В городе Vivo Двухфотонная визуализация мегакариоцитов и проплацелетов в костном мозге черепа мыши

Резюме

Здесь описан метод визуализации мегакариоцитов и проплацетов в костном мозге черепа живых мышей с помощью двухфотонной микроскопии.

Аннотация

Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами, специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Возможность изображения мегакариоцитов в режиме реального времени и их родной среды была описана более 10 лет назад и проливает новый свет на процесс образования тромбоцитов. Мегакариоциты распространяются на удлиненные протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальную выстилку синусоидальных сосудов. В данной работе представлен протокол для одновременного изображения в режиме реального времени флуоресцентно меченых мегакариоцитов в костном мозге черепа и синусоидальных сосудах. Этот метод основан на незначительной операции, которая сохраняет череп нетронутым, чтобы ограничить воспалительные реакции. Голова мыши обездвижена кольцом, приклеенным к черепу, чтобы предотвратить движения от дыхания.

С помощью двухфотонной микроскопии мегакариоциты можно визуализировать на срок до нескольких часов, что позволяет наблюдать клеточные протрузии и проplatelets в процессе удлинения внутри синусоидальных сосудов. Это позволяет количественно оценить несколько параметров, связанных с морфологией выступов (ширина, длина, наличие сужающих областей) и их поведением удлинения (скорость, регулярность или наличие пауз или фаз втягивания). Этот метод также позволяет одновременно регистрировать циркулирующие тромбоциты в синусоидальных сосудах для определения скорости тромбоцитов и направления кровотока. Этот метод особенно полезен для изучения роли генов, представляющих интерес, в образовании тромбоцитов с использованием генетически модифицированных мышей, а также поддался фармакологической проверке (изучению механизмов, оценке препаратов при лечении нарушений выработки тромбоцитов). Он стал бесценным инструментом, особенно для дополнения исследований in vitro, поскольку теперь известно, что образование проплатлетов in vivo и in vitro зависит от разных механизмов. Было показано, например, что микротрубочки in vitro необходимы для удлинения проплатлетов как такового. Однако in vivoони скорее служат каркасом, удлинению которого в основном способствуют силы кровотока.

Введение

Тромбоциты вырабатываются мегакариоцитами - специализированными клетками, расположенными в костном мозге. Точный способ высвобождения мегакариоцитами тромбоцитов в циркуляции долгое время оставался неясным из-за технической проблемы в наблюдении событий в реальном времени через кость. Двухфотонная микроскопия помогла преодолеть эту проблему и привела к значительным достижениям в понимании процесса образования тромбоцитов. Первые наблюдения in vivo мегакариоцитов были сделаны фон Андрианом и его коллегами в 2007 году с визуализацией флуоресцентных мегакариоцитов через череп^1. Это стало возможным благодаря тому, что костный слой в лобно-париетальном черепе молодых взрослых мышей имеет толщину в несколько десятков микрон и достаточно прозрачен, чтобы позволить визуализацию флуоресцентных клеток в нижележащего костном мозге^2.

Последующие исследования применяли эту процедуру для оценки образования проплацирования в различных условиях и для расшифровки основных механизмов^3,4,5,6. Эти исследования предоставили окончательные доказательства того, что мегакариоциты динамически расширяют протрузии, называемые проплацелетами, через эндотелиальный барьер синусоидальных сосудов(рисунок 1). Эти пластинки затем высвобождаются в виде длинных фрагментов, которые представляют собой несколько сотен тромбоцитов в объеме. Тромбоциты будут образовываться после ремоделирования проплацетов в микроциркуляции нижестоящих органов, особенно в легких^7. Однако на сегодняшний день точный процесс и молекулярные механизмы остаются предметом дискуссий. Например, предложенная роль цитоскелетных белков в удлинении проплацет различается между условиями in vitro и in vivo ^3,и различия в образовании проплацелетов были продемонстрированы в воспалительных состояниях^6. Еще больше усложняет ситуацию недавнее исследование, оспаривающее концепцию, управляемую проплатлетами, и предположило, что in vivoтромбоциты по существу образуются через механизм мембранного почкования на уровне мегакариоцитов^8.

В данной работе представлен протокол наблюдения за мегакариоцитами и проплацелетами в костном мозге из кости черепа у живых мышей, с использованием малоинвазивной процедуры. Подобные подходы были ранее описаны для визуализации других клеток костного мозга, в частности гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток^9. Основное внимание здесь уделяется наблюдению за мегакариоцитами и тромбоцитами для детализации некоторых параметров, которые могут быть измерены, в частности морфологии проплатлетов и скорости тромбоцитов. В этом протоколе представлено, как вставить катетер в яремную вену для введения флуоресцентных индикаторов и лекарств и наблюдения через кость черепа. Кальвариальная кость подвергается воздействию с помощью незначительной хирургии, так что кольцо приклеивается к кости. Это кольцо служит для обездвиживания головы и предотвращения движений из-за дыхания и образует чашку, наполненную физиологическим раствором в качестве погружной среды хрусталика. Эта методика хорошо подходит для i) наблюдения в режиме реального времени синусоидальной геометрии и мегакариоцитов, взаимодействующих со стенкой сосуда; ii) следить за мегакариоцитами в процессе образования, удлинения и высвобождения проплацирования; и iii) измерять движения тромбоцитов для мониторинга сложного синусоидального кровотока. Данные, полученные с помощью этого протокола, были недавно опубликованы³.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с европейскими стандартами 2010/63/EU и Комитетом CREMEAS по этике экспериментов на животных Страсбургского университета (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, project agreement N°: 2018061211274514).

1. Подготовка мышей и введение катетера в яремную вену

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь использовались самцы или самки, 5-7-недельные мыши-репортеры mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10),}скрещенные с мышами Pf4-cre^11,что позволяет интенсивное мететь зеленой флуоресценцией в мегакариоцитах и тромбоцитах^12. Перед началом эксперимента предварительно разогреть нагревательную камеру микроскопа на несколько часов.

1. Транспортировать мышь в комнату визуализации и приступать к анестезии.
   1. Обезболить мышь путем внутрибрюшинного (т.п.) введения раствора кетамина (кетамина (100 мкг/г) и ксилазина (10 мкг/г) (5 мкл/г).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторное введение кетамина/ксилазина используется здесь и работает хорошо, но требует прерывания записи для регулярной повторной забавки. Альтернативно, если анестезионный аппарат доступен, индукция анестезии может быть выполнена кетамином/ксилазином и впоследствии поддерживаться при вдыхании газов (смесь изофлурана, воздуха и кислорода).
   2. Замените животное в его клетке, пока оно не достигнет глубокой анестезии. Поместите мышь на нагретую тарелку, нагретую при 37 °C для всех последующих манипуляций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пока животное достигает глубокой анестезии, включите микроскоп и все оборудование (см. раздел 4.1) и настройте различные параметры, необходимые (см. раздел 4.2), чтобы начать эксперимент после завершения операции. Здесь процедура длится всего 3 ч и является терминальной. Мышь усыпляют после эксперимента, не просыпаясь. Следовательно, достаточно дезинфекции этанола для кожи и инструментов. Однако, в зависимости от институциональных руководящих принципов или если процедура будет длиться дольше, следует использовать более полные методы дезинфекции, такие как три чередующихся скраба с бетадином / повидоном и спиртом.
2. Установите катетер в яремную вену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно избегать микробного загрязнения во время операции, насколько это возможно. Позаботьтесь о том, чтобы тщательно дезинфицировать кожу 70% этанолом (EtOH), прежде чем приступать к операции. Всегда используйте стерилизованные ножницы и пинцет, и регулярно ополаскивайте их в 70% EtOH. Работайте в чистом месте и носите маску для лица. Для внутривенного введения используется катетер «над иглой» 22 Г, состоящий из иглы внутри пластиковой трубки (см. Таблицу материалов).
   1. Поместите мышь на спину, а передние ноги зафиксируйте хирургическим скотчем, чтобы растянуть горло(рисунок 2А). Продезинфицируйте горло 70% этанолом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства горло можно побрить перед операцией. Если процедура длится дольше, необходимо выполнить тщательное бритье для правильной асептической техники.
   2. Сделайте разрез 0,7-1 см над правой или левой яремной веной с помощью стерильных ножниц. Растяните соседнюю соединительную ткань, чтобы обнажить наружную яремную вену и верхнюю часть грудной мышцы(рисунок 2А).
   3. Заполните катетер теплым, стерильным физиологическим раствором. Вводят катетер в вену после проникновения через грудную мышцу(рисунок 2В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Позаботьтесь о том, чтобы избежать пузырьков воздуха внутри катетера. Важно вставить катетер через мышцу, чтобы предотвратить кровоизлияние, так как мышца будет формировать точку сжатия. Даже мыши с дефектами гемостаза, такие как мыши Itgb3^-/- не кровоточат при введении катетера при таком подходе.
   4. Аккуратно удалите иглу, а при необходимости осторожно переместите катетер глубже в вену. Соедините шприц и стабилизируем катетер, добавив каплю хирургического клея(Таблица материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно вставить катетер внутрь хвостовой вены, хотя это требует некоторой практики, потому что вена имеет меньший калибр. Особенно это затруднительно при использовании мышей с темной шерстью, у которых хвостовая вена едва заметна. Из-за большего калибра расположение катетера внутри яремной вены может позволить более надежно вводить большие объемы или повторные процедуры. Обратите внимание, что шприц сначала заполняется теплым физиологическим раствором, и не забывайте вводить мертвый объем перед инъекцией раствора препарата.
   5. Осторожно верните мышь в положение лежа(рисунок 2C). Нанесите гель(Таблица материалов)на глаза для предотвращения сухости.

2. Хирургия и установка черепного кольца

ПРИМЕЧАНИЕ: Полная поддержка установки мыши состоит из 4 частей, блока и пластины, кольца для удержания головки мыши и винта для фиксации кольца к блоку(рисунок 3A). Все элементы опоры были получены из i.materialise.com с помощью 3D-печати. Пластина изготовлена из полимера акрилонитрилбутадиенстирола (ABS), блока и винта из нержавеющей стали и кольца из высококачественной нержавеющей стали (высокодетализированная нержавеющая сталь) (см. Дополнительный рисунок S1 для размеров и дополнительных материалов для файлов 3D-печати). Блок крепится надолго к опоре, либо привинчивается, либо приклеивается. После того, как кольцо закреплено на черепе мыши, его следует прикрутить к держателю блока(рисунок 3А).

1. Смочите волосы на коже головы бумажным полотенцем, влажным с 70% этанолом для дезинфекции. Удалите все распущенный волос влажным бумажным полотенцем.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для удобства кожу головы можно побрить перед операцией.
2. Разрезайте кожу головы, образуя Т на средней линии до 1 см и между ушами, чтобы обнажить кальварий с помощью стерильных мелких ножниц и пинцета.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кольцо будет расположено таким же, чтобы перекрывать лобную и теменной кости(рисунок 3B).
3. Используйте стерильный пинцет, чтобы обнажить череп. Аккуратно удалите позуху ножницами и пинцетом. Используйте стерильный ватный тампон, пропитанный физиологическим раствором, чтобы удалить всю надкостничную часть и любой мусор или волосы, которые могут изменить визуализацию.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы ограничить воспалительные реакции, позаботьтесь о том, чтобы не повредить кость.
4. Удалите все следы крови, промыв физиологическим раствором, и быстро высушите кость сухим ватным тампоном. Нанесите клеевой гель на кольцо, расположите его на открытой кости и выдержите в течение нескольких секунд, чтобы кольцо прочно прикрепило к черепу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Клей не должен поступать в поле наблюдения, так как это может привести к нежелательной автофлуоресценции.
5. Слегка смочить череп ватным тампоном, погруженным в физиологический раствор.
6. Приготовьте силиконовую зубную пасту, тщательно перемешав синие и желтые компоненты 1:1. Нанесите зубную пасту по всему кольцу для герметизации, чтобы предотвратить утечку во время визуализации. Осторожно удалите любую зубную пасту или клей, которые могли войти в кольцо.
7. Заполните кольцо физиологическим раствором и проверьте на герметичность.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Физиологический раствор служит в качестве иммерсионной среды для объектива микроскопа. Кровотечение может быть более критичным при использовании мышей с дефектами, связанными с гемостазом. Важно предотвратить попадание крови в кольцо, так как это может размыть дальнейшую визуализацию.
8. Поместите мышь на опору, а кольцо прикрутите к держателю блока(рисунок 3C). Поместите складные компрессы под голову животного, чтобы поднять голову и предотвратить отслоение кольца от черепа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Голова непосредственно фиксируется, чтобы предотвратить движения изображения из-за дыхания.
9. Расположите опору и узел мыши в камере нагретого микроскопа(рисунок 3D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не выбить вставленный катетер в любое время.

3. Наблюдение за обезболенные мыши до конца эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Анестезия повторно индуцируется каждые 35 мин путем чередования подкожных (s.c.) инъекций кетамина (25 мкг/г) в объеме 5 мкл/г массы тела и смеси кетамина (50 мкг/г) и ксилазина (5 мкг/г) (1,2 мкл/г). Поскольку невозможно открыть камеру нагретого микроскопа во время приобретения, анестезирующий мониторинг выполняется до и после повторного введения анестетика путем защемления носа. Аналогично, защемление ноского нога выполняется перед началом каждой новой видеозаписи.

1. При необходимости прекратите приобретение и повторно индуцируете анестезию путем .c. инъекции.
   1. Стараясь не двигать головкой мыши, защемляйте кожу спины между большим и указательным пальцами левой руки. Подкожно вводят анестетик в складку кожи спины правой рукой (или наоборот левшам).
2. Проверьте наличие физиологического раствора в кольце, а при необходимости наполните его свежим физиологическим раствором. Продолжайте запись в течение следующих 35 минут и продолжайте аналогично в течение продолжительности записи.
3. В конце эксперимента усыпить мышь путем вывиха шейки матки, прежде чем она проснется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь находится под наркозом в течение максимум 3 ч, по согласованию с местным комитетом по этике и благополучию животных.

4. Двухфотонная визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации о микроскопе и связанном с ним оборудовании. Изображения записывались резонансным сканером (12 или 8 кГц). Двунаправленный режим был настроен для увеличения скорости захвата, поскольку пиксели записываются в обоих направлениях; следовательно, любое несоответствие в фазе должно быть исправлено с помощью панели управления «фазовая коррекция». Наконец, адаптированное усреднение было установлено в качестве компромисса между скоростью захвата и отношением сигнал/шум.

1. Включите двухфотонный микроскоп, включая лазерный и резонансный сканер (выходная мощность лазера обычно ~1,8-2,5 Вт в зависимости от лазера).
2. Установите соответствующую длину волны лазера для выбранных флуорофоров. Установите соответствующую длину волны для восстановления излучаемых огней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь длина волны 913 нм и гибридные детекторы (500-550 нм и 575-625 нм) использовались для одновременного возбуждения и обнаружения AlexaFluor-488 и Qtracker-655 соответственно.
3. Используя внутриюгулярный катетер, вводят флуоресцентный индикатор для маркировки сосудистой системы (Qtracker-655; Таблица материалов). Вводят 50 мкл/мышь раствора при 0,2 мкМ, обновляемого один раз в час в течение максимум 150 мкл/эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие индикаторы, такие как высокомолекулярный декстран^1. В таком случае учтите, что вязкость крови может быть изменена декстраном и модифицируйте некоторые гемореологические параметры.
4. Поместите ступень микроскопа с опорой и мышью под цель микроскопа. Убедитесь, что кольцо всегда заполнено физиологическим раствором и погрузите объектив. Используйте эпифлуоресценцию для определения местоположения сосудов костного мозга (красный) и наличие мегакариоцитов (зеленых), выровненных вдоль синусоидальных сосудов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кость черепа имеет толщину менее 100^мкм2. Костный мозг расположен под костью и легко распознается по флуоресцентным зеленым мегакариоцитам и плотным красным анастомозным синусоидным сосудам, помеченным Qtracker-655.
5. Длительные приобретения (мегакариоциты, проплацелеты)
   1. Поиск интересуемого региона. Примените параметры получения изображения, как указано выше.
   2. Для длительных захватов (например, визуализация образования или удлинения проплатлетов) получайте изображения z-стека с оптимизированными интервалами (обычно от 0,85 до 1,34 мкм) с помощью резонансного сканера 8 кГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Резонансный сканер с частотой 12 кГц может увеличить скорость захвата.
   3. Получите изображения размером 384 x 384 пикселя, чтобы визуализировать весь мегакариоцит и сосуд. Используйте усреднение строк, по желанию, для быстрого получения с хорошим разрешением. Определите временной интервал получения стека изображений, обычно 10 с или 30 с для визуализации проплатлетов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь для получения более высокого отношения сигнал/шум использовалось линейное усреднение 8, что позволило получить 1 изображение/10 с с помощью резонансного сканера 8 кГц. Убедитесь, что усреднение строк во время живого приобретения разрешено.
6. Короткое и быстрое приобретение (тромбоциты)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для более короткого получения быстрых событий, таких как скорость тромбоцитов, важно максимизировать частоту захвата кадров. Выбор правильного типа захвата оптимизирует скорость захвата кадров (т.е. пространственно-временной тип захвата "xyt").
   1. Сверните (например, 256 x 90 пикселей) и при необходимости отрегулируйте размер изображения для сосуда, поверните поле изображения.
   2. Используйте самую высокую доступную скорость сканирования.
   3. Используйте двунаправленное сканирование.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для двунаправленного сканирования убедитесь, что фаза хорошо отрегулирована.
   4. Сведите к минимуму усреднение строк, чтобы найти оптимальный компромисс между определением изображения и быстротой получения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения скорости тромбоцитов пикселизированного изображения может быть достаточно, если оно помогает увеличить скорость получения.
   5. Минимизируйте z-стек для повышения скорости сбора данных. Получение только 1 z-стека достаточно для количественной оценки скорости тромбоцитов. Приобретайте в течение 10-20 с для измерения скорости тромбоцитов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимум 133 кадра/с можно получить с помощью этих условий с помощью резонансного сканера с частотой 12 кГц. Параметры должны быть адаптированы к условиям. В некоторых сосудах скорость тромбоцитов, тем не менее, слишком высока, чтобы надежно количественно оценить скорость тромбоцитов с этими настройками.
7. Измерение ширины и длины пластины
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы загрузить LIF-файлы, полученные в программном обеспечении Leica с imageJ, сначала загрузите и установите плагин LOCI на ImageJ, чтобы использовать импортер биоформатов.
   1. Ширина проплатлета
      1. Откройте фильм с помощью ImageJ. Для выполнения измерения ширины используйте только ролик из пластин без сосуда. Чтобы разделить различные каналы, нажмите на Изображение| Цвет и выберите Разделенные каналы.
      2. Для фильма z-стека сделайте среднюю z-проекцию для каждой точки времени, щелкнув Изображение| Стеки и выберите Z Project. В для типа проекциивведите среднюю интенсивность.
      3. Обработайте изображение, чтобы удалить шум. Вычтите фон, нажав на Процесс| Вычтите фон и примените радиус катящегося шара: 50,0 пикселей. Сгладьте изображение, нажав на «Обработать» и «Сгладить».
      4. Провести линию близко к основанию проплатлета (вблизи мегакариоцита, избегая любого другого объекта).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте установить масштаб изображения, чтобы получить значение в нужной единице измерения, нажав на Analyze and Set Scale. По умолчанию единица изображения находится в пикселях.
      5. Постройте профиль интенсивности, подогнать кривую Гаусса и вычислить полную ширину при половинном максимуме (FWHM). Для этого напишите следующий скрипт в макросе, нажав на Плагины| Создать и выберите Макрос и запустить его, нажав на Макрос| Запустить макрос: y=getProfile(); x=Массив.getПоследовательность(y.длина); Fit.doFit("Гауссов",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; печать (FWHM).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в сканировании линии есть только один пик, соответствующий интенсивности проплатлета.
      6. Выполните действия, описанные в шаге 4.7.5 на 1 срезе или повторив с течением времени, чтобы получить среднюю ширину проплатлета
   2. Длина проплатлета
      1. Провести линию вдоль проплатлета, от основания близко к мегакариоциту до вершины. Используйте сегментированную линию, чтобы следовать за формой проплатлета. Повторите его для каждого момента времени.
      2. Не забудьте сохранить каждую строку с помощью МЕНЕДЖЕРА ROI: нажмите «Анализировать | Инструменты и выберите МЕНЕДЖЕР ROI. Нажмите кнопку Добавить в окне Менеджер ROI, чтобы добавить каждую строку в менеджер в том виде, в который он выбран. Чтобы сохранить все строки в папке, щелкните в диспетчере ROI на | Еще и нажмите сохранить. Из диспетчера ROI извлеките значение длины каждой строки(Measure)из таблицы результатов.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте установить масштаб изображения, чтобы получить значение в нужных единицах, нажав на Анализ и установка масштаба. По умолчанию единица изображения находится в пикселях.
8. Измерение скорости тромбоцитов
   ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость тромбоцитов рассчитывается по видеозаписи флуоресцентных тромбоцитов, протекающих внутри сосуда в течение 10-20 с. Обработка первого изображения выполняется для получения циклически повторяющихся данных линейного сканирования. Движение приводит к полосам, угол которых зависит от скорости, что позволяет рассчитывать ее. Здесь скорость была рассчитана с помощью метода, который использует преобразование радона, которое является более надежным, чем классический метод разложения сингулярных значений (SVD)^15.
   1. Обработка изображений с помощью ImageJ
      1. Откройте фильм с помощью ImageJ. Примените фильтр размытия Гаусса, щелкнув Процесс | Фильтры, выберите Размытие Гауссаи примените Сигма (Радиус): 2.00. Выберите небольшую область для измерения потока и проследите 3 смежные линии, следующие за направлением потока.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте сохранить каждую строку с помощью менеджера ROI, нажав на Анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемому окупаемому Нажмите «Добавить» в окне ROI Manager, чтобы добавить каждую строку и сохранить их; нажмите сначала на Отменить выбор | Еще, а затем нажмите Сохранить.
      2. Используя программное обеспечение для линейного сканирования ImageJ, создайте кимограф для каждой строки, нажав на Image | Стеки; выберите Reslice и примените следующие параметры: Выходной интервал (микрон): 1.000 / Количество фрагментов: 1 / Избегать интерполяции. Сохраните полученные пространственно-временные изображения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Полученное изображение показывает полосы, соответствующие линейному движению тромбоцитов в кровотоке с течением времени. Угол полосы является функцией скорости.
   2. Измерение скорости с помощью программного обеспечения Matlab или GNU Octave
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость тромбоцитов в кровотоке оценивается по пространственно-временным изображениям с использованием метода вычислительного анализа, основанного на преобразовании радона, описанном Дрю и соавторами^15. Описание этого математического метода выходит за рамки данного обзора, и читатель обращается к публикации Drew et al. для получения подробной информации относительно расчета^15. Как код Matlab, так и дополнительная информация доступны на их веб-сайте https://www.drew-lab.org/code.
      1. Откройте код с помощью программного обеспечения Matlab или GNU Octave.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Код может потребовать адаптации в соответствии с желаемым исследованием.
      2. Извлеките значение из 3 пространственно-временных изображений, соответствующих соседним линиям, нарисованным в той же части сосуда. Рассчитайте среднее значение скорости потока тромбоцитов для этой части сосуда.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте преобразовать результат в правильную единицу измерения (например, мкм/с).

Результаты

Используя этот протокол, флуоресцентный индикатор, Qtracker-655, вводили внутривенно для изображения анастомозированных синусоидальных сосудов костного мозга в костном мозге черепа и направления потока, как показано стрелками(рисунок 4A, слева). Используя мышей mTmG, eGFP-флуоре...

Обсуждение

Механизмы образования тромбоцитов сильно зависят от среды костного мозга. Следовательно, прижизальная микроскопия стала важным инструментом в полевых условиях для визуализации процесса в режиме реального времени. Мыши с флуоресцентными мегакариоцитами могут быть получены путем скр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent