In Vivo Imagem de dois fótons de megacariócitos e proplatelets na medula óssea do crânio do rato

Resumo

Descrevemos aqui o método para imagem de megacaiócitos e proplatelets na medula do osso do crânio de ratos vivos usando microscopia de dois fótons.

Resumo

As plaquetas são produzidas por megacaiócitos, células especializadas localizadas na medula óssea. A possibilidade de imagem de megacaiócitos em tempo real e seu ambiente nativo foi descrita há mais de 10 anos e lança uma nova luz sobre o processo de formação de plaquetas. Os megacariócitos estendem as saliências alongadas, chamadas proplatelets, através do revestimento endotelial dos vasos sinusoides. Este artigo apresenta um protocolo para imagem simultânea em tempo real fluorescentemente rotulado megacariócitos na medula óssea do crânio e vasos sinusoides. Esta técnica conta com uma pequena cirurgia que mantém o crânio intacto para limitar as reações inflamatórias. A cabeça do rato é imobilizada com um anel colado no crânio para evitar que os movimentos respirem.

Usando microscopia de dois fótons, megacariócitos podem ser visualizados por até algumas horas, permitindo a observação de saliências celulares e proplatelets no processo de alongamento dentro de vasos sinusoides. Isso permite a quantificação de vários parâmetros relacionados à morfologia das protrusões (largura, comprimento, presença de áreas de constrição) e seu comportamento de alongamento (velocidade, regularidade ou presença de pausas ou fases de retração). Esta técnica também permite o registro simultâneo de plaquetas circulantes em vasos sinusoides para determinar a velocidade plaqueta e a direção do fluxo sanguíneo. Este método é particularmente útil para estudar o papel dos genes de interesse na formação de plaquetas usando camundongos geneticamente modificados e também é favorável aos testes farmacológicos (estudar os mecanismos, avaliando drogas no tratamento de distúrbios de produção de plaquetas). Tornou-se uma ferramenta inestimável, especialmente para complementar estudos in vitro, pois agora se sabe que a formação in vivo e in vitro proplatelet depende de diferentes mecanismos. Foi demonstrado, por exemplo, que microtúbulos in vitro são necessários para alongamento proplatelet por si só. No entanto, in vivo, eles preferem servir como um andaime, o alongamento sendo promovido principalmente por forças de fluxo sanguíneo.

Introdução

As plaquetas são produzidas por células especializadas em megacaiócitos localizadas na medula óssea. A maneira precisa como os megacaiócitos liberam plaquetas na circulação há muito tempo não ficou clara devido ao desafio técnico em observar eventos em tempo real através do osso. A microscopia de dois fótons ajudou a superar esse desafio e levou a grandes avanços na compreensão do processo de formação de plaquetas. As primeiras observações in vivo de megacaito foram feitas por von Andrian e colegas em 2007, com a visualização de megacaiócitos fluorescentes através do crânio¹. Isso foi possível porque a camada óssea no crânio frontoparietal de camundongos adultos jovens tem uma espessura de algumas dezenas de mícrons e é suficientemente transparente para permitir a visualização de células fluorescentes na medula óssea subjacente².

Estudos subsequentes aplicaram este procedimento para avaliar a formação de proplatos em várias condições e decifrar os mecanismos subjacentes^3,4,5,6. Esses estudos forneceram evidências definitivas de que os megacaiócitos ampliam dinamicamente as saliências, chamadas proplatelets, através da barreira endotelial dos vasos sinusoides(Figura 1). Essas propuladas são então liberadas como fragmentos longos que representam várias centenas de plaquetas em volume. As plaquetas serão formadas após a remodelação das propuladas na microcirculação de órgãos a jusante, notadamente nos pulmões⁷. Até o momento, no entanto, o processo preciso e os mecanismos moleculares permanecem sujeitos a debate. Por exemplo, o papel proposto das proteínas citoesqueletal no alongamento das proplatelets difere entre as condições in vitro e in vivo ³, e as diferenças na formação de proplatelets têm sido demonstradas sob condições inflamatórias⁶. Complicando ainda mais as coisas, um estudo recente contestou o conceito orientado por proplatelet e propôs que in vivo, plaquetas são essencialmente formadas através de um mecanismo de brotação de membrana no megacaiócito nível⁸.

Este artigo apresenta um protocolo para a observação de megacaiócitos e proplatelets na medula óssea do osso do crânio em camundongos vivos, usando um procedimento minimamente invasivo. Abordagens semelhantes foram descritas anteriormente para visualizar outras células de medula, notadamente células hematopoiéticas e progenitoras⁹. O foco aqui está na observação de megacaiócitos e plaquetas para detalhar alguns parâmetros que podem ser medidos, notadamente morfologias proplatelet e velocidade plaqueta. Este protocolo apresenta como inserir um cateter na veia jugular para injetar traços fluorescentes e drogas e observar através do osso do crânio. O osso calvário é exposto usando uma pequena cirurgia para que um anel seja colado ao osso. Este anel serve para imobilizar a cabeça e evitar movimentos devido à respiração e formar um copo cheio de soro fisiológico como o meio de imersão da lente. Esta técnica é bem adequada para i) observar em tempo real a geometria sinusoide e megacariócitos interagindo com a parede do vaso; ii) seguir os megacaitos no processo de formação de proplatelet, alongamento e liberação; e iii) medir os movimentos das plaquetas para monitorar o complexo fluxo sanguíneo sinusoide. Os dados obtidos usando este protocolo foram publicados recentemente³.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com as normas europeias 2010/63/UE e o Comitê de Ética em Experimentos Animais da Universidade de Estrasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Acordo de Instalações Animais N°: G67-482-10, acordo de projeto N°: 2018061211274514).

1. Preparação de camundongos e inserção de cateter na veia jugular

NOTA: Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG de 5-7 semanas de idade (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo10}) cruzados com ratos Pf4-cre¹¹, permitindo rotulagem intensa de fluorescência verde em megacariócitos e plaquetas¹². Antes de começar o experimento, pré-aqueça a câmara de aquecimento do microscópio por algumas horas.

1. Transporte o rato para a sala de imagens e prossiga para anestesia.
   1. Anestesiar o camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de uma solução de cetamina (cetamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
      NOTA: A administração repetida de cetamina/xilazina é usada aqui e funciona bem, mas requer a interrupção da gravação para reinjeção regular. Alternativamente, se uma máquina de anestesia estiver disponível, a indução da anestesia pode ser realizada com cetamina/xilazina e, posteriormente, mantida sob inalação de gases (mistura de isoflurano, ar e oxigênio).
   2. Substitua o animal em sua gaiola até atingir anestesia profunda. Coloque o mouse em uma placa aquecida a 37 °C para todas as manipulações subsequentes.
      NOTA: Enquanto o animal atinge anestesia profunda, ligue o microscópio e todos os equipamentos (ver seção 4.1) e configure os diferentes parâmetros necessários (ver seção 4.2) para iniciar o experimento assim que a cirurgia for feita. Aqui, o procedimento dura apenas 3h e é terminal. O rato é eutanizado após o experimento sem acordar. Assim, a desinfecção do etanol para pele e instrumentos é suficiente. No entanto, dependendo das diretrizes institucionais, ou se o procedimento durar mais tempo, devem ser utilizados métodos mais completos de desinfecção, como três esfregões alternados com betadina/povidona e álcool.
2. Instale um cateter na veia jugular.
   NOTA: É importante evitar a contaminação microbiana durante a cirurgia na medida do possível. Tome cuidado para desinfetar cuidadosamente a pele com 70% de etanol (EtOH) antes de prosseguir com a cirurgia. Use sempre tesouras e pinças esterilizadas e enxágue-as regularmente em 70% de EtOH. Trabalhe em um lugar limpo, e use uma máscara facial. Um cateter "over-the needle" de 22 G, composto por uma agulha dentro de um tubo plástico, é usado para injeção intravenosa (ver a Tabela de Materiais).
   1. Coloque o mouse nas costas e conserte as pernas anteriores com fita cirúrgica para esticar a garganta(Figura 2A). Desinfete a garganta com 70% de etanol.
      NOTA: Por conveniência, a garganta pode ser raspada antes da cirurgia. Se o procedimento durar mais tempo, deve ser realizada uma barba cuidadosa para uma técnica asséptica adequada.
   2. Faça uma incisão de 0,7-1 cm sobre a veia jugular direita ou esquerda usando uma tesoura estéril. Estique o tecido conjuntivo adjacente para expor a veia jugular externa e a parte superior do músculo peitoral(Figura 2A).
   3. Encha o cateter com soro fisiológico quente e estéril. Insira o cateter na veia após penetrar através do músculo peitoral(Figura 2B).
      NOTA: Tome cuidado para evitar bolhas de ar dentro do cateter. É importante inserir o cateter através do músculo para evitar hemorragia, pois o músculo formará um ponto de compressão. Mesmo camundongos com defeitos de hemostase, como Itgb3^-/- ratos, não sangram na inserção do cateter com essa abordagem.
   4. Retire suavemente a agulha e, se necessário, mova cuidadosamente o cateter para dentro da veia. Conecte a seringa e estabilize o cateter adicionando uma gota de cola cirúrgica(Tabela de Materiais).
      NOTA: É possível inserir um cateter dentro da veia traseira, embora exija alguma prática porque a veia tem um calibre menor. Isso é especialmente difícil quando se usa ratos com cabelos escuros, cuja veia traseira é pouco visível. Devido ao seu maior calibre, o posicionamento do cateter dentro da veia jugular pode permitir que volumes maiores ou tratamentos repetidos sejam injetados de forma mais confiável. Observe que a seringa é preenchida pela primeira vez com soro fisiológico quente, e não se esqueça de injetar o volume morto antes de injetar a solução da droga.
   5. Retorne cuidadosamente o mouse para uma posição propensa(Figura 2C). Aplique gel (Tabela de Materiais) nos olhos para evitar o ressecamento.

2. Cirurgia e instalação do anel craniano

NOTA: O suporte completo para instalação do mouse compreende 4 peças, um bloco e uma placa, o anel para segurar a cabeça do mouse e um parafuso para fixar o anel ao bloco(Figura 3A). Todos os elementos do suporte foram obtidos a partir de i.materialise.com por impressão 3D. A placa é feita de polímero de estireno butadieno de acrilonitrilo (ABS), o bloco e o parafuso de aço inoxidável, e o anel de aço inoxidável de alto grau (aço inoxidável de alto detalhado) (Ver Figura Suplementar S1 para dimensões e Materiais Suplementares para os arquivos de impressão 3D). O bloco é fixado permanentemente ao suporte, seja parafusado ou colado. Uma vez fixado o anel no crânio do mouse, ele deve ser aparafusado ao suporte do bloco(Figura 3A).

1. Umedeça o cabelo no couro cabeludo com uma toalha de papel molhada com 70% de etanol para desinfecção. Remova todo o cabelo solto com uma toalha de papel molhada.
   NOTA: Por conveniência, o couro cabeludo pode ser raspado antes da cirurgia.
2. Incisar o couro cabeludo formando um T na linha média até 1 cm e entre as orelhas para expor o calvarium usando tesouras finas estéreis e pinças.
   NOTA: O anel será posicionado para sobrepor os ossos frontal e parietal(Figura 3B).
3. Use pinças estéreis para expor o crânio. Remova cuidadosamente o periósteo com tesouras e pinças. Use um cotonete estéril encharcado com soro fisiológico para remover todo o periosteum e quaisquer detritos ou cabelos, que possam alterar a imagem.
   NOTA: Para limitar as reações inflamatórias, tome muito cuidado para não danificar o osso.
4. Remova qualquer traço sanguíneo enxaguando com soro fisiológico, e seque rapidamente o osso com um cotonete seco. Aplique o gel de cola no anel, posicione-o sobre o osso exposto e mantenha-o por alguns segundos para que o anel fique firmemente preso ao crânio.
   NOTA: Nenhuma cola deve entrar no campo de observação, pois pode levar a uma autofluorescência indesejável.
5. Umedeça levemente o crânio com um cotonete imerso em soro fisiológico.
6. Prepare a pasta dentária de silício misturando cuidadosamente os componentes azul e amarelo 1:1. Aplique pasta dentária em todo o anel para vedação para evitar vazamentos durante a imagem. Remova cuidadosamente qualquer pasta dentária ou cola que possa ter entrado no anel.
7. Encha o anel com soro fisiológico e verifique se há vazamento.
   NOTA: O soro fisiológico serve como meio de imersão para o objetivo do microscópio. O sangramento pode ser mais crítico ao usar camundongos com defeitos relacionados à hemostasia. É essencial evitar que o sangue entre no anel, pois pode desfocar mais imagens.
8. Coloque o mouse no suporte e enrosque o anel no suporte do bloco(Figura 3C). Coloque compressas dobradas sob a cabeça do animal para levantar a cabeça e evitar o descolamento do anel do crânio.
   NOTA: A cabeça é diretamente fixada para evitar movimentos de imagem devido à respiração.
9. Posicione o suporte e a montagem do mouse na câmara de microscópio aquecido(Figura 3D).
   NOTA: Tenha cuidado para não desalojar o cateter inserido a qualquer momento.

3. Acompanhamento dos camundongos anestesiados até o final do experimento

NOTA: A anestesia é reinduzida a cada 35 minutos por alternar injeções subcutâneas (s.c.) de cetamina (25 μg/g) em um volume de 5 μL/g de peso corporal e uma mistura de cetamina (50 μg/g) e xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Como não é possível abrir a câmara de microscópio aquecido durante a aquisição, o monitoramento anestésico é realizado antes e depois da regeração do anestésico por beliscar o dedo do dedo do dedo. Da mesma forma, o toe pinch é realizado antes de iniciar cada nova gravação de vídeo.

1. Se necessário, pare de aquisição e reinduza a anestesia por injeção de s.c.
   1. Tomando cuidado para não mover a cabeça do rato, beliscar a pele da parte de trás entre o polegar e o dedo indicador da mão esquerda. Injete subcutâneamente o anestésico na dobra da pele traseira usando a mão direita (ou vice-versa para pessoas canhotas).
2. Verifique se há presença de soro fisiológico no anel e, se necessário, preencha com soro fisiológico fresco. Continue gravando pelos próximos 35 minutos, e prossiga da mesma forma para a duração da gravação.
3. No final do experimento, eutanize o rato por luxação cervical antes que ele acorde.
   NOTA: O mouse é mantido anestesiado por uma duração máxima de 3h, de acordo com o comitê local de ética e bem-estar animal.

4. Imagem de dois fótons

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre o microscópio e equipamentos relacionados. As imagens foram gravadas com um scanner ressonante (12 ou 8 kHz). O modo bidirecional foi criado para aumentar a aquisição de velocidade à medida que os pixels são registrados em ambas as direções; portanto, qualquer incompatibilidade na fase deve ser corrigida com a "correção de fase" do painel de controle. Finalmente, uma média adaptada foi configurada como um compromisso entre a velocidade de aquisição e a relação sinal-ruído.

1. Ligue o microscópio de dois fótons, incluindo o laser e o scanner ressonante (potência laser de saída geralmente ~1,8-2,5 W dependendo do laser).
2. Defina o comprimento de onda laser apropriado para os fluoroforos escolhidos. Defina o comprimento de onda apropriado para a recuperação de luzes emitidas.
   NOTA: Aqui, um comprimento de onda de 913 nm e detectores híbridos (500-550 nm e 575-625 nm) foram usados para simultaneamente excitar e detectar AlexaFluor-488 e Qtracker-655, respectivamente.
3. Utilizando o cateter intrajugular, injete o rastreador fluorescente para rotular a vasculatura (Qtracker-655; Tabela de Materiais). Injete 50 μL/mouse de uma solução a 0,2 μM, renovada uma vez a cada hora para um máximo de 150 μL/experimento.
   NOTA: Outros rastreadores podem ser usados, como dextran de alto peso molecular¹. Nesse caso, considere que a viscosidade sanguínea pode ser alterada pelo Dextran e modificar alguns parâmetros hemorheológicos.
4. Coloque o estágio do microscópio com o suporte e o mouse sob o objetivo do microscópio. Verifique se o anel está sempre cheio de soro fisiológico e mergulhe no objetivo. Use epifluorescência para localizar os vasos de medula óssea (vermelho) e a presença de megacaiócitos (verde) alinhados ao longo de vasos sinusoides.
   NOTA: O osso do crânio tem uma espessura inferior a 100 μm². A medula está localizada sob o osso e é facilmente reconhecida pelos megacariócitos verdes fluorescentes e pelos densos vasos sinusoides vermelhos rotulados por Qtracker-655.
5. Aquisições longas (megacaiócitos, proplatelets)
   1. Procure a região de interesse. Aplique parâmetros de aquisição de imagem como mencionado acima.
   2. Para aquisições longas (por exemplo, visualização de formação de proplatelet ou alongamento), adquira imagens de pilha z com intervalos otimizados (geralmente entre 0,85 e 1,34 μm) usando um scanner ressonante de 8 kHz.
      NOTA: Um scanner ressonante de 12 kHz pode aumentar a velocidade de aquisição.
   3. Adquira imagens de 384 x 384 pixels para visualizar todo o megacaiócito e o vaso. Use a média da linha, conforme desejado, para aquisição rápida com boa resolução. Determine o intervalo de tempo da aquisição da pilha de imagens, geralmente de 10 ou 30 s para visualização proplatelet.
      NOTA: Aqui, uma média de linha de 8 foi usada para obter uma maior relação sinal-ruído, o que permitiu a aquisição de 1 imagem/10 s com um scanner ressonante de 8 kHz. Certifique-se de que a média da linha durante a aquisição ao vivo é permitida.
6. Aquisição curta e rápida (plaquetas)
   NOTA: Para a aquisição mais curta de eventos rápidos, como a velocidade plaqueta, é essencial maximizar a taxa de aquisição de quadros. A seleção do tipo de aquisição adequada otimizará a taxa de aquisição de quadros (ou seja, um tipo de aquisição de espaço-tempo "xyt").
   1. Minimize (por exemplo, 256 x 90 pixels) e ajuste o tamanho da imagem para o vaso girando o campo de imagem, se necessário.
   2. Use a maior velocidade de varredura disponível.
   3. Use digitalização bidirecional.
      NOTA: Para digitalização bidirecional, certifique-se de que a fase esteja bem ajustada.
   4. Minimize a média da linha para encontrar o compromisso ideal entre definição de imagem e rapidez de aquisição.
      NOTA: Para medições de velocidade plaqueta, uma imagem pixelizada pode ser suficiente se ajudar a aumentar a rapidez da aquisição.
   5. Minimize a pilha z para aumentar a rapidez de aquisição. Adquirir apenas 1 z-stack é suficiente para quantificar a velocidade plaqueta. Adquira por 10-20 s para medir a velocidade da plaqueta.
      NOTA: Um máximo de 133 quadros/s pode ser obtido usando estas condições com um scanner ressonante de 12 kHz. Os parâmetros devem ser adaptados às condições. Em alguns vasos, a velocidade da plaqueta é, no entanto, muito alta para quantificar a velocidade plaqueta com essas configurações de forma confiável.
7. Medida de largura e comprimento do proplato
   NOTA: Para carregar arquivos LIF obtidos no software Leica com ImageJ, primeiro baixe e instale o plug-in LOCI no ImageJ para usar o Importador de Formatos Biológicos.
   1. Largura do propulato
      1. Abra o filme com ImageJ. Para realizar a medição da largura, use apenas o filme das propulações sem o vaso. Para separar os diferentes canais, clique em Imagem| Colora e selecione Canais divididos.
      2. Para um filme de pilha z, faça uma projeção z média para cada ponto de tempo clicando em Imagem| Empilhe e selecione Projeto Z. Para o tipo de projeção,digite intensidade média.
      3. Trate a imagem para remover o ruído. Subtraia o plano de fundo clicando em Process| Subtraia o plano de fundo e aplique raio de bola rolando: 50,0 pixels. Suavizar a imagem clicando em Process and Smooth.
      4. Trace uma linha perto da base da propulato (perto do megacaiócito, evitando qualquer outro objeto).
         NOTA: Não se esqueça de definir a escala da imagem para obter o valor na unidade desejada clicando em Analisar e Definir escala. Por padrão, a unidade da imagem está em pixels.
      5. Plote o perfil de intensidade, encaixe uma curva gaussiana e calcule a Largura Total na Metade Máxima (FWHM). Para isso, escreva o seguinte script em uma macro clicando em Plugins| Novo e selecione Macro e execute-o clicando em Macro| Executar macro: y=getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit ("Gaussian", x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) * sigma; impressão (FWHM).
         NOTA: Certifique-se de que há apenas um único pico na varredura de linha, correspondendo à intensidade proplatelet.
      6. Execute as ações descritas na etapa 4.7.5 em 1 fatia ou repetidas ao longo do tempo para obter a largura média do proplatelet
   2. Comprimento de propulato
      1. Trace uma linha ao longo da proplatelet, da base perto do megacaiócito até o topo. Use uma linha segmentada para seguir a forma proplatelet. Repita para cada ponto de tempo.
      2. Lembre-se de salvar cada linha usando o Gerenciador de ROI: clique em Analisar | Ferramentas e selecione ROI Manager. Clique em Adicionar na janela Gerenciador de ROI para adicionar cada linha ao gerenciador como for selecionado. Para salvar todas as linhas em uma pasta, clique no Gerenciador de ROI em Desmarcar | Mais e clique em Salvar. Do Roi Manager, extraia o valor de comprimento de cada linha(Medida)da tabela de resultados.
         NOTA: Não se esqueça de definir a escala da imagem para obter o valor nas unidades desejadas clicando em Analisar e Definir escala. Por padrão, a unidade da imagem está em pixels.
8. Medição da velocidade plaqueta
   NOTA: A velocidade plaqueta é calculada a partir da gravação de vídeo de plaquetas fluorescentes que fluem dentro do vaso acima de 10-20 s. Um tratamento de primeira imagem é realizado para obter dados de varredura de linha ciclicamente repetidos. O movimento leva a listras cujo ângulo depende da velocidade, permitindo seu cálculo. Aqui, a velocidade foi calculada com um método que utiliza a transformação Radon, que é mais robusta do que o método clássico de decomposição de valor singular (SVD)¹⁵.
   1. Tratamento de imagem com ImageJ
      1. Abra o filme com ImageJ. Aplique um filtro gaussian Blur clicando em Process | Filtros, selecione Desfoque gaussianoe aplique Sigma (Raio): 2.00. Escolha uma pequena região para medir o fluxo e rastreie 3 linhas adjacentes seguindo a direção de fluxo.
         NOTA: Não se esqueça de salvar cada linha usando o Gerenciador de ROI clicando em Analisar | Ferramentas | Gerente do ROI. Clique em Adicionar na janela Gerenciador de ROI para adicionar cada linha e salvá-las; clique primeiro em Desmarque | Mais e, em seguida, clique em Salvar.
      2. Usando o software de varredura de linha ImageJ, construa um kymograph para cada linha clicando em Image | Pilhas; selecionar Reslice e aplicar os seguintes parâmetros: Espaçamento de saída (mícrons): 1.000 / Contagem de fatias: 1 / Evitar interpolação. Salve as imagens de espaço-tempo resultantes.
         NOTA: A imagem resultante mostra listras correspondentes ao movimento linear das plaquetas no fluxo sanguíneo ao longo do tempo. O ângulo de uma raia é uma função da velocidade.
   2. Medição de velocidade usando software Matlab ou GNU Octave
      NOTA: A velocidade das plaquetas no fluxo sanguíneo é estimada a partir das imagens espaço-tempo usando um método de análise computacional baseado na transformação radon descrita por Drew e colaboradores¹⁵. A descrição deste método matemático está além do escopo desta revisão, e o leitor é encaminhado à publicação por Drew et al. para detalhes sobre o cálculo¹⁵. Tanto o código Matlab quanto mais informações estão disponíveis em seu site https://www.drew-lab.org/code.
      1. Abra o código usando o software Matlab ou GNU Octave.
         NOTA: O código pode exigir adaptação de acordo com o estudo desejado.
      2. Extrair o valor das 3 imagens espaço-tempo, correspondentes às linhas adjacentes desenhadas na mesma porção da nave. Calcule o valor médio da velocidade do fluxo plaqueta para esta parte do vaso.
         NOTA: Não se esqueça de converter o resultado na unidade correta de medida (por exemplo, μm/s).

Resultados

Usando este protocolo, o rastreador fluorescente, Qtracker-655, foi administrado por via intravenosa a vasos sinusoides de medula anastomosa na medula óssea do crânio e na direção de fluxo, como retratado pelas setas(Figura 4A, à esquerda). Utilizando camundongos mTmG, as plaquetas fluorescentes eGFP foram registradas acima de 20 s em cada ramo do navio, e sua velocidade foi medida usando o software ImageJ e GNU Octave(Figura 4A, à direita). Note a heterog...

Discussão

Os mecanismos de formação de plaquetas são altamente dependentes do ambiente de medula óssea. Assim, a microscopia intravital tornou-se uma ferramenta importante no campo para visualizar o processo em tempo real. Camundongos com megacaiócitos fluorescentes podem ser obtidos cruzando camundongos expressando a recombinase cre em megacaiócitos com qualquer rato repórter floxed contendo um de expressão genética fluorescente condicional. Aqui, foram utilizados ratos repórteres mTmG (B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sor^...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent