تعديل شكل البوليستر القائم على البوليمرات باستخدام الضغط التناضحي

Summary

البوليمرات هي الحويصلات البوليمرية ذاتية التجميع التي تتشكل في أشكال كروية لتقليل الطاقة الحرة جيب. في حالة تسليم المخدرات ، تكون الهياكل الأكثر استطالة مفيدة. هذا البروتوكول يضع أساليب لخلق المزيد من البوليمرات مثل قضيب، مع نسب العرض إلى الارتفاع ممدود، وذلك باستخدام الملح للحث على الضغط التناضح وتقليل أحجام الحويكل الداخلية.

Abstract

البوليمرات هي غشاء ملزمة، vesicles ثنائية الطبقات التي تم إنشاؤها من copolymers كتلة amphiphilic التي يمكن أن تغلف كل من الحمولات الكارهة للماء والمائية لتطبيقات تسليم المخدرات. على الرغم من وعدهم ، فإن البوليمرات محدودة التطبيق بسبب شكلها الكروي ، والتي لا يتم تناولها بسهولة من قبل الخلايا ، كما يتضح من علماء الجسيمات النانوية الصلبة. توضح هذه المقالة طريقة تعتمد على الملح لزيادة نسب العرض إلى الارتفاع من البولي كروي (الإيثيلين غليكول) (PEG) - البوليمرات القائمة. يمكن لهذه الطريقة استطالة البوليمرات والتحكم في نهاية المطاف في شكلها النهائي عن طريق إضافة كلوريد الصوديوم في غسيل الكلى بعد التشكيل. يمكن أن يكون تركيز الملح متنوعا ، كما هو موضح في هذه الطريقة ، استنادا إلى رهاب الماء من كوبوليمر الكتلة المستخدمة كقاعدة للبوليمروم والشكل المستهدف. الجسيمات النانوية ممدود لديها القدرة على استهداف أفضل بطانة الرحم في الأوعية الدموية قطرها أكبر، مثل الأوردة، حيث لوحظ الهامش. يمكن لهذا البروتوكول توسيع تطبيقات الجسيمات النانوية العلاجية من خلال استخدام تقنيات الاستطالة جنبا إلى جنب مع الفوائد المزدوجة التحميل ، التي تدور منذ فترة طويلة من البوليمرات.

Introduction

تشكيل الشكل هو وسيلة جديدة نسبيا وفعالة لتحسين تسليم الأدوية بوساطة الجسيمات النانوية. ليس فقط التغيير في مورفولوجيا زيادة مساحة سطح الجسيمات، والذي بدوره يسمح بقدرة حمل أكبر، ولكن أيضا له آثار في جميع المجالات لتحسين الاستقرار، ووقت الدورة الدموية، والتوافر البيولوجي، والاستهداف الجزيئي، وإطلاق سراح تسيطر عليها¹. البوليمرات، الجسيمات النانوية للتركيز في هذه الطريقة، تميل إلى التجمع الذاتي الحراري في شكل كروي، والتي ثبت أن تكون غير عملية في امتصاص الخلوية ويتم الكشف عنها بسهولة أكبر في الجهاز المناعي كجسم غريب. أن تكون قادرة على استطالة الهيكل في prolate أو قضيب سوف تسمح للناقل المخدرات للتهرب من الضامة عن طريق محاكاة الخلايا الأصلية وتسليم أكثر نجاحا إلى الهدف المطلوب^2،3،^4،5،6،7. يتم الحفاظ على الفوائد الكبيرة للبوليمرات ، بما في ذلك حماية الحمولات المقيدة بالغشاء ، واستجابة المحفزات للغشاء ، والتغليف المزدوج للأدوية المائية والمائية^8و9و10، التي تجعلها مرشحة قوية لتوصيل الأدوية أثناء تعديل الشكل.

هناك العديد من الطرق المختلفة في تحوير أشكال البوليمرات ، ويأتي كل منها مع مزاياه وعيوبه. ومع ذلك ، فإن معظم هذه الطرق تنقسم إلى فئتين: تغيير الضغط التناضحي المدفوع بالمذيبات والمدفوع بالملح^11. يهدف كلا النهجين إلى التغلب على الطاقة المنحنية الموجودة بعد تشكيل البوليمرات في شكل توازن كروي. من خلال إدخال تدرج الضغط التناضحي ، يمكن إجبار البوليمرات على الانحناء في هياكل ممدودة على الرغم من طاقات الانحناء^{القوية 11،12}.

طريقة المذيبات على أساس يستكشف تغيير الشكل مستوحاة من عمل كيم وفان هيست¹³. أنها البلاستيك البوليمرات في المذيبات العضوية وخليط الماء لاعتراض المذيبات العضوية في غشاء الحويصلة ودفع المياه من جوهر الحويصلة. في نهاية المطاف ، فإن الحجم الداخلي للجسيمات منخفض للغاية لدرجة أنه يطيل. وفي حين أن هذه الطريقة قد أظهرت وعدا، فإنها تفتقر إلى التطبيق العملي. تتطلب هذه الطريقة مذيبات مختلفة لكل عمود فقري بوليمري فردي يشارك في التشكيل. لذلك، فإنه لا ينطبق على نطاق واسع لتعزيز تغيير الشكل. على العكس من ذلك ، فإن الطريقة القائمة على الملح موحدة وتستخدم محركا عالميا واحدا يمكنه إدخال الضغط التناضحي للعديد من البوليمرات المستندة إلى كوبوليمر.

يستخدم هذا المشروع الطريقة القائمة على الملح التي أدخلتها L'Amoreaux وآخرون¹⁴. يتضمن هذا البروتوكول جولتين من غسيل الكلى. واحد يهدف إلى تنقية وترسيخ البولي (الإيثيلين غليكول) - ب بولي (حمض اللبنيك) (PEG - PLA) البوليمرات عن طريق إزالة المذيبات العضوية التي قد حصلت المحاصرين في طبقة ثنائية أثناء الإنتاج ، واحد أن يعزز تغيير الشكل. تقدم الخطوة الثانية لغسيل الكلى حلا 50 mM NaCl الذي يخلق تدرج ضغط تناضحي لدفع تغيير الشكل. ويدعم هذا الأسلوب من قبل سالفا وآخرون، الذين يلاحظون أن الإجهاد فرط التوتر في حل سوف يسبب الحوييلة لتقليص¹⁵. تعتمد هذه الطريقة على طريقة منشورة سابقا¹⁴ تبحث في بوليمرين مختلفين قائمين على البوليستر وتدرجات ملح مختلفة من 50-200 مليون م. وتستخدم البوليسترات بسبب عدم توافقها البيولوجي والتحلل البيولوجي. تدرج الملح له آثار متفاوتة على الشكل اعتمادا على رهاب الماء من العمود الفقري copolymer كتلة. ويمكن استخدامه لإنشاء prolates، قضبان، وstomatocytes. وقد تم اختيار هذه الطريقة التي يحركها الملح بسبب سهولة النسخ المتماثل وبراعة التجريبية.

Protocol

1. تشكيل البوليمر كروية باستخدام طريقة حقن المذيبات

1. حل البوليستر في المذيبات العضوية
   ملاحظة: يجب أن يذوب البوليستر واحد فقط في المذيبات العضوية الخاصة به في وقت واحد لتشكيل البوليمرات.
   1. حل البوليستر PEG-PLA أو PEG-b-poly (حمض اللاكتيك-الجليكوليك) (PEG-PLGA) في ثنائي ميثيل سلفوإكسيد (DMSO) بتركيز 1.5٪ وزن. على وجه التحديد، حل 0.015 غرام من البوليستر مختارة في 1 مل من DMSO (15 ملغم / مل). قد يتطلب الانحلال الكامل للبوليمر فترات تصل إلى 15 دقيقة من الدوامة.
2. في حين أن البوليستر يذوب في المذيبات العضوية ، قم بإعداد جهاز حقن المذيبات وفقا للشخصية 1.
   1. ضع لوحة تحريك مباشرة تحت مضخة الحقنة الرأسية. ضع قارورة زجاجية سعة 5 مل مع 1 مل من الماء deionized Type II وشريط تحريك مصغر على لوحة التقليب.
   2. ضبط ارتفاع مضخة حقنة للسماح لطرف الإبرة لتكون مغمورة بالكامل في نوع الثاني المياه deionized.
   3. تعيين معدل التسريب من مضخة حقنة إلى 5 ميكرولتر / دقيقة.
      ملاحظة: إذا تم استخدام مضخة حقنة صغيرة الحجم، يمكن إعداد المحول الذي يحمل المحاقن على حامل حلقي. إذا تم استخدام مضخة حقنة كبيرة الحجم، يمكن وضع المضخة عموديا على مقبس المختبر لضبط الارتفاع.
3. قم بإجراء حقن المذيبات عن طريق رسم المذيب العضوي وحل البوليستر (الخطوة 1.1.1) في إبرة 27 G بطول إبرة 1/2 بوصة.
   1. ضع الإبرة في مضخة الحقن وتأكد من أنها آمنة تماما. ضبط كتلة دفع للمس نهاية المكبس حقنة.
   2. بدء لوحة اثارة بحيث يتم الغزل الماء في 100 دورة في الدقيقة، ومن ثم بدء مضخة حقنة.
4. بمجرد أن غرست مضخة الحقنة بالكامل المذيبات العضوية والبوليمر في الماء المثير ، قم بإزالة من شريط التقليب وسقف القارورة الزجاجية.
5. تميز البوليمرات عبر تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
   1. خذ 1 مل من الماء، الآن مع نسبة صغيرة من المذيبات العضوية والبوليمر، ووضعها في 1 مل cuvette.
   2. باستخدام الإعدادات من الجدول 1، قم بإجراء DLS عن طريق وضع cuvette 1 مل في النظام وإعداد التشغيل. قراءة وجمع البوليمر كثافة مرجح قطر ومؤشر تعدد الأضلاع (PDI).
      ملاحظة: يعمل cuvette البلاستيك بشكل جيد في هذه الحالة، كما كمية المذيبات العضوية منخفضة جدا. ومع ذلك، سوف cuvette الزجاج تعمل كذلك إذا وجدت أي مخاوف.
6. تأكيد تشكيل البوليمر كروي باستخدام المجهر الإلكترون الإرسال (TEM) والمسح المجهري الإلكتروني (SEM).
   1. تحسين بروتوكولات TEM و SEM استنادا إلى المعدات المتوفرة. تم الحصول على النتائج التمثيلية في 120 كيلو فولت في TEM و 5.0 كيلو فولت في SEM.
   2. إذا كانت البوليمرات غير مرئية باستخدام EM، وتطبيق خلات أورانيل وصمة عار الخلفية.
      ملاحظة: يمكن العثور على تفاصيل عن التصوير TEM و SEM لتعديل شكل البوليستر القائم على البوليمرات في المرجع¹⁴. وترد تفاصيل المعلومات المتعلقة بتقنيات المجهر الإلكتروني للجسيمات النانوية الناعمة في المرجع^16.

2. غسيل الكلى لإزالة المذيبات العضوية

1. غسل غشاء غسيل الكلى 300 كيلودا وفقا للبروتوكولات التي تقدمها الشركة المصنعة.
2. إضافة 1 مل من محلول البوليمر في خزان جهاز غسيل الكلى.
3. ضع جهاز غسيل الكلى في كوب سعة 250 مل مع 150 مل من الماء deionized Type II على لوحة تحريك. تعيين لوحة اثارة لسرعة تسمح للحركة لطيف من جهاز غسيل الكلى وترك لتحريك بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: إذا تم تشكيل دوامة أثناء غسيل الكلى، يجب تقليل السرعة.
4. بعد الانتهاء من غسيل الكلى، استخرج محلول البوليمرات 1 مل من جهاز غسيل الكلى. تميز محلول البوليمر، بعد الخطوة 1.5.
   ملاحظة: جمع هذه المعلومات ذات الصلة لتحديد نجاح بروتوكول تعديل الشكل، كما ينبغي للمرء أن يكون قادرا على تحديد زيادة في PDI إذا كان قد تم ممدود البوليمر.

3. غسيل الكلى ضد تدرجات الملح

1. إنشاء 150 مل من العازلة الملح المطلوب، مع إما 50 mM، 100 mM، أو 200 mM تركيز كلوريد الصوديوم على أساس خصائص البوليمر النهائي المطلوب. بشكل عام، زيادة تركيز الملح يؤدي إلى زيادة استطالة البوليمر.
2. خذ محلول البوليمر الذي تم الاتصال به وتميز به وإعادة وضعه في جهاز غسيل الكلى. ضع جهاز غسيل الكلى المحمل في 150 مل من محلول الملح المطلوب واتركه يحرك برفق لمدة 18 ساعة.
   ملاحظة: يمكن تخزين البوليمرات المعدلة الشكل والحفاظ على شكلها في حل متساوي التوتر لفترات تصل إلى 7 أيام.

4. شكل توصيف البوليمرات المعدلة

1. بعد تعديل الشكل، قم بإجراء توصيف بوليمري عبر DLS و TEM و SEM. إذا كانت البوليمرات غير مرئية باستخدام EM، وتطبيق خلات أورانيل وصمة عار الخلفية.
2. إجراء قياسات DLS كما هو موضح في الخطوة 1.5، مع إيلاء اهتمام خاص لقياسات PDI مقارنة بالبوليمرات الكروية، حيث يشير تغيير في PDI إلى تغيير فعال في الشكل في البوليمرات.
3. ضمان استخدام الضوابط المناسبة للتصوير، وخاصة البوليمرات غير الشكلية المعدلة، لضمان نجاح هذه الطريقة.

النتائج

ويعرض الجدول 2 النتائج المتوقعة عند اتباع الخطوة 1 من البروتوكول. لاحظ أن DMSO يستخدم كمذيب لكل من PEG-PLA و PEG-PLGA في تشكيل البوليمرات. الانحراف عن هذا المذيب ممكن، كما المذيبات الأخرى المياه miscible سوف تذوب copolymers ولكن من المتوقع أن تغير النتائج. ومن المتوقع أن يكون مؤشر أسعار الديسي أقل من...

Discussion

ومن المعروف أن النظم ذاتية التجميع لا يمكن السيطرة عليها. خصائصها النهائية، بما في ذلك الحجم والشكل والهيكل، مدفوعة بخصائص الأمفيفيلية المختارة الكارهة للماء والبيئة المذيبة المختارة. تميل الكوبوليمرات الكتلية amphiphilic إلى الأشكال الكروية ، مما يقلل من الطاقة الحرة لجيب ويؤدي إلى التوازن...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern