イン・ヴィヴォ マウスの頭蓋骨骨髄における巨核球とプロ血小板の2光子イメージング

要約

ここでは、2光子顕微鏡を用いて生きているマウスの頭蓋骨の骨髄にメガカルヨサイトおよびプロ血小板をイメージングする方法について説明する。

要約

血小板は、骨髄に位置する特殊な細胞である巨核球によって産生される。メガカルヨサイトをリアルタイムで画像化する可能性とそのネイティブ環境は10年以上前に記述され、血小板形成のプロセスに新たな光を当てています。巨核球は、シヌソイド血管の内皮層を通して、プロ血滴と呼ばれる細長い突起を拡張する。本論文は、頭蓋骨骨髄およびサイヌシド血管において、蛍光標識された巨核球をリアルタイムで同時に画像化するプロトコルを提示する。この技術は、炎症反応を制限するために頭蓋骨をそのまま維持するマイナーな手術に依存しています。マウスの頭部は、呼吸の動きを防ぐために頭蓋骨に接着リングで固定化されています。

2光子顕微鏡を用いて、巨核球を最大数時間可視化することができ、細胞突起や原形の伸びの過程での細胞突起の観察が可能になります。これにより、突起の形態(幅、長さ、狭窄領域の存在)およびその伸び動作(速度、規則性、または一時停止または引き込みフェーズの存在)に関連するいくつかのパラメータを定量化することができます。この技術はまた、血小板速度および血流方向を決定するために、シヌソイド血管内の循環血小板の同時記録を可能にする。この方法は、遺伝子組み換えマウスを用いた血小板形成における関心遺伝子の役割を研究するのに特に有用であり、また、薬理学的検査(血小板産生障害の治療における薬剤の評価のメカニズムを研究する)にも適している。それは、インビボとインビトロプロ血小板形成が異なるメカニズムに依存することが知られているように、特にインビトロ研究を補完するために、非常に貴重なツールとなっています。例えば、体外微小管は、それらそれ以上の前小板伸長に必要とすることが示されている。しかし、生体内では足場として機能し、伸びは主に血流力によって促進される。

概要

血小板は、骨髄に位置する巨核球専門細胞によって産生される。巨核球が循環中の血小板を放出する正確な方法は、骨を通してリアルタイムの出来事を観察する際の技術的な課題のために長い間不明瞭なままであった。2光子顕微鏡はこの課題を克服し、血小板形成プロセスの理解において大きな進歩を遂げてきた。初の インビボ 巨核球観測は、2007年にフォン・アンドリアンらの研究グループによって行われ、頭蓋骨¹を通して蛍光巨核球が可視化された。これは、若年成マウスの前頭蓋頭の骨層が数十ミクロンの厚さを有し、基礎となる骨髄²における蛍光細胞の可視化を可能にするのに十分に透明であるために可能であった。

続く研究では、様々な条件下でプロ血小板形成を評価し、基礎となるメカニズム^{3、4、5、6}を解読するために、この手順^を適用^しました。これらの研究は、巨核球が、原形の血管の内皮的障壁を通って、プロ血小板と呼ばれる突起を動的に拡張するという決定的な証拠を提供した(図1)。これらのプロ血小板は、体積の数百の血小板を表す長い断片として放出される。血小板は、下流器官の微小循環におけるプロ血小板のリモデリング後、特に肺⁷に形成される。しかし、現在までに、正確なプロセスと分子メカニズムは議論の対象となっています。例えば、プロ血小板の伸びにおける細胞骨格タンパク質の提案された役割は、インビトロ条件とインビボ条件³の間で異なり、そして炎症条件^下でプロ血小板形成の違いが実証されている6。さらに複雑なことに、最近の研究では、プロ血小板駆動の概念に異議を唱え、生体内では、巨核球レベル⁸の膜芽出機構を通して血小板が本質的に形成されることを提案した。

本論文は、生きているマウスの頭蓋骨から骨髄の巨核球およびプロ血小板を観察するためのプロトコルを、低侵襲的な手順を用いて提示する。同様のアプローチは、他の骨髄細胞、特に造血幹細胞および前駆細胞⁹を可視化するために先に説明されている。ここでの焦点は、測定できるいくつかのパラメータ、特にプロ血小板形態と血小板速度を詳述するために、巨核球および血小板の観察である。このプロトコルは、蛍光トレーサーと薬物を注入し、頭蓋骨を通して観察するために頸静脈にカテーテルを挿入する方法を提示します。小骨骨は、リングが骨に接着されるように、軽度の手術を使用して露出されます。このリングは、頭を固定化し、呼吸による動きを防ぎ、水中媒体として生理食音で満たされたカップを形成する役割を果たす。この技術はi)血管壁と相互作用するサイヌシド幾何学および巨核球をリアルタイムで観察するのに適している。ii) プロ血小板形成、伸び、および放出の過程で巨核球に従う;iii)血小板の動きを測定して、複雑なシヌサイド血流を監視する。このプロトコルを使用して取得したデータは最近公開されています³.

プロトコル

すべての動物実験は、ヨーロッパの基準2010/63/EUとストラスブール大学動物実験倫理に関するCREMEAS委員会(コンテテ・レジオナル・デティク・アン・マティエール・デ・エクスペリメンテーション・アニマル・ストラスブール、動物施設協定N°:G67-482-10、プロジェクトN°)に従って行われました 2018061211274514。

1. マウスの調製と頸静脈内のカテーテルの挿入

注:ここでは、オスまたはメス、5-7週齢のmTmGレポーターマウス(B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10)}がPf4-creマウス¹¹と交配し、メガカルギサイトおよびプレートレット¹²に強烈な緑色蛍光標識を可能にした。実験を開始する前に、顕微鏡の加熱室を数時間予熱します。

1. マウスを撮像室に運び、麻酔に進みます。
   1. ケタミン(ケタミン(100μg/g)およびキシラジン(10μg/g)(5μL/g)の溶液を腹腔内(即ち)注入してマウスを麻酔します。
      注:ケタミン/キシラジンの繰り返し投与はここで使用され、うまく動作しますが、定期的な再注入のための記録の中断を必要とします.あるいは、麻酔装置が利用可能な場合、麻酔の誘導はケタミン/キシラジンで行われ、その後ガス(イゾフルラン、空気、酸素の混合物)の吸入下で維持される。
   2. 深部麻酔に達するまでケージ内の動物を交換してください。37°Cで温めた加熱プレートにマウスを置き、その後のすべての操作を行います。
      注:動物が深い麻酔に達している間、顕微鏡とすべての機器(セクション4.1を参照)のスイッチを入れ、手術が終わったら実験を開始するために必要なさまざまなパラメータ(セクション4.2を参照)を設定します。ここでは、手順は3時間しか持続し、端末です。マウスは、目を覚ますことはせずに実験後に安楽死させる。したがって、皮膚および器具のためのエタノール消毒は十分である。しかし、制度上のガイドラインに応じて、または手順が長く続く場合は、ベタジン/ポビドンとアルコールを含む3つの交互スクラブなど、より完全な消毒方法を使用する必要があります。
2. 頸静脈にカテーテルを取り付ける。
   注:手術中の微生物汚染は、できるだけ避けてください。手術を進める前に、70%エタノール(EtOH)で肌を注意深く消毒してください。常に滅菌ハサミとピンセットを使用し、定期的に70%のEtOHでそれらをすすいでください。清潔な場所で作業し、フェイスマスクを着用してください。プラスチックチューブ内の針からなる22Gの「針」カテーテルは、静脈注射に使用されます( 材料表を参照)。
   1. 背中にマウスを置き、前脚を手術用テープで固定して喉を伸ばす(図2A)。70%エタノールで喉を消毒する。
      注意:便宜上、手術前に喉を剃ることがあります。手順が長く続く場合は、適切な無菌技術のために慎重なシェービングを行う必要があります。
   2. 滅菌はさみを使用して、右または左の頸静脈の上に0.7〜1センチメートルの切開を行います。隣接する結合組織を伸ばして、外部頸静脈と胸筋の上部を露出させる(図2A)。
   3. カテーテルに温かい、無菌の生理食塩水を充填します。胸筋を貫通した後、カテーテルを静脈に挿入する(図2B)。
      注意:カテーテル内の気泡を避けるように注意してください。筋肉が圧迫点を形成するので、出血を防ぐために、筋肉を介してカテーテルを挿入することが重要です。^Itgb3-/-マウスのような止血不良を有するマウスでさえ、このアプローチではカテーテル挿入時に出血しない。
   4. 針をそっと取り出し、必要に応じてカテーテルを静脈の奥深くに慎重に移動します。注射器を接続し、外科用接着剤の滴を追加することによってカテーテルを安定させる (材料の表).
      注:尾静脈の内側にカテーテルを挿入することは可能ですが、静脈の口径が小さいため、いくつかの練習が必要です。これは、尾静脈がほとんど見えない黒髪のマウスを使用する場合、特に困難です。その大きな口径のために、頸静脈の内側にカテーテルを配置すると、より大きな体積または繰り返し治療がより確実に注入される可能性があります。注射器は、最初に暖かい生理食音で満たされ、薬物溶液を注入する前に死んだボリュームを注入することを忘れないでください。
   5. マウスを慎重に、起こりやすい位置に戻します(図2C)。目の上にゲル(材料表)を塗布して乾燥を防ぎます。

2. 脳の手術と設置

注: マウスの取り付けの完全なサポートは、4 つの部分、ブロックとプレート、マウスヘッドを保持するリング、およびブロックにリングを固定するためのネジ (図 3A)で構成されています。サポートのすべての要素は、3D印刷によって i.materialise.com から得られています。プレートは、アクリロニトリルブタジエンスチレンスチレン(ABS)ポリマー、ステンレス鋼のブロックとネジ、高級ステンレス鋼(高詳細ステンレス鋼)のリングで作られています(寸法については補足図S1、3D印刷ファイルの補足材料を参照)。ブロックは、ネジまたは接着のいずれか、サポートに永続的に固定されています。マウスの頭蓋骨にリングを固定したら、ブロックホルダーにねじ込む必要があります(図3A)。

1. 70%エタノールを濡らして消毒するペーパータオルで頭皮の髪を湿らせてください。濡れたペーパータオルですべてのゆるい髪を取り除きます。
   注意:便宜上、手術前に頭皮を剃ることがあります。
2. 1cmまでの中線でTを形成し、耳の間に無菌の細かいはさみとピンセットを使用してカルバリウムを露出させることによって頭皮を切開します。
   注: リングは前頭骨と頭頂骨を重ねるように配置されます(図3B)。
3. 頭蓋骨を露出させるために滅菌ピンセットを使用してください。はさみとピンセットでペリオスを慎重に取り除きます。生理食塩水を浸した無菌綿棒を使用して、すべての骨膜および破片や髪を除去し、画像を変更する可能性があります。
   注:炎症反応を制限するために、骨を損傷しないように細心の注意を払ってください。
4. 生理布地ですすいで血液痕跡を取り除き、乾いた綿棒で骨を速やかに乾燥させます。リングに接着剤ジェルを塗布し、露出した骨の上に置き、リングが頭蓋骨にしっかりと取り付けられるように数秒間維持します。
   注意:望ましくない自己蛍光につながる可能性があるため、接着剤は観測フィールドに入らなければなりません。
5. 生理食塩水に浸した綿棒で頭蓋骨を軽く湿らします。
6. 1:1の青色と黄色の成分を慎重に混合してシリコンデンタルペーストを準備します。リングの周りに歯科用ペーストを塗布してシールを行い、イメージング時の漏れを防ぎます。リングに入った歯科用ペーストや接着剤は慎重に取り外してください。
7. ラインでリングを充填し、漏れがないか確認します。
   注:生理食いは顕微鏡の目的のための浸漬媒体として機能する。出血は、止血関連の欠陥を有するマウスを使用する場合、より重要である可能性があります。血液がリングに入るのを防ぐことが不可欠であり、さらなる画像をぼかす可能性があります。
8. サポートの上にマウスを置き、ブロックホルダーのリングをねじ込みます(図3C)。動物の頭の下に折りたたまれた圧縮物を置いて頭を上げ、頭蓋骨からリングの剥離を防ぎます。
   注:ヘッドは直接固定されているため、呼吸による画像の動きを防ぎます。
9. 熱い顕微鏡室に支持体とマウスアセンブリを置く(図3D)。
   注:挿入したカテーテルをいつでも外さないように注意してください。

3. 実験終了までの麻酔マウスのフォローアップ

注:麻酔は、5μL/g体重の体積とケタミン(5μg/g)とキシラジン(5μg/g)(1.2μg/g)の混合物中のケタミン(25μg/g)の皮下(.c)注射を交互に行うことによって35分ごとに再誘導される。集録時に加熱された顕微鏡室を開けることができなくて、麻酔のモニタリングはつまみつまみによって麻酔薬の再投与の前後に行われる。同様に、つま先のピンチは、新しいビデオ録画を開始する前に実行されます。

1. 必要に応じて、s..c注射による取得を停止し、麻酔を再誘導する。
   1. マウスの頭を動かさないで、左手の親指と人差し指の間で背中の皮膚をつまみます。皮下に右手を使用して背中の皮膚の折り目に麻酔薬を注入します(または左利きの人の 場合はその逆も同様 です)。
2. リングに生理焼けの存在を確認し、必要に応じて新鮮な生理焼香を充填します。次の35分間の記録に進み、同様に録音継続を続けます。
3. 実験の終わりに、目を覚ます前に頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。
   注:マウスは、地元の倫理的および動物福祉委員会と一致して、3時間の最大持続時間のために麻酔を維持されます。

4. 2光子イメージング

注:顕微鏡および関連機器の詳細については、 材料表 を参照してください。画像は共振スキャナ(12または8 kHz)で記録されました。双方向モードは、ピクセルが両方向に記録されるため、速度の取得を向上するように設定されました。したがって、フェーズの不一致は、コントロールパネルの「位相補正」で修正する必要があります。最後に、取得速度と信号対雑音比の間の妥協点として適合平均化を設定しました。

1. レーザーと共振スキャナを含む2光子顕微鏡のスイッチをオンにします(通常、レーザーに応じて出力レーザーパワーは〜1.8〜2.5W)。
2. 選択した蛍光ホルに適したレーザー波長を設定します。発光した光の回復に適した波長を設定します。
   注:ここでは、913 nmの波長とハイブリッド検出器(500-550 nmおよび575-625 nm)を使用して、AlexaFluor-488とQtracker-655を同時に励起し、検出しました。
3. 頸管内カテーテルを使用して、蛍光トレーサーを注入して血管構造を標識する(Qtracker-655; 資料の表。0.2 μMで50 μL/マウスの溶液を注入し、1時間に1回更新して最大150 μL/実験を行います。
   注:他のトレーサーは、高分子量デキストラン¹など使用することができます。その場合、血液粘度はデキストランによって変化し、いくつかの出血性パラメータを変更することができることを考慮してください。
4. 顕微鏡の目的の下に支持およびマウスと顕微鏡の段階を置く。リングが常に生理音で満たされていることを確認し、目的を浸します。蛍光を使用して、骨髄血管(赤)と正弦波血管に沿って整列した巨核球(緑色)の存在を見つけます。
   注:頭蓋骨の厚さは100 μm²より低い。骨髄は骨の下に位置し、蛍光緑色巨核球およびQtracker-655によって標識された密な赤い吻線のサイヌサイド血管によって容易に認識される。
5. ロング取得(巨核球、プロメクテ)
   1. 対象地域を検索します。上記のように画像取得パラメータを適用します。
   2. 長い集録(例えば、プロメトレー形成または伸びの視覚化)のために、8 kHzの共振スキャナを使用して最適化された間隔(通常は0.85〜1.34 μm)のzスタック画像を取得します。
      メモ:12 kHzの共振スキャナは、取得速度を向上させることができます。
   3. 384 x 384ピクセル画像を取得し、巨大核細胞および血管全体を可視化します。適切な解像度で迅速な取得を行う場合は、必要に応じてライン平均を使用します。プロメトレットの視覚化のために、通常10 sまたは30 sの画像スタック取得の時間間隔を決定します。
      注: ここでは、8 のライン平均を使用して、8 kHz の共振スキャナで 1 イメージ/10 s を取得できる、より高い信号対雑音比を得ました。ライブ取得中のライン平均化が許可されていることを確認します。
6. 短く、急速な獲得(血小板)
   注: 血小板速度などの急速なイベントの短時間の取得のためには、フレーム取得率を最大化することが不可欠です。適切な取得タイプを選択すると、フレーム取得レート(時空間取得タイプ"xyt")が最適化されます。
   1. 必要に応じて、撮像フィールドを回転させることにより、最小(例えば、256 x 90ピクセル)、画像サイズを容器に合わせます。
   2. スキャン速度を最大にします。
   3. 双方向スキャンを使用します。
      注: 双方向スキャンの場合は、フェーズが適切に調整されていることを確認します。
   4. ライン平均を最小化して、画像定義と取得の迅速性の間の最適な妥協点を見つけます。
      注: 血小板速度測定では、取得の速度を上げる場合はピクセル化された画像で十分です。
   5. Zスタックを最小化して、取得の迅速性を高める。1 Zスタックのみを取得するだけで、血小板速度を定量化するのに十分です。血小板速度を測定するために10-20 sのために取得します。
      メモ:12 kHzの共振スキャナでこれらの条件を使用して、最大133フレーム/sを取得できます。パラメータは条件に適合する必要があります。一部の血管では、血小板速度はそれにもかかわらず、これらの設定で血小板速度を定量化するには高すぎます。
7. プロメ小板の幅と長さの測定
   注:ImageJでライカソフトウェアで取得したLIFファイルをロードするには、まず、Bio-Formatsインポーターを使用するために、ImageJ上のLOCIプラグインをダウンロードしてインストールしてください。
   1. プロメ小板幅
      1. ImageJ でムービーを開きます。幅測定を行う場合は、容器を使用せずにプロメトレットのムービーのみを使用します。異なるチャンネルを分離するには、画像をクリックします|[色] をクリックし、[ チャネルの分割] を選択します。
      2. Z スタック ムービーの場合は、[イメージ]をクリックして、各時間の平均 Z 投影を作成します |[スタック] をクリックし 、[Z プロジェクト] を選択します。 [投影タイプ] に 「平均強度」と入力します。
      3. 画像を扱ってノイズを取り除きます。[プロセス]をクリックして背景を引きます |背景を減算 し、 ローリングボール半径:50.0ピクセルを適用します。[プロセス]と[スムーズ]をクリックして、画像 を滑らかにします。
      4. プロ血小板の基部に近い線をトレースします (巨核球の近く, 他のオブジェクトを避けます).
         注: [分析] と [スケールの設定] をクリックして、目的の単位の値を取得するようにイメージの スケールを設定することを忘れないでください。デフォルトでは、イメージの単位はピクセル単位です。
      5. 強度プロファイルをプロットし、ガウス曲線にフィットし、全幅を最大半分(FWHM)で計算します。そのためには、プラグインをクリックしてマクロに次のスクリプト を記述します|新規作成し、[ マクロ ]を選択して、[マクロ]をクリックして実行 します|マクロを実行する : y=getProfile();を指定します。フィット.doFit(「ガウス」、x、y);フィットプロット();シグマ=フィット.p(3);FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * シグマ;印刷(FWHM)
         注: ライン スキャンのピークがプロメクテの強度に対応する 1 つだけであることを確認します。
      6. ステップ 4.7.5 で説明した操作を 1 スライスで実行するか、時間をかけて繰り返してプロメトレットの平均幅を取得します。
   2. プロメ小板の長さ
      1. 巨核球に近いベースから上まで、プロ血小板に沿って線をトレースします。プロメトレットの形状に沿ってセグメント化された線を使用します。各時点で繰り返します。
      2. ROI マネージャを使用して各行を保存することを忘れないでください: [分析] をクリック|ツールを選択し、[ROIマネージャ]を選択します。フォルダ内のすべての行を保存するには、[選択解除]の[ROI マネージャ]をクリック|詳細をクリックし、[保存] をクリックします。ROI マネージャから、結果テーブルから各行の長さ値 (Measure) を抽出します。
         注: [分析] および [スケールの設定] をクリックして、目的の単位で値を取得するようにイメージの 尺度を設定することを忘れないでください。デフォルトでは、イメージの単位はピクセル単位です。
8. 血小板速度測定
   注:血小板の速度は、10〜20s以上の容器の中を流れる蛍光血小板のビデオ記録から計算されます。最初の画像処理を行い、周期的に繰り返されるラインスキャンデータを得る。モーションは、速度に依存する角度を持つ筋を導き、計算を可能にします。ここでは、ラドン変換を使用する方法で速度を計算し、これは古典的な単一値分解(SVD)法¹⁵よりも堅牢である。
   1. イメージJによる画像処理
      1. ImageJ でムービーを開きます。[プロセス] |をクリックしてガウス ブラー フィルターを適用する フィルターを選択し、 ガウス ブラーを選択し、シグマ (半径): 2.00を適用します。小さな領域を選択して流れを測定し、流れ方向に続く3つの隣接する線をトレースします。
         注: [分析]をクリックしてROIマネージャを使用して各行を保存することを忘れないでください|ツール|ROIマネージャー。ROI マネージャウィンドウで [追加] をクリックして、各行を追加して保存します。[選択解除] の [最初に] をクリック|詳細をクリックし、[保存] をクリックします。
      2. ImageJ ラインスキャンソフトウェアを使用して、画像|をクリックして、各ラインのキモグラフを構築します 。スタック;[ 再スライス]を選択し、次のパラメータを適用します:出力間隔(ミクロン):1.000 / スライス数: 1 / 補間を避けます。結果の時空間イメージを保存します。
         注:結果の画像は、時間の経過に伴う血流中の血小板の直線運動に対応する筋を示しています。ストリークの角度は、速度の関数です。
   2. MatlabまたはGNUオクターブソフトウェアを使用した速度測定
      注: 血流中の血小板の速度は、ドリューと共同研究者¹⁵によって記述されたラドン変換に基づく計算解析方法を使用して時空間画像から推定されます。この数学的方法の説明はこのレビューの範囲を超えており、読者はDrewらの出版物に参照され、計算¹⁵に関する詳細を参照します。Matlabコードと詳細の両方がウェブサイト https://www.drew-lab.org/code でご覧いただけます。
      1. Matlab または GNU Octave ソフトウェアを使用してコードを開きます。
         注: コードは、目的のスタディに応じた適応が必要な場合があります。
      2. 3時空画像から値を抽出し、同じ容器部分に描かれた隣接する線に対応する。容器のこの部分の平均血小板流速値を計算します。
         注:結果を正しい測定単位(μm/sなど)に変換することを忘れないでください。

結果

このプロトコルを用いて、蛍光トレーサーQtracker-655は、矢印によって示されるように、頭蓋骨骨髄および流れ方向における吻像骨髄正弦管を画像に静脈内投与した(図4A、左)。mTmGマウスを用いて、各容器枝に20s以上のeGFP蛍光小板を記録し、その速度をImageJおよびGNUオクターブソフトウェアを用いて測定した(図4A、右)。流速と方向の異質性に注意し...

ディスカッション

血小板形成のメカニズムは、骨髄環境に大きく依存しています。そのため、生体内顕微鏡は、リアルタイムでプロセスを可視化する分野で重要なツールとなっています。蛍光巨核球を有するマウスは、条件付き蛍光遺伝子発現カセットを含む任意のfloxedレポーターマウスと巨核球中のCreリコンビナーゼを発現するマウスを交流することによって得ることができる。ここで、mTmGレポーターマウ...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent