אספטית נכונה.
   2. בצע ירידה של 0.7-1 ס"מ מעל וריד הצוואר הימני או השמאלי באמצעות מספריים סטריליים. מתחו את רקמת החיבור הסמוכה כדי לחשוף את וריד הצוואר החיצוני ואת החלק העליון של שריר החזה(איור 2A).
   3. ממלאים את הצנתר עם תמיסת מלח פיזיולוגית חמה וסטרילית. הכניסו את הצנתר לווריד לאחר חדירה דרך שריר החזה (איור 2B).
      הערה: יש להקפיד להימנע מבועות אוויר בתוך הקטטר. חשוב להכניס את הצנתר דרך השריר כדי למנוע דימום כמו השריר יהווה נקודת דחיסה. אפילו עכברים עם פגמים בהמוסטזיס, כגון Itgb3^-/- עכברים, אינם מדממים עם החדרת צנתר עם גישה זו.
   4. הסר בעדינות את המחט, ואם יש צורך, בזהירות להזיז את הצנתר עמוק יותר לתוך הווריד. חבר את המזרק ולייצב את הקטטר על ידי הוספת טיפה של דבק כירורגי (שולחן החומרים).
      הערה: ניתן להכניס קטטר בתוך וריד הזנב, אם כי זה דורש קצת תרגול כי הווריד יש קליבר קטן יותר. זה קשה במיוחד בעת שימוש בעכברים עם שיער כהה, אשר וריד הזנב בקושי גלוי. בשל הקליבר הגדול יותר שלה, מיקום הקטטר בתוך וריד הצוואר עשוי לאפשר נפחים גדולים יותר או טיפולים חוזרים להיות מוזרק אמין יותר. שים לב כי המזרק מלא בהתחלה עם מלוחים חמים, ולא לשכוח להזריק את הנפח המת לפני הזרקת פתרון התרופה.
   5. החזירו בזהירות את העכבר לעמדה מועדת(איור 2C). יש למרוח ג'ל(שולחן חומרים)על העיניים כדי למנוע יובש.

2. ניתוח והתקנה של טבעת הגולגולת

הערה: התמיכה המלאה בהתקנת העכבר כוללת 4 חלקים, בלוק וצלחת, הטבעת להחזיק את ראש העכבר ובורג לתיקון הטבעת לבלוק(איור 3A). כל רכיבי התמיכה התקבלו מהדפסה תלת-ממדית i.materialise.com. הצלחת עשויה מפולימר סטירן בוטאדין (ABS), הבלוק והבורג של נירוסטה, וטבעת נירוסטה ברמה גבוהה (נירוסטה מפורטת גבוהה) (ראה איור משלים S1 עבור ממדים וחומרים משלימים עבור קבצי ההדפסה 3D). הבלוק קבוע לצמיתות לתמיכה, מוברג או מודבק. ברגע שהטבעת מקובעת על גולגולת העכבר, יש לדפוק אותה למחזיק הבלוק(איור 3A).

1. להרטיב את השיער על הקרקפת עם מגבת נייר רטוב עם 70% אתנול לחיטוי. הסר את כל השיער הרופף עם מגבת נייר רטובה.
   הערה: לנוחות, הקרקפת עשויה להיות מגולחת לפני הניתוח.
2. יש לחתוך את הקרקפת על ידי יצירת T בקו האמצע עד 1 ס"מ ובין האוזניים כדי לחשוף את calvarium באמצעות מספריים דקים סטריליים פינצטה.
   הערה: הטבעת תהיה ממוקמת כדי לחפוף את העצמות הקדמיות והקודקודיות(איור 3B).
3. השתמש פינצטה סטרילית לחשוף את הגולגולת. הסר בזהירות את periosteum עם מספריים ופינצטה. השתמש ספוגית כותנה סטרילית ספוג מלוחים פיזיולוגיים כדי להסיר את כל periosteum וכל פסולת או שיער, אשר יכול לשנות הדמיה.
   הערה: כדי להגביל תגובות דלקתיות, להקפיד מאוד לא לפגוע בעצם.
4. הסר את כל עקבות הדם על ידי שטיפה עם מלוחים, ולייבש במהירות את העצם עם צמר גפן יבש. החל את ג'ל הדבק על הטבעת, למקם אותו על העצם החשופה, ולשמור אותו במשך כמה שניות, כך הטבעת מחוברת בחוזקה לגולגולת.
   הערה: אין דבק חייב להיכנס לשדה התצפית מכיוון שהוא עלול להוביל לפלואורסצנטיות בלתי רצויה.
5. להלח קלות את הגולגולת עם צמר גפן שקוע מלוח פיזיולוגי.
6. הכן את הדבק הדנטלי סיליקון על ידי ערבוב זהיר 1:1 רכיבים כחולים וצהובים. יש למרוח משחת שיניים מסביב לטבעת לאיטום למניעת דליפה במהלך ההדמיה. הסר בזהירות כל הדבק שיניים או דבק שאולי נכנס לטבעת.
7. ממלאים את הטבעת בת מלח ומחפשים דליפה.
   הערה: המלח משמש כאמצעי טבילה למטרת המיקרוסקופ. דימום עשוי להיות קריטי יותר בעת שימוש בעכברים עם פגמים הקשורים להמוסטזיס. זה חיוני כדי למנוע דם מלהיכנס לזירה כפי שהוא עלול לטשטש הדמיה נוספת.
8. הנח את העכבר על התמיכה, וברג את הטבעת על מחזיק הבלוק(איור 3C). מניחים קומפרסים מקופלים מתחת לראש החיה כדי להרים את הראש ולמנוע ניתוק של הטבעת מהגולגולת.
   הערה: הראש קבוע ישירות כך שהוא מונע תנועות תמונה עקב נשימה.
9. מקם את התמיכה ואת הרכבת העכבר בתא המיקרוסקופ המחומם (איור 3D).
   הערה: היזהרו לא להפיץ את הצנתר המוחדר בכל עת.

3. מעקב אחר העכברים המומים עד סוף הניסוי

הערה: הרדמה מושרה מחדש כל 35 דקות על ידי לסירוגין תת עורית (s.c.) זריקות של קטמין (25 מיקרוגרם/ גרם) בנפח של 5 μL / g משקל גוף ותערובת של קטמין (50 מיקרוגרם / גרם) וקסיליזין (5 מיקרוגרם / גרם) (1.2 μL / g). מכיוון שלא ניתן לפתוח את תא המיקרוסקופ המחומם במהלך הרכישה, ניטור הרדמה מתבצע לפני ואחרי ניהול מחדש של ההרדמה על ידי צביטת בוהן. באופן דומה, צביטת בוהן מתבצעת לפני תחילת כל הקלטת וידאו חדשה.

1. במידת הצורך, להפסיק לרכוש ולעורר מחדש הרדמה על ידי s.c. הזרקה.
   1. נזהר לא להזיז את ראש העכבר, לצבוט את העור של הגב בין האגודל לאצבע המורה של יד שמאל. להזריק באופן תת עורי את חומר ההרדמה בקפל העור האחורי באמצעות יד ימין (או להיפך עבור אנשים שמאליים).
2. בדוק את נוכחות של תמיסת מלח בזירה, ואם יש צורך, למלא עם מלוחים טריים. המשך להקליט במשך 35 הדקות הבאות, והמשיך באופן דומה למשך ההקלטה.
3. בסוף הניסוי, המתת חסד את העכבר על ידי נקע צוואר הרחם לפני שהוא מתעורר.
   הערה: העכבר נשמר מרדים למשך זמן מרבי של 3 שעות, בהסכמה עם הוועדה המקומית לרווחת אתיקה ובעלי חיים.

4. הדמיה של שני פוטונים

הערה: עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים אודות המיקרוסקופ והציוד הקשור. תמונות נרשמו עם סורק מהדהד (12 או 8 קילו-הרץ). המצב הדו-כיווני הוגדר כדי להגדיל את רכישת המהירות כאשר פיקסלים נרשמים בשני הכיוונים; לפיכך, יש לתקן כל אי התאמה בשלב באמצעות לוח הבקרה "תיקון פאזה". לבסוף, ממוצע מותאם הוגדר כפשרה בין מהירות הרכישה ליחס אות לרעש.

1. הדליקו את המיקרוסקופ הדו-פוטוני, כולל לייזר וסורק מהדהד (כוח לייזר פלט בדרך כלל ~ 1.8-2.5 W בהתאם ללייזר).
2. הגדר את אורך הגל הלייזר המתאים עבור הפלורופורים שנבחרו. הגדר את אורך הגל המתאים להתאוששות של אורות נפלטים.
   הערה: כאן, אורך גל של גלאי 913 ננומטר והיברידיים (500-550 ננומטר ו 575-625 ננומטר) שימשו בו זמנית לרגש ולזהות AlexaFluor-488 ו Qtracker-655, בהתאמה.
3. באמצעות הצנתר תוך ג'וגולרי, להזריק את נותב פלורסנט לתייג את כלי ההדבקה (Qtracker-655; טבלת חומרים). הזרק 50 μL / עכבר של פתרון ב 0.2 μM, מחודש פעם בשעה לכל היותר של 150 μL / ניסוי.
   הערה: מעקבים אחרים ניתן להשתמש כגון dextran משקל מולקולרי גבוה¹. במקרה זה, שקול כי צמיגות הדם יכול להשתנות על ידי dextran ולשנות כמה פרמטרים מוסריים.
4. מקם את שלב המיקרוסקופ עם התמיכה והעכבר תחת מטרת המיקרוסקופ. בדוק כי הטבעת תמיד מלאה מלוחים לטבול את המטרה. השתמש epifluorescence כדי לאתר את כלי מח העצם (אדום) ואת נוכחותם של megakaryocytes (ירוק) מיושר לאורך כלי סינוסואיד.
   הערה: לעצם הגולגולת יש עובי נמוך מ 100 מיקרומטר². מח העצם ממוקם מתחת לעצם ומוכר בקלות על ידי מגהקריוציטים ירוקים פלואורסצנטיים וכלי הסינוסואידים האדומים הצפופים המסומנים שכותרתו על ידי Qtracker-655.
5. רכישות ארוכות (מגה-קריוציטים, מפיץ)
   1. חפש את אזור העניין. החל פרמטרי רכישת תמונה כאמור לעיל.
   2. עבור רכישות ארוכות (לדוגמה, הדמיה של היווצרות proplatelet או התארכות), לרכוש z-מחסנית תמונות עם מרווחי זמן ממוטבים (בדרך כלל בין 0.85 ל 1.34 מיקרומטר) באמצעות סורק מהדהד 8 kHz.
      הערה: סורק מהדהד של 12 קילו-הרץ יכול להגביר את מהירות הרכישה.
   3. רכש תמונות בגודל 384 x 384 פיקסלים כדי לדמיין את כל המגקריוצ'ית וכלי הדם. השתמש בממוצע קו, לפי הצורך, לרכישה מהירה ברזולוציה טובה. קבע את מרווח הזמן של רכישת מחסנית תמונות, בדרך כלל 10 שניות או 30 שניות עבור פריט חזותי של proplatelet.
      הערה: כאן, קו ממוצע של 8 שימש כדי לקבל יחס אות לרעש גבוה יותר, אשר אפשר רכישה של תמונה אחת / 10 s עם סורק מהדהד 8 kHz. ודא שהקו הזה בממוצע במהלך רכישה חיה מותר.
6. רכישה קצרה ומהירה (טסיות דם)
   הערה: לרכישה קצרה יותר של אירועים מהירים, כגון מהירות טסיות דם, חיוני למקסם את קצב רכישת הפריימים. בחירת סוג הרכישה הנכון תמטב את קצב רכישת הפריימים (כלומר סוג רכישת מרחב-זמן "xyt").
   1. מזער (למשל, 256 x 90 פיקסלים) והתאם את גודל התמונה לכלי השיט על-ידי סיבוב שדה ההדמיה, במידת הצורך.
   2. השתמש במהירות הסריקה הגבוהה ביותר הזמינה.
   3. השתמש בסריקה דו-כיוונית.
      הערה: לסריקה דו-כיוונית, ודא שהשלב מותאם היטב.
   4. מזער את ממוצע הקו כדי למצוא את הפשרה האופטימלית בין הגדרת תמונה ומהירות הרכישה.
      הערה: עבור מדידות מהירות טסיות דם, תמונה מפוקסלת עשויה להספיק אם היא מסייעת להגביר את מהירות הרכישה.
   5. מזער את ערימת z כדי להגביר את מהירות הרכישה. רכישת מחסנית z 1 בלבד מספיקה כדי לכמת את מהירות טסיות הדם. לרכוש עבור 10-20 s כדי למדוד את מהירות טסיות הדם.
      הערה: ניתן להשיג מקסימום של 133 פריימים לשנייה באמצעות תנאים אלה עם סורק מהדהד של 12 קילו-הרץ. יש להתאים את הפרמטרים לתנאים. בכלי שיט מסוימים, מהירות טסיות הדם היא בכל זאת גבוהה מדי כדי לכמת את מהירות טסיות הדם עם הגדרות אלה באופן אמין.
7. מדידת רוחב ואורך של הנפת
   הערה: כדי לטעון קבצי LIF שהושגו בתוכנת Leica עם ImageJ, הורד והתקן תחילה את תוסף LOCI ב- ImageJ כדי להשתמש ביבואן Bio-Formats.
   1. רוחב ההפצה
      1. פתח את הסרט באמצעות ImageJ. כדי לבצע מדידת רוחב, השתמש רק בסרט של הנפחים ללא הכלי. כדי להפריד בין הערוצים השונים, לחץ על תמונה| צבע ובחרו 'פצל ערוצים' .
      2. עבור סרט z-stack, צור הקרנת z ממוצעת עבור כל נקודת זמן על-ידי לחיצה על תמונה| ערימות ובחר Z Project. עבור סוג הקרנה, הזן עוצמה ממוצעת.
      3. פנקו בתמונה כדי להסיר את הרעש. הפחת את הרקע על-ידי לחיצה על תהליך| הפחת את הרקע והחל רדיוס כדור מתגלגל: 50.0 פיקסלים. חלק את התמונה על ידי לחיצה על תהליך וחלק.
      4. עקוב אחר קו קרוב לבסיס של המפיץ (ליד megakaryocyte, הימנעות כל אובייקט אחר).
         הערה: אל תשכח להגדיר את קנה המידה של התמונה כדי להשיג את הערך ביחידה הרצויה על ידי לחיצה על ניתוח והגדר קנה מידה. כברירת מחדל, יחידת התמונה נמצאת בפיקסלים.
      5. התווה את פרופיל העוצמה, התאם לעקומת גאוס וחשב את הרוחב המלא בחצי מקסימום (FWHM). לכן, כתוב את קובץ ה- Script הבא במאקרו על-ידי לחיצה על תוספים| חדש ובחר מאקרו והפעל אותו על-ידי לחיצה על מאקרו| הפעל מאקרו: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("גאוסיאן", x,y); Fit.plot(); סיגמא=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * סיגמא; print(FWHM).
         הערה: ודא שיש רק שיא אחד בסריקת הקו, המתאימה לעוצמת הדחף.
      6. בצע את הפעולות המתוארות בשלב 4.7.5 על פרוסה אחת או חוזרות על עצמן לאורך זמן כדי לקבל את הרוחב הממוצע של הדחף
   2. אורך ההפצה
      1. עקוב אחר קו לאורך הדחף, מהבסיס קרוב למגקריוצייט למעלה. השתמש בקו מקוטע כדי לעקוב אחר צורת ההתפשטות. חזור על זה עבור כל נקודת זמן.
      2. זכור לשמור כל שורה באמצעות מנהל ההשערות: לחץ על ניתוח | כלים ובחר מנהל על ביצועים. לחץ על הוסף בחלון מנהל ההשתתבות כדי להוסיף כל שורה למנהל כפי שנבחר. לשמירת כל השורות בתיקיה, לחץ במנהל ההשערות בביטול הבחירה | עוד ולחץ על שמור. מתוך מנהל ההפרשה על בסיס הרהור, חלץ את ערך האורך של כל שורה (מדידה) מטבלת התוצאות.
         הערה: אל תשכח להגדיר את קנה המידה של התמונה כדי להשיג את הערך ביחידות הרצויות על ידי לחיצה על ניתוח והגדר קנה מידה. כברירת מחדל, יחידת התמונה נמצאת בפיקסלים.
8. מדידת מהירות טסיות דם
   הערה: מהירות טסיות הדם מחושבת מהקלטת הווידאו של טסיות פלואורסצנטיות הזורמות בתוך כלי השיט מעל 10-20 שניות. טיפול בתמונה ראשונה מתבצע כדי לקבל נתוני סריקת קו חוזרים מחזורית. תנועה מובילה לפסים שהזווית שלהם תלויה במהירות, ומאפשרת את חישובה. כאן, המהירות חושבה בשיטה המשתמשת בהחלת Radon, שהיא חזקה יותר משיטת פירוק הערך הייחודי הקלאסית (SVD)¹⁵.
   1. טיפול בתמונה עם ImageJ
      1. פתח את הסרט באמצעות ImageJ. החל מסנן טשטוש גאוסי על-ידי לחיצה על תהליך | מסננים, בחר טשטוש גאוס והחל סיגמא (Radius): 2.00. בחר אזור קטן למדידת הזרימה ועקוב אחר 3 קווים סמוכים בהתאם לכיוון הזרימה.
         הערה: אל תשכח לשמור כל שורה באמצעות מנהל ההשערות על-ידי לחיצה על ניתוח | כלים | מנהל רורי. לחץ על הוסף בחלון מנהל ההבערה כדי להוסיף כל שורה ולשמור אותה; לחץ תחילה על בטל את הבחירה | עוד ולאחר מכן לחץ על שמור.
      2. באמצעות תוכנת סריקת קו ImageJ, לבנות kymograph עבור כל שורה על ידי לחיצה על תמונה | ערימות; בחר שריד והחל את הפרמטרים הבאים: מרווח פלט (מיקרון): 1.000 / ספירת פרוסות: 1 / הימנע אינטרפולציה. שמור את התמונות המתקבלות במרחב-זמן.
         הערה: התמונה המתקבלת מראה פסים המתאימים לתנועה הליניארית של טסיות הדם בזרימת הדם לאורך זמן. זווית הרצף היא פונקציה של המהירות.
   2. מדידת מהירות באמצעות תוכנת Matlab או GNU Octave
      הערה: מהירות טסיות הדם בזרימת הדם מוערכת מתמונות החלל-זמן באמצעות שיטת ניתוח חישובית המבוססת על התמרת ראדון המתוארת על ידי דרו ומשתפי פעולה¹⁵. התיאור של שיטה מתמטית זו הוא מעבר להיקף סקירה זו, והקורא מופנה לפרסום על ידי דרו ואח 'לפרטים לגבי החישוב¹⁵. הן קוד Matlab ומידע נוסף זמינים באתר האינטרנט שלהם https://www.drew-lab.org/code.
      1. פתח את הקוד באמצעות תוכנת Matlab או GNU Octave.
         הערה: הקוד עשוי לדרוש הסתגלות בהתאם למחקר הרצוי.
      2. חלץ את הערך מ-3 תמונות מרחב-זמן, המתאימות לקווים הסמוכים שצוירו באותו חלק כלי שיט. חשב את ערך מהירות זרימת טסיות הדם הממוצע עבור חלק זה של כלי השיט.
         הערה: אל תשכח להמיר את התוצאה ביחידת המידה הנכונה (למשל, מיקרומטר/s).

תוצאות

באמצעות פרוטוקול זה, נותב הפלואורסצנטי, Qtracker-655, נוהל תוך ורידי כדי לדמיין כלי סינוס מוח anastomosed במח העצם הגולגולת ואת כיוון הזרימה כפי שמתואר על ידי החצים (איור 4A,משמאל). באמצעות עכברי mTmG, טסיות דם פלואורסצנטיות eGFP נרשמו מעל 20 s בכל ענף כלי, ומהירותם נמדדה באמצעות תוכנת ImageJ ו- GN...

Discussion

המנגנונים של היווצרות טסיות דם תלויים מאוד בסביבת מח העצם. לפיכך, מיקרוסקופיה תוך-וינטלית הפכה לכלי חשוב בתחום כדי לדמיין את התהליך בזמן אמת. עכברים עם מגה-קריוציטים פלואורסצנטיים ניתן להשיג על ידי חציית עכברים המבטאים את Cre רקומבינאז במגקריוציטים עם כל עכברי כתב פלוקס המכילים קלטת ביטוי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent