In vivo Imaging a due fotoni di megacariociti e proplatati nel midollo osseo del cranio del topo

Riepilogo

Descriviamo qui il metodo per l'imaging di megacariociti e proplatelet nel midollo dell'osso del cranio di topi viventi usando la microscopia a due fotoni.

Abstract

Le piastrine sono prodotte da megacariociti, cellule specializzate situate nel midollo osseo. La possibilità di immagine dei megacariociti in tempo reale e del loro ambiente nativo è stata descritta più di 10 anni fa e getta nuova luce sul processo di formazione delle piastrine. I megacariociti estendono protrusioni allungate, chiamate proplatelet, attraverso il rivestimento endoteliale dei vasi sinusoidi. Questo documento presenta un protocollo per l'immagine simultanea in tempo reale di megacariociti marcati fluorescenti nel midollo osseo del cranio e nei vasi sinusoidi. Questa tecnica si basa su un intervento chirurgico minore che mantiene intatto il cranio per limitare le reazioni infiammatorie. La testa del topo è immobilizzata con un anello incollato al cranio per impedire ai movimenti di respirare.

Utilizzando la microscopia a due fotoni, i megacariociti possono essere visualizzati per un massimo di poche ore, consentendo l'osservazione di protrusioni cellulari e proplatelet nel processo di allungamento all'interno di vasi sinusoidi. Ciò consente la quantificazione di diversi parametri relativi alla morfologia delle sporgenze (larghezza, lunghezza, presenza di aree di costrizione) e al loro comportamento di allungamento (velocità, regolarità o presenza di pause o fasi di retrazione). Questa tecnica consente anche la registrazione simultanea delle piastrine circolanti nei vasi sinusoidi per determinare la velocità piastrinica e la direzione del flusso sanguigno. Questo metodo è particolarmente utile per studiare il ruolo dei geni di interesse nella formazione piastrinica utilizzando topi geneticamente modificati ed è anche suscettibile di test farmacologici (studiare i meccanismi, valutare i farmaci nel trattamento dei disturbi della produzione piastrinica). È diventato uno strumento inestimabile, soprattutto per integrare gli studi in vitro poiché è ormai noto che la formazione di proplatelet in vivo e in vitro si basa su meccanismi diversi. È stato dimostrato, ad esempio, che i microtubuli in vitro sono necessari per l'allungamento del proplatelet di per sé. Tuttavia, in vivo, servono piuttosto come un'impalcatura, l'allungamento è principalmente promosso dalle forze del flusso sanguigno.

Introduzione

Le piastrine sono prodotte da cellule specializzate in megacariociti situate nel midollo osseo. Il modo preciso in cui i megacariociti rilasciano piastrine nella circolazione è rimasto a lungo poco chiaro a causa della sfida tecnica nell'osservare eventi in tempo reale attraverso l'osso. La microscopia a due fotoni ha contribuito a superare questa sfida e ha portato a importanti progressi nella comprensione del processo di formazione delle piastrine. Le prime osservazioni in vivo di megacariociti sono state fatte da von Andrian e colleghi nel 2007, con la visualizzazione di megacariociti fluorescenti attraverso il cranio¹. Ciò è stato possibile perché lo strato osseo nel cranio frontoparietale di topi giovani adulti ha uno spessore di poche decine di micron ed è sufficientemente trasparente da consentire la visualizzazione di cellule fluorescenti nel midollo osseo sottostante².

Gli studi successivi hanno applicato questa procedura per valutare la formazione di proplatelet in varie condizioni e per decifrare i meccanismi sottostanti^3,4,5,6. Questi studi hanno fornito la prova definitiva che i megacariociti estendono dinamicamente le protrusioni, chiamate proplatelet, attraverso la barriera endoteliale dei vasi sinusoidi (Figura 1). Questi propulati vengono poi rilasciati come lunghi frammenti che rappresentano diverse centinaia di piastrine in volume. Le piastrine si formeranno dopo il rimodellamento delle proplatelet nella microcircolazione degli organi a valle, in particolare nei polmoni⁷. Ad oggi, tuttavia, il processo preciso e i meccanismi molecolari rimangono oggetto di dibattito. Ad esempio, il ruolo proposto delle proteine citoscheletriche nell'allungamento delle proplatelet differisce tra le condizioni in vitro e in vivo ³e le differenze nella formazione dei proplatelet sono state dimostrate in condizioni infiammatorie⁶. A complicare ulteriormente le cose, un recente studio ha contestato il concetto guidato dai proplatelet e ha proposto che in vivo,le piastrine si formino essenzialmente attraverso un meccanismo di gemmazione della membrana a livello di megacariociti⁸.

Questo documento presenta un protocollo per l'osservazione di megacariociti e proplatelet nel midollo osseo dall'osso del cranio in topi viventi, utilizzando una procedura minimamente invasiva. Approcci simili sono stati precedentemente descritti per visualizzare altre cellule del midollo, in particolare cellule staminali ematopoietiche e progenitrici⁹. L'attenzione qui è sull'osservazione di megacariociti e piastrine per dettagliare alcuni parametri che possono essere misurati, in particolare le morfologie delle proplatelet e la velocità piastrinica. Questo protocollo presenta come inserire un catetere nella vena giugulare per iniettare traccianti fluorescenti e farmaci e osservare attraverso l'osso del cranio. L'osso calvarioriale viene esposto con un intervento chirurgico minore in modo che un anello sia incollato all'osso. Questo anello serve a immobilizzare la testa e prevenire i movimenti dovuti alla respirazione e formare una tazza piena di soluzione salina come mezzo di immersione della lente. Questa tecnica ben si presta a i) osservare in tempo reale la geometria sinusoide e i megacariociti che interagiscono con la parete del vaso; ii) seguire i megacariociti nel processo di formazione, allungamento e rilascio delle proplatelet; e iii) misurare i movimenti piastrinici per monitorare il flusso sanguigno sinusoide complesso. I dati ottenuti utilizzando questo protocollo sono stati recentemente pubblicati³.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le norme europee 2010/63/UE e il Comitato CREMEAS sull'etica degli esperimenti sugli animali dell'Università di Strasburgo (Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg, Animal Facility agreement N°: G67-482-10, project agreement N°: 2018061211274514).

1. Preparazione dei topi e inserimento di un catetere nella vena giugulare

NOTA: Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG maschi o femmine, di 5-7 settimane (B6.129 (Cg)-Gt (ROSA) 26Sor^{tm4 (ACTB-tdTomato,-EGFP) Luo10}) incrociati con topi Pf4-cre¹¹, consentendo un'intensa etichettatura di fluorescenza verde nei megacariociti e nelle piastrine¹². Prima di iniziare l'esperimento, preriscaldare la camera di riscaldamento del microscopio per alcune ore.

1. Trasportare il mouse nella sala immagini e procedere all'anestesia.
   1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di una soluzione di ketamina (ketamina (100 μg/g) e xilazina (10 μg/g) (5 μL/g).
      NOTA: La somministrazione ripetuta di ketamina / xilazina viene utilizzata qui e funziona bene, ma richiede l'interruzione della registrazione per la reiniezione regolare. In alternativa, se è disponibile una macchina per anestesia, l'induzione dell'anestesia può essere eseguita con ketamina/xilazina e successivamente mantenuta sotto inalazione di gas (miscela di isoflurano, aria e ossigeno).
   2. Sostituisci l'animale nella sua gabbia fino a raggiungere l'anestesia profonda. Posizionare il mouse su una piastra riscaldata riscaldata a 37 °C per tutte le successive manipolazioni.
      NOTA: Mentre l'animale raggiunge l'anestesia profonda, accendere il microscopio e tutte le apparecchiature (vedere paragrafo 4.1) e impostare i diversi parametri necessari (vedere paragrafo 4.2) per iniziare l'esperimento una volta terminato l'intervento chirurgico. Qui, la procedura dura solo 3 ore ed è terminale. Il topo viene eutanasizzato dopo l'esperimento senza svegliarsi. Quindi, la disinfezione con etanolo per la pelle e gli strumenti è sufficiente. Tuttavia, a seconda delle linee guida istituzionali, o se la procedura durerebbe più a lungo, dovrebbero essere utilizzati metodi di disinfezione più completi come tre scrub alternati con betadina / povidone e alcol.
2. Installare un catetere nella vena giugulare.
   NOTA: È importante evitare il più possibile la contaminazione microbica durante l'intervento chirurgico. Fare attenzione a disinfettare accuratamente la pelle con il 70% di etanolo (EtOH) prima di procedere con l'intervento chirurgico. Utilizzare sempre forbici e pinzette sterilizzate e risciacquarle regolarmente nel 70% di EtOH. Lavora in un luogo pulito e indossa una maschera. Un catetere "over-the needle" da 22 G, costituito da un ago all'interno di un tubo di plastica, viene utilizzato per l'iniezione endovenosa (vedere la Tabella dei materiali).
   1. Posizionare il mouse sulla schiena e fissare le gambe anteriori con del nastro chirurgico per allungare la gola (Figura 2A). Disinfettare la gola con il 70% di etanolo.
      NOTA: Per comodità, la gola può essere rasata prima dell'intervento chirurgico. Se la procedura dura più a lungo, è necessario eseguire un'attenta rasatura per una corretta tecnica asettica.
   2. Fai un'incisione di 0,7-1 cm sulla vena giugulare destra o sinistra usando forbici sterili. Allungare il tessuto connettivo adiacente per esporre la vena giugulare esterna e la parte superiore del muscolo pettorale (Figura 2A).
   3. Riempire il catetere con soluzione fisiologica calda e sterile. Inserire il catetere nella vena dopo essere penetrato attraverso il muscolo pettorale (Figura 2B).
      NOTA: Fare attenzione ad evitare bolle d'aria all'interno del catetere. È importante inserire il catetere attraverso il muscolo per prevenire l'emorragia poiché il muscolo formerà un punto di compressione. Anche i topi con difetti di emostasi, come i topi Itgb3^-/-, non sanguinano dopo l'inserimento del catetere con questo approccio.
   4. Rimuovere delicatamente l'ago e, se necessario, spostare con attenzione il catetere più in profondità nella vena. Collegare la siringa e stabilizzare il catetere aggiungendo una goccia di colla chirurgica (Tabella dei materiali).
      NOTA: È possibile inserire un catetere all'interno della vena della coda, anche se richiede un po 'di pratica perché la vena ha un calibro più piccolo. Questo è particolarmente difficile quando si usano topi con i capelli scuri, la cui vena della coda è appena visibile. Grazie al suo calibro più grande, il posizionamento del catetere all'interno della vena giugulare può consentire di iniettare volumi maggiori o trattamenti ripetuti in modo più affidabile. Si prega di notare che la siringa viene riempita la prima volta con soluzione salina calda e non dimenticare di iniettare il volume morto prima di iniettare la soluzione farmacologica.
   5. Riportare con attenzione il mouse in posizione prona (Figura 2C). Applicare gel (Tabella dei materiali) sugli occhi per prevenire la secchezza.

2. Chirurgia e installazione dell'anello cranico

NOTA: Il supporto completo per l'installazione del mouse comprende 4 pezzi, un blocco e una piastra, l'anello per tenere la testa del mouse e una vite per fissare l'anello al blocco (Figura 3A). Tutti gli elementi del supporto sono stati ottenuti da i.materialise.com mediante stampa 3D. La piastra è realizzata in polimero acrilonitrile butadiene stirene (ABS), il blocco e la vite di acciaio inossidabile e l'anello di acciaio inossidabile di alta qualità (acciaio inossidabile ad alta dettaglio) (vedere la figura supplementare S1 per dimensioni e materiali supplementari per i file di stampa 3D). Il blocco è fissato in modo permanente al supporto, avvitato o incollato. Una volta che l'anello è fissato sul cranio del mouse, deve essere avvitato al supporto del blocco (Figura 3A).

1. Inumidire i capelli sul cuoio capelluto con un tovagliolo di carta bagnato con etanolo al 70% per la disinfezione. Rimuovere tutti i capelli sciolti con un tovagliolo di carta bagnato.
   NOTA: Per comodità, il cuoio capelluto può essere rasato prima dell'intervento chirurgico.
2. Incidere il cuoio capelluto formando una T sulla linea mediana fino a 1 cm e tra le orecchie per esporre il calvario usando forbici e pinzette sterili.
   NOTA: L'anello sarà posizionato per sovrapporsi alle ossa frontali e parietali (Figura 3B).
3. Utilizzare pinzette sterili per esporre il cranio. Rimuovere con attenzione il periosteo con forbici e pinzette. Utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di soluzione salina fisiologica per rimuovere tutto il periosteo e qualsiasi detrito o capello, che potrebbe alterare l'imaging.
   NOTA: Per limitare le reazioni infiammatorie, fare molta attenzione a non danneggiare l'osso.
4. Rimuovere eventuali tracce di sangue risciacquando con soluzione salina e asciugare rapidamente l'osso con un batuffolo di cotone asciutto. Applicare il gel di colla sull'anello, posizionarlo sull'osso esposto e mantenerlo per alcuni secondi in modo che l'anello sia saldamente attaccato al cranio.
   NOTA: Nessuna colla deve entrare nel campo di osservazione in quanto potrebbe portare ad autofluorescenza indesiderata.
5. Inumidire leggermente il cranio con un batuffolo di cotone immerso nella fisiologica soluzione salina.
6. Preparare la pasta dentale di silicone mescolando accuratamente i componenti blu e gialli 1:1. Applicare la pasta dentale intorno all'anello per sigillare per evitare perdite durante l'imaging. Rimuovere con attenzione qualsiasi pasta dentale o colla che potrebbe essere entrata nell'anello.
7. Riempire l'anello con soluzione salina e verificare la perdita.
   NOTA: La soluzione salina funge da mezzo di immersione per l'obiettivo del microscopio. Il sanguinamento può essere più critico quando si utilizzano topi con difetti correlati all'emostasi. È essenziale impedire al sangue di entrare nell'anello in quanto potrebbe sfocare ulteriori immagini.
8. Posizionare il mouse sul supporto e avvitare l'anello sul supporto del blocco (Figura 3C). Metti gli impacchi piegati sotto la testa dell'animale per sollevare la testa e impedire il distacco dell'anello dal cranio.
   NOTA: la testa è fissata direttamente in modo da impedire i movimenti dell'immagine dovuti alla respirazione.
9. Posizionare il supporto e l'assemblaggio del mouse nella camera riscaldata del microscopio (Figura 3D).
   NOTA: Fare attenzione a non rimuovere il catetere inserito in qualsiasi momento.

3. Follow-up dei topi anestetizzati fino alla fine dell'esperimento

NOTA: L'anestesia viene reinindotta ogni 35 minuti alternando iniezioni sottocutanee (s.c.) di ketamina (25 μg/g) in un volume di 5 μL/g di peso corporeo e una miscela di ketamina (50 μg/g) e xilazina (5 μg/g) (1,2 μL/g). Poiché non è possibile aprire la camera del microscopio riscaldata durante l'acquisizione, il monitoraggio anestetico viene eseguito prima e dopo la ri-somministrazione dell'anestetico mediante pizzicamento delle dita. Allo stesso modo, il pizzicamento della dita dei punti viene eseguito prima di iniziare ogni nuova registrazione video.

1. Se necessario, interrompere l'acquisizione e reindurre l'anestesia mediante iniezione di s.c.
   1. Facendo attenzione a non muovere la testa del mouse, pizzicare la pelle della schiena tra il pollice e l'indice della mano sinistra. Iniettare per via sottocutanea l'anestetico nella piega della pelle posteriore usando la mano destra (o viceversa per i mancini).
2. Verificare la presenza di soluzione salina nell'anello e, se necessario, riempire con soluzione salina fresca. Continua a registrare per i successivi 35 minuti e procedi in modo simile per la durata della registrazione.
3. Alla fine dell'esperimento, eutanasizzare il topo per lussazione cervicale prima che si svegli.
   NOTA: Il topo viene tenuto anestetizzato per una durata massima di 3 ore, in accordo con il comitato etico e per il benessere degli animali locale.

4. Imaging a due fotone

NOTA: Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli sul microscopio e sulle relative apparecchiature. Le immagini sono state registrate con uno scanner risonante (12 o 8 kHz). La modalità bidirezionale è stata impostata per aumentare la velocità di acquisizione man mano che i pixel vengono registrati in entrambe le direzioni; quindi, qualsiasi discrepanza nella fase deve essere corretta con la "correzione di fase" del pannello di controllo. Infine, è stata impostata una media adattata come compromesso tra velocità di acquisizione e rapporto segnale-rumore.

1. Accendere il microscopio a due fotone, incluso il laser e lo scanner risonante (potenza laser in uscita di solito ~ 1,8-2,5 W a seconda del laser).
2. Impostare la lunghezza d'onda laser appropriata per i fluorofori scelti. Impostare la lunghezza d'onda appropriata per il recupero delle luci emesse.
   NOTA: Qui, una lunghezza d'onda di 913 nm e rilevatori ibridi (500-550 nm e 575-625 nm) sono stati utilizzati per eccitare e rilevare contemporaneamente AlexaFluor-488 e Qtracker-655, rispettivamente.
3. Utilizzando il catetere intragiugulare, iniettare il tracciante fluorescente per etichettare la vascolarizzazione (Qtracker-655; Tabella dei materiali). Iniettare 50 μL/topo di una soluzione a 0,2 μM, rinnovata una volta ogni ora per un massimo di 150 μL/esperimento.
   NOTA: Possono essere utilizzati altri traccianti come il destrano ad alto peso molecolare¹. In tal caso, considerare che la viscosità del sangue può essere alterata dal destrano e modificare alcuni parametri emoreologici.
4. Posizionare lo stadio del microscopio con il supporto e il mouse sotto l'obiettivo del microscopio. Controllare che l'anello sia sempre pieno di soluzione salina e immergere l'obiettivo. Utilizzare l'epifluorescenza per localizzare i vasi del midollo osseo (rosso) e la presenza di megacariociti (verdi) allineati lungo i vasi sinusoidi.
   NOTA: L'osso del cranio ha uno spessore inferiore a 100 μm². Il midollo si trova sotto l'osso ed è facilmente riconoscibile dai megacariociti verdi fluorescenti e dai densi vasi sinusoidi anastomosi rossi etichettati da Qtracker-655.
5. Acquisizioni lunghe (megacariociti, proplatelet)
   1. Cerca la regione di interesse. Applicare i parametri di acquisizione delle immagini come menzionato sopra.
   2. Per le acquisizioni lunghe (ad esempio, la visualizzazione della formazione o dell'allungamento del proplatelet), acquisire immagini z-stack con intervalli ottimizzati (di solito tra 0,85 e 1,34 μm) utilizzando uno scanner risonante a 8 kHz.
      NOTA: uno scanner risonante a 12 kHz può aumentare la velocità di acquisizione.
   3. Acquisisci immagini da 384 x 384 pixel per visualizzare l'intero megacariocita e la nave. Utilizzare la media di linea, come desiderato, per un'acquisizione rapida con una buona risoluzione. Determinare l'intervallo di tempo di acquisizione dello stack di immagini, in genere 10 s o 30 s per la visualizzazione del proplatelet.
      NOTA: Qui, è stata utilizzata una media di linea di 8 per ottenere un rapporto segnale-rumore più elevato, che ha permesso l'acquisizione di 1 immagine / 10 s con uno scanner risonante a 8 kHz. Assicurati che la media delle linee durante l'acquisizione dal vivo sia consentita.
6. Acquisizione breve e rapida (piastrine)
   NOTA: per l'acquisizione più breve di eventi rapidi, come la velocità piastrinica, è essenziale massimizzare la velocità di acquisizione dei fotogrammi. La selezione del tipo di acquisizione corretto ottimizzerà la velocità di acquisizione dei fotogrammi (ad es. un tipo di acquisizione spazio-temporale "xyt").
   1. Riduci a icona (ad esempio, 256 x 90 pixel) e regola le dimensioni dell'immagine sulla nave ruotando il campo di imaging, se necessario.
   2. Utilizzare la massima velocità di scansione disponibile.
   3. Utilizzare la scansione bidirezionale.
      NOTA: per la scansione bidirezionale, assicurarsi che la fase sia ben regolata.
   4. Riduci al minimo la media delle linee per trovare il compromesso ottimale tra definizione dell'immagine e rapidità di acquisizione.
      NOTA: per le misurazioni della velocità piastrinica, un'immagine pixelizzata può essere sufficiente se aiuta ad aumentare la rapidità di acquisizione.
   5. Riduci al minimo z-stack per aumentare la rapidità di acquisizione. L'acquisizione di solo 1 z-stack è sufficiente per quantificare la velocità piastrinica. Acquisire per 10-20 s per misurare la velocità piastrinica.
      NOTA: è possibile ottenere un massimo di 133 fotogrammi/s utilizzando queste condizioni con uno scanner risonante a 12 kHz. I parametri devono essere adattati alle condizioni. In alcuni vasi, la velocità piastrinica è tuttavia troppo alta per quantificare la velocità piastrinica con queste impostazioni in modo affidabile.
7. Misurazione della larghezza e della lunghezza del proplatelet
   NOTA: per caricare i file LIF ottenuti sul software Leica con ImageJ, scaricare e installare prima il plug-in LOCI su ImageJ per utilizzare Bio-Formats Importer.
   1. Larghezza del proplatelet
      1. Apri il filmato con ImageJ. Per eseguire la misurazione della larghezza, utilizzare solo il filmato dei proplatelet senza la nave. Per separare i diversi canali, clicca su Immagine| Colore e selezionare Dividi canali.
      2. Per un filmato z-stack, crea una proiezione z media per ogni punto temporale facendo clic su Immagine| Impila e seleziona Progetto Z. Per Tipo di proiezione, immettete Intensità media.
      3. Trattare l'immagine per rimuovere il rumore. Sottrarre lo sfondo facendo clic su Elabora| Sottrarre lo sfondo e applicare il raggio della sfera di rotolamento: 50,0 pixel. Liscia l'immagine facendo clic su Elabora e Liscia.
      4. Traccia una linea vicino alla base del proplatelet (vicino al megacariocita, evitando qualsiasi altro oggetto).
         NOTA: Non dimenticare di impostare la scala dell'immagine per ottenere il valore nell'unità desiderata facendo clic su Analizza e Imposta scala. Per impostazione predefinita, l'unità dell'immagine è in pixel.
      5. Tracciate il profilo di intensità, inserite una curva gaussiana e calcolate l'intera larghezza a metà massimo (FWHM). Per questo, scrivi il seguente script in una macro facendo clic su Plugin| Nuovo e selezionare Macro ed eseguirlo facendo clic su Macro| Esegui macro: y = getProfile(); x=Array.getSequence(y.length); Fit.doFit("Gaussian",x,y); Fit.plot(); sigma=Fit.p(3); FWHM = (2 * sqrt( 2 * log(2) ) ) * sigma; stampa (FWHM).
         NOTA: assicurarsi che nella scansione della linea sia presente un solo picco, corrispondente all'intensità del proplatelet.
      6. Eseguire le azioni descritte nel passaggio 4.7.5 su 1 fetta o ripetute nel tempo per ottenere la larghezza media del proplatelet
   2. Lunghezza del proplatelet
      1. Traccia una linea lungo la proplatelet, dalla base vicino al megacariocita verso l'alto. Utilizzate una linea segmentata per seguire la forma del proplatelet. Ripetilo per ogni punto temporale.
      2. Ricordati di salvare ogni riga utilizzando il ROI Manager: clicca su Analizza | Strumenti e selezionare ROI Manager. Fare clic su Aggiungi nella finestra ROI Manager per aggiungere ogni riga al manager così come è selezionato. Per salvare tutte le righe in una cartella, fare clic in ROI Manager su Deseleziona | Altro e clicca su Salva. Dal ROI Manager, estrarre il valore di lunghezza di ogni riga (Misura) dalla tabella dei risultati.
         NOTA: Non dimenticare di impostare la scala dell'immagine per ottenere il valore nelle unità desiderate cliccando su Analizza e Imposta scala. Per impostazione predefinita, l'unità dell'immagine è in pixel.
8. Misurazione della velocità piastrinica
   NOTA: La velocità piastrinica è calcolata dalla registrazione video di piastrine fluorescenti che scorrono all'interno del recipiente oltre 10-20 s. Viene eseguito un trattamento di prima immagine per ottenere dati di scansione della linea ciclicamente ripetuti. Il movimento porta a striature il cui angolo dipende dalla velocità, consentendo il suo calcolo. Qui, la velocità è stata calcolata con un metodo che utilizza la trasformata di Radon, che è più robusta del classico metodo di decomposizione del valore singolare (SVD)¹⁵.
   1. Trattamento delle immagini con ImageJ
      1. Apri il filmato con ImageJ. Applicare un filtro Sfocatura gaussiana facendo clic su Elabora | Filtri, selezionare Sfocatura gaussianae applicare Sigma (Raggio): 2.00. Scegli una piccola regione per misurare il flusso e traccia 3 linee adiacenti seguendo la direzione del flusso.
         NOTA: Non dimenticare di salvare ogni riga utilizzando il ROI Manager facendo clic su Analizza | Strumenti | ROI Manager. Clicca su Aggiungi nella finestra ROI Manager per aggiungere ogni riga e salvarle; clicca prima su Deseleziona | Altro e quindi fare clic su Salva.
      2. Utilizzando il software di scansione della linea ImageJ, crea un kymograph per ogni linea facendo clic su Image | Pile; selezionare Reslice e applicare i seguenti parametri: Spaziatura di uscita (micron): 1.000 / Conteggio sezioni: 1 / Evitare l'interpolazione. Salvare le immagini spazio-temporali risultanti.
         NOTA: L'immagine risultante mostra strisce corrispondenti al movimento lineare delle piastrine nel flusso sanguigno nel tempo. L'angolo di una striscia è una funzione della velocità.
   2. Misurazione della velocità con il software Matlab o GNU Octave
      NOTA: La velocità delle piastrine nel flusso sanguigno è stimata dalle immagini spazio-temporali utilizzando un metodo di analisi computazionale basato sulla trasformata di Radon descritta da Drew e collaboratori¹⁵. La descrizione di questo metodo matematico esula dallo scopo di questa recensione, e il lettore è rimandato alla pubblicazione di Drew et al. per i dettagli riguardanti il^{calcolo 15}. Sia il codice Matlab che ulteriori informazioni sono disponibili sul loro sito Web https://www.drew-lab.org/code.
      1. Apri il codice usando il software Matlab o GNU Octave.
         NOTA: il codice potrebbe richiedere un adattamento in base allo studio desiderato.
      2. Estrarre il valore dalle 3 immagini spazio-temporali, corrispondenti alle linee adiacenti disegnate nella stessa porzione di vaso. Calcolare il valore medio della velocità del flusso piastrinico per questa porzione della nave.
         NOTA: non dimenticare di convertire il risultato nell'unità di misura corretta (ad esempio, μm/s).

Risultati

Utilizzando questo protocollo, il tracciante fluorescente, Qtracker-655, è stato somministrato per via endovenosa per l'immagine dei vasi sinusoidi del midollo anastomoso nel midollo osseo del cranio e la direzione del flusso come raffigurato dalle frecce(Figura 4A,a sinistra). Utilizzando mouse mTmG, le piastrine fluorescenti eGFP sono state registrate oltre 20 s in ogni ramo del vaso e la loro velocità è stata misurata utilizzando il software ImageJ e GNU Octave(Fig...

Discussione

I meccanismi di formazione delle piastrine dipendono fortemente dall'ambiente del midollo osseo. Quindi, la microscopia intravitale è diventata uno strumento importante sul campo per visualizzare il processo in tempo reale. I topi con megacariociti fluorescenti possono essere ottenuti incrociando topi che esprimono la cre ricombinatasi in megacariociti con qualsiasi topo reporter floxed contenente una cassetta di espressione genica fluorescente condizionale. Qui sono stati utilizzati topi reporter mTmG (B6.129 (Cg) -

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
GNU Octave software	GNU Project		https://www.gnu.org/software/octave/
Histoacryl 5 x 0, 5 mL	Braun	1050052	injectable solution of surgical glue
HyD hybrid detectors Leica Microsystems 4tunes	Leica Microsystems
ImageJ	GNU project		Minimum version required
Imalgene/Ketamine 1000 fl/10 mL	Boehring	03661103003199	eye protection
Leica SP8 MP DIVE microscope equipped with a 25x water objective, numerical aperture of 0.95	Leica Microsystems		simultaneous excitation of AlexaFluor-488 and Qtracker-655
Matlab	MathWorks		https://www.mathworks.com/
Ocrygel 10 g	Laboratoires T.V.M.	03700454505621	Silicon dental paste blue and yellow
Picodent twinsin speed	Rotec	13001002
Qtracker 655 vascular label	Invitrogen	Q21021MP	injectable solution
Resonant scanner, 8 or 12 kHz
Rompun Xylazine 2% fl/25 mL	Bayer	04007221032311
Superglue gel			to glue the ring to the bone
Surflo IV catheter - Blue 22 G	Terumo	SR-OX2225C1
Ti:Saph pulsing laser (Coherent) (femtosecond)	Coherent