在维沃 小鼠头骨骨髓中巨细胞和前列腺的双光子成像

摘要

我们在这里描述了使用双光子显微镜对活鼠头骨骨髓中的巨细胞和前列腺进行成像的方法。

摘要

血小板由位于骨髓中的特制细胞巨细胞产生。10多年前，对巨型卡约细胞及其原生环境进行实时成像的可能性进行了描述，为血小板的形成过程揭示了新的认识。巨细胞通过鼻窦状血管的内皮衬里延伸拉长突起，称为凸起。本文提出了一个协议，以实时荧光标记的巨型细胞在头骨骨髓和鼻窦血管中同时成像。这项技术依赖于一个小手术，保持头骨完好无损，以限制炎症反应。鼠标头固定在头骨上，以防止呼吸。

使用双光子显微镜，巨型卡约细胞可以可视化长达几个小时，从而能够观察鼻窦血管内拉长过程中的细胞突起和凸起。这允许量化与突起形态（宽度、长度、收缩区域的存在）及其伸长行为（速度、规律性或暂停或缩回相的存在）相关的几个参数。该技术还允许同时记录鼻窦血管中的循环血小板，以确定血小板的速度和血流方向。这种方法对于研究使用转基因小鼠在血小板形成中感兴趣的基因的作用特别有用，并且也适用于药理学测试（研究机制，评估药物在治疗血小板生产障碍中的作用）。它已成为一个宝贵的工具，特别是补充 体外 研究，因为它现在知道， 在体内 和 体外 前列板形成依赖于不同的机制。例如，已经表明， 体外 显微管本身需要前列板拉长。然而， 在体内，他们宁愿作为一个脚手架，拉长主要是由血液流动的力量促进。

引言

血小板由位于骨髓中的巨型细胞专用细胞产生。由于通过骨骼观察实时事件的技术挑战，巨细胞在血液循环中释放血小板的确切方式长期以来一直不清楚。双光子显微镜帮助克服了这一挑战，并在了解血小板形成过程方面取得了重大进展。2007年，冯·安德里亚和他的同事首次 在体内 进行了巨型卡约细胞观测，通过头骨¹对荧光巨细胞进行了可视化。这是可能的，因为年轻成年小鼠前体头骨的骨层厚度为几十微米，并且足够透明，能够对基础骨髓²中的荧光细胞进行可视化。

随后的研究应用了这一程序来评估在各种条件下的前列板形成，并破译了基础机制3，4，5，6。这些研究提供了确凿的证据，证明巨细胞通过鼻窦血管的内皮屏障动态延伸突起（图1）。然后，这些蛋白胎作为代表数百个血小板体积的长片段被释放。血小板将在下游器官的微循环中，特别是肺^部的导板进行改造后形成。然而，迄今为止，确切的过程和分子机制仍有待讨论。例如，细胞骨骼蛋白在前列板拉长中的作用在体外条件和体内条件³之间有所不同，在^{炎症条件下，}前列板形成的差异已经显现出来。使事情更加复杂的是，最近的一项研究对前列腺驱动的概念提出异议，并建议在体内，血小板基本上是通过^在8级巨细胞的膜萌芽机制形成的。

本文采用微创程序，从活鼠的头骨骨中观察骨髓中的巨型细胞和前列腺。类似的方法以前曾被描述为可视化其他骨髓细胞，特别是造血干细胞和祖细胞^9。这里的重点是观察巨型卡约细胞和血小板，以详细说明一些可以测量的参数，特别是前列腺形态和血小板速度。此协议介绍了如何将导管插入壶静脉，以注射荧光示踪剂和药物，并通过头骨进行观察。钙变骨通过小手术暴露，使环粘在骨头上。此环用于固定头部并防止因呼吸而移动，并形成一个装满盐水的杯子，作为镜头的浸入介质。该技术非常适合 i） 实时观察正弦几何和与容器壁相互作用的巨型细胞:ii） 在前列腺形成、拉长和释放过程中遵循巨型卡约细胞:和 iii） 测量血小板运动，以监测复杂的鼻窦血流。使用此协议获得的数据最近已发布^3。

研究方案

所有动物实验均按照2010/63/欧盟欧洲标准和斯特拉斯堡大学动物实验伦理学CREMEAS委员会（斯特拉斯堡动物实验委员会，动物设施协议N+:G67-482-10，项目协议N+:2018061211274514）进行。

1. 小鼠的制备和壶静脉中插入导管

注:在这里，男性或女性，5-7周大的mTmG记者老鼠使用（B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sor^{tm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）luo10）}与Pf4-cre小鼠¹¹交叉，允许强烈的绿色荧光标签在巨型细胞和血小板^12。在开始实验之前，将显微镜的加热室预热几个小时。

1. 将鼠标运送到成像室并进行麻醉。
   1. 通过腹内注射氯胺酮（氯胺酮（100微克/克）和西拉津（10微克/克）（5微升/克）溶液，麻醉小鼠。
      注:这里使用氯胺酮/西拉津的重复管理，效果良好，但需要中断记录，以便定期重新注射。或者，如果有麻醉机，麻醉的诱导可以用氯胺酮/西拉津进行，然后在吸入气体（异黄酮、空气和氧气的混合物）下维持。
   2. 更换笼子里的动物，直到它达到深度麻醉。将鼠标放在加热板上，加热至 37 °C，以便进行后续操作。
      注:当动物达到深度麻醉时，打开显微镜和所有设备（见第4.1节），并设置手术完成后开始实验所需的不同参数（见第4.2节）。在这里，该过程仅持续 3 小时，并且是终端。实验后老鼠没醒就被安乐死。因此，对皮肤和仪器的乙醇消毒就足够了。但是，根据机构指南，或者如果程序持续更长时间，应使用更完整的消毒方法，如三个交替磨砂与βdine/povidone和酒精。
2. 在壶静脉中安装导管。
   注意:在手术过程中尽可能避免微生物污染非常重要。在进行手术前，请小心使用 70% 乙醇 （EtOH） 对皮肤进行仔细消毒。始终使用消毒剪刀和钳子，并定期冲洗在 70% EtOH 中。在干净的地方工作，戴口罩。22G"过针"导管，由塑料管内的针头组成，用于静脉注射（见 材料表）。
   1. 将鼠标放在其背上，用手术胶带固定前腿以伸展喉咙（图2A）。用70%乙醇消毒喉咙。
      注意:为了方便起见，手术前可能会剃光喉咙。如果手术持续更长时间，必须仔细剃须，以获得适当的无菌技术。
   2. 使用无菌剪刀在右侧或左侧的壶静脉上切开 0.7-1 厘米。拉伸相邻的结缔组织，露出外壶静脉和胸肌顶部（图2A）。
   3. 用温暖、无菌的生理盐水填充导管。穿透胸肌后将导管插入静脉（图2B）。
      注意:注意避免导管内出现气泡。重要的是插入导管通过肌肉，以防止出血，因为肌肉将形成一个压缩点。即使是有血吸虫病缺陷的小鼠，如 Itgb3-/-^小 鼠，也不会在插入导管时用这种方法流血。
   4. 轻轻取出针头，如果需要，小心地将导管移入静脉深处。通过添加一滴手术胶水（材料表），连接注射器并稳定导管。
      注意:有可能在尾静脉内插入导管，尽管它需要一些练习，因为静脉的口径较小。当使用黑头发的老鼠时，这尤其困难，黑头发的尾静脉几乎看不见。由于其较大的口径，将导管定位在壶静脉内可能会使更大的体积或重复的治疗注射更可靠。请注意，注射器在第一时间充满温盐水，不要忘记注射药物溶液之前注射死体积。
   5. 小心地将鼠标返回易发位置（图 2C）。在眼睛上涂上凝胶（材料表），以防止干燥。

2. 颅环的手术和安装

注:鼠标安装的全部支持包括 4 件、一个方块和一个板、固定鼠标头的环和固定灯块的螺丝（图 3A）。支持的所有元素都通过 3D 打印从 i.materialise.com 获得。该板由丙烯酸丁二烯（ABS）聚合物、不锈钢的块状和螺丝以及高档不锈钢（高细节不锈钢）的环制成（参见 3D 打印文件尺寸和补充材料的补充图 S1）。块永久固定在支架上，无论是拧紧还是粘合。一旦戒指固定在鼠标头骨上，它应该拧到块架（图3A）。

1. 用纸巾湿润头皮上的头发，用70%的乙醇消毒。用湿纸巾去除所有松动的头发。
   注意:为了方便起见，手术前头皮可能会剃光。
2. 通过在中线至1厘米处和耳朵之间形成T，用无菌细剪刀和钳子暴露钙化物，使头皮裂开。
   注:环将被定位为重叠正面和面骨（图3B）。
3. 使用无菌钳子暴露头骨。用剪刀和钳子小心地取出腹膜。使用浸透生理盐水的无菌棉签去除所有围产区以及任何可能改变成像的碎屑或头发。
   注意:为了限制炎症反应，请注意不要损坏骨骼。
4. 用盐水冲洗去除任何血迹，用干棉签快速干燥骨骼。将胶凝胶涂抹在环上，将其放置在裸露的骨骼上，并将其保持几秒钟，使戒指牢固地连接到头骨上。
   注:没有胶水必须进入观察场，因为它可能导致不良的自流。
5. 轻轻滋润头骨与浸泡在生理盐水的棉签。
6. 通过仔细混合 1:1 蓝色和黄色组件来准备硅牙膏。将牙膏涂在环周围进行密封，以防止成像过程中泄漏。小心地去除可能进入环的任何牙膏或胶水。
7. 用盐水填充环，并检查泄漏情况。
   注:盐水作为显微镜目标的浸入介质。使用有血吸虫病相关缺陷的老鼠时，出血可能更为严重。防止血液进入环至关重要，因为它可能会模糊进一步的成像。
8. 将鼠标放在支架上，将环拧在块支架上（图 3C）。将折叠压缩物放在动物头部下，以抬起头部，防止环从头骨分离。
   注意:头部是直接固定的，因此可以防止因呼吸而发生图像运动。
9. 将支撑和鼠标组装放置在加热显微镜室（图 3D）中。
   注意:请注意，不要随时拆下插入的导管。

3. 麻醉小鼠的随访，直到实验结束

注:麻醉每35分钟通过交替注射氯胺酮（s.c.）注射氯胺酮（25微克/克）在5微升/克体重和氯胺酮（50微克/克）和二恶英（5微克/克）（1.2微克/克）的混合物中重新诱导。由于在采集过程中无法打开加热显微镜室，因此在通过脚趾捏合重新管理麻醉剂之前和之后进行麻醉监测。同样，在开始每个新视频录制之前，也会执行脚趾捏。

1. 如果需要，停止采集，并重新诱导麻醉注射.c。
   1. 小心不要移动鼠标头，在左手拇指和食指之间捏住背部的皮肤。用右手将麻醉剂注射到后皮褶皱中（ 左手人则相反 ）。
2. 检查环中是否存在盐水，如有必要，请填充新鲜的盐水。在接下来的 35 分钟继续录制，并在录制期间进行类似的录制。
3. 在实验结束时，在老鼠醒来之前，用颈椎错位对老鼠实施安乐死。
   注:根据当地伦理和动物福利委员会的同意，小鼠的麻醉时间最长为3小时。

4. 双光子成像

注:请参阅 材料表 ，了解显微镜和相关设备的详细信息。图像是用共振扫描仪（12 或 8 kHz）录制的。建立双向模式是为了增加速度采集，因为像素是双向记录的:因此，阶段中的任何不匹配都必须与控制面板"相校正"进行更正。最后，在获取速度和信号噪声比之间建立了一个适应的平均值。

1. 打开双光子显微镜，包括激光和共振扫描仪（输出激光功率通常为 ±1.8-2.5 W，具体取决于激光）。
2. 为所选荧光片设置适当的激光波长。设置适当的波长，以恢复发射的光。
   注:在这里，波长为913纳米和混合探测器（500-550纳米和575-625纳米）分别用于同时激发和检测亚历克萨弗勒-488和Qtracker-655。
3. 使用细胞内导管，注射荧光示踪剂，给血管（Qtracker-655）贴上标签: 材料表）。以 0.2 μM 为解决方案注入 50 μL/鼠标，每小时更新一次，最大为 150 μL/实验。
   注:其他示踪剂可用于高分子量德克斯特兰^1。在这种情况下，考虑血液粘度可以通过德克斯特兰改变，并修改一些血液学参数。
4. 将显微镜阶段与支撑和鼠标置于显微镜的目标下。检查环是否总是充满盐水，并沉浸在目标中。使用表观性定位骨髓血管（红色）和沿鼻窦血管对齐的巨型细胞（绿色）的存在。
   注:头骨骨厚度低于100微米^2。骨髓位于骨骼下方，很容易被荧光绿色巨细胞和由Qtracker-655标记的密集的红色肛门鼻窦血管识别。
5. 长期收购（巨型卡约细胞、前列腺）
   1. 搜索感兴趣的区域。应用上述图像采集参数。
   2. 对于长期采集（例如，预板形成或拉长的可视化），使用 8 kHz 共振扫描仪以优化的间隔（通常在 0.85 到 1.34 μm 之间）获取 z 堆栈图像。
      注:12 kHz 共振扫描仪可提高采集速度。
   3. 获取 384 x 384 像素图像，可视化整个巨型大细胞和容器。根据需要，使用平均线，以便以良好的分辨率快速获取。确定图像堆栈采集的时间间隔，通常为 10 s 或 30 s，用于板可视化。
      注:在这里，平均8线用于获得更高的信号与噪声比，这允许获得1图像/10s与8 kHz共振扫描仪。确保允许在实时采集期间平均行。
6. 短期和快速收购（血小板）
   注:对于短时间的快速事件（如血小板速度）的获取，必须最大限度地提高帧采集率。选择正确的采集类型将优化帧获取率（即时空采集类型"xyt"）。
   1. 最小化（例如，256 x 90 像素），并在需要时通过旋转成像场调整图像大小以适应容器。
   2. 使用最高可用的扫描速度。
   3. 使用双向扫描。
      注意:对于双向扫描，请确保该相位经过良好调整。
   4. 最小化平均线，以找到图像定义和获取速度之间的最佳折衷点。
      注意:对于血小板速度测量，像素化图像如果有助于提高采集速度，则可能足够。
   5. 最小化 z 堆栈以提高获取速度。仅获得 1 z 堆栈就足以量化血小板速度。获得10-20s测量血小板速度。
      注:使用 12 kHz 共振扫描仪使用这些条件，最多可获得 133 帧/s。参数必须适应条件。然而，在某些容器中，血小板速度过高，无法可靠地量化血小板速度。
7. 板宽度和长度测量
   注:要加载在 Leica 软件上获得的 LIF 文件与 ImageJ，请首先下载并安装 LOCI 插件 ImageJ 以使用生物格式导入器。
   1. 板宽度
      1. 用 ImageJ 打开电影。要执行宽度测量，请仅使用没有容器的前列板电影。要分离不同的频道，请单击"图像|颜色 和选择 拆分通道。
      2. 对于 z 堆栈电影，单击 "图像"，对每个时间点进行平均 Z 投影|堆叠 并选择 Z 项目。对于 投影类型，输入 平均强度。
      3. 处理图像以消除噪音。点击"过程"减去后台 |减去背景 并应用 滚球半径:50.0 像素。通过单击 "过程"和"平滑"来平滑图像。
      4. 跟踪靠近前列腺底部的线（靠近巨型细胞，避开任何其他物体）。
         注意:不要忘记设置图像的刻度，通过单击 "分析"和"设置刻度"来获取所需单位中的价值。默认情况下，图像的单位为像素。
      5. 绘制强度轮廓，适合高斯曲线，并计算半最大值（FWHM）的全宽度。为此，请单击插件在宏中编写以下脚本 |新的和选择 宏 ，并通过点击宏运行它 |运行宏: y=获取文件 （）:x=阵列.获取时间（y.长度）;适合. doFit （"高斯"， x， y）:适合. 情节 （）;西格玛+健身（3）;Fwhm = （2 * sqrt （2 * 日志 （2） * 西格玛;打印 （FWHM）。
         注意:确保线路扫描中只有一个峰值，与前列板强度相对应。
      6. 执行步骤 4.7.5 中描述的动作，在 1 片上或随着时间推移重复，以获得前列板的平均宽度
   2. 板长
      1. 沿着前列腺追踪一条线，从靠近巨型卡约细胞的底座到顶部。使用细分线跟随板状。重复它为每个时间点。
      2. 请记住使用投资回报率管理器保存每行:单击分析|工具并选择投资回报率经理。点击加入投资回报率经理窗口，按照选择的方式将每行添加到经理中。要保存文件夹中的所有行，请单击 Deelect |上的ROI 经理更多并点击保存。从投资回报率经理处，从结果表中提取每行（测量）的长度值。
         注意:不要忘记设置图像的刻度，通过单击 "分析"和"设置刻度"来获取所需单位中的价值。默认情况下，图像的单位为像素。
8. 血小板速度测量
   注:血小板速度是根据10-20度以上在容器内流动的荧光血小板的视频记录计算得出的。执行第一图像处理以获取周期性重复的线扫描数据。运动导致条纹，其角度取决于速度，允许其计算。在这里，速度计算的方法，使用Radon转换，这是比传统的单数值分解（SVD）方法¹⁵更稳健。
   1. 图像处理与图像J
      1. 用 ImageJ 打开电影。单击流程|，应用高斯模糊过滤器 过滤器，选择 高斯模糊，并应用西格玛（半径）:2.00。选择一个小区域来测量流量，并跟踪 3 条相邻的线路，按照流向。
         注意:不要忘记通过单击分析|使用 ROI 经理来保存每行工具|投资回报率经理。单击"添加"投资回报率管理器窗口以添加每行并保存它们;点击第一次德选|更多然后点击保存。
      2. 使用 ImageJ 线扫描软件，通过单击 "图像|"为每行构建一个 kymograph堆栈:选择 遗物并应用以下参数:输出间距（微米）:1.000 /切片计数:1 / 避免插值。保存生成的时空图像。
         注:生成的图像显示与血小板随时间流动时的血小板线性运动对应的条纹。条纹的角度是速度的函数。
   2. 使用 Matlab 或 GNU 八度软件进行速度测量
      注:血小板在血液流动中的速度是根据时空图像使用计算分析方法根据德鲁和合作者¹⁵描述的Radon转换来估计的。这种数学方法的描述超出了这次审查的范围，读者被提交到德鲁等人的出版物中，了解有关计算¹⁵的详细信息。Matlab 代码和更多信息都可以在他们的网站上 https://www.drew-lab.org/code。
      1. 使用 Matlab 或 GNU 八度软件打开代码。
         注:代码可能需要根据所需的研究进行调整。
      2. 从 3 个时空图像中提取值，对应于在同一容器部分绘制的相邻线。计算船舶这一部分的平均血小板流速值。
         注意:不要忘记将结果转换为正确的测量单位（例如，μm/s）。

结果

使用此协议，荧光示踪剂Qtracker-655通过静脉注射来成像头骨骨髓中的血管和箭头所描绘的流动方向（图4A，左图）。使用mTmG小鼠，eGFP荧光血小板记录在每个血管分支超过20s，他们的速度测量使用图像J和GNU八度软件（图4A，右）。注意流速和方向的异质性。鼻窦容器由于肛门糖而呈现复杂的流动，并存在流回流甚至停滞，如 视频1中记录的?...

讨论

血小板形成机制高度依赖骨髓环境。因此，活体显微镜已成为该领域实时可视化过程的重要工具。含有荧光巨细胞的小鼠可以通过与任何含有有条件荧光基因表达盒的浮子小鼠在巨型卡约细胞中表达Cre重组的小鼠进行交叉来获得。在这里，mTmG记者小鼠使用（B6.129（Cg）-Gt（ROSA）26Sor^{tm4（ACTB-tdTomato，-EGFP）luo10）}与Pf4-cre小鼠¹¹交叉，允许强烈的绿色荧光标签在巨型卡...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent