Forma modulante di polimerisomi a base di poliestere utilizzando la pressione osmotica

Riepilogo

I polimerici sono vescicole polimeriche autoassemblate che si formano in forme sferiche per ridurre al minimo l'energia libera di Gibb. Nel caso della somministrazione di farmaci, le strutture più allungate sono utili. Questo protocollo stabilisce metodi per creare più polimerisomi simili a barre, con proporzioni allungate, utilizzando il sale per indurre la pressione osmotica e ridurre i volumi delle vescicole interne.

Abstract

I polimerici sono vescicole a doppio strato legate alla membrana create da copolimeri a blocchi anfifilici che possono incapsulare carichi utili sia idrofobici che idrofili per applicazioni di somministrazione di farmaci. Nonostante la loro promessa, i polimeri sono limitati nell'applicazione a causa della loro forma sferica, che non è prontamente assorbita dalle cellule, come dimostrato dagli scienziati delle nanoparticelle solide. Questo articolo descrive un metodo a base di sale per aumentare le proporzioni dei polimeromi sferici a base di poli(glicole etilenico) (PEG). Questo metodo può allungare i polimerisomi e, infine, controllare la loro forma finale aggiungendo cloruro di sodio nella dialisi post-formazione. La concentrazione di sale può essere variata, come descritto in questo metodo, in base all'idrofobicità del copolimero a blocchi utilizzato come base per il polimero e la forma bersaglio. Le nanoparticelle allungate hanno il potenziale per indirizzare meglio l'endotelio nei vasi sanguigni di diametro maggiore, come le vene, dove si osserva la marginazione. Questo protocollo può espandere le applicazioni terapeutiche delle nanoparticelle utilizzando tecniche di allungamento in tandem con i benefici a doppio carico e a lunga circolazione dei polimerisomi.

Introduzione

La modulazione della forma è un modo relativamente nuovo ed efficiente per migliorare la somministrazione di farmaci mediata da nanoparticelle. Non solo il cambiamento nella morfologia aumenta la superficie delle particelle, che a sua volta consente una maggiore capacità di carico, ma ha anche implicazioni su tutta la linea per migliorare la stabilità, il tempo di circolazione, la biodisponibilità, il targeting molecolare e il rilascio controllato¹. I polimerisomi, la nanoparticella di messa a fuoco in questo metodo, tendono ad auto-assemblarsi termodinamicamente in una forma sferica, che si è dimostrata poco pratica nell'assorbimento cellulare ed è più facilmente rilevabile nel sistema immunitario come corpo estraneo. Essere in grado di allungare la struttura in un prolato o in un'asta consentirà al portatore di farmaci di eludere i macrofagi imitando le cellule native e consegnare con maggiore successo al loro target desiderato^2,3,4,5,6,7. I vantaggi significativi dei polimerisomi, tra cui la protezione legata alla membrana dei carichi utili, la reattività agli stimoli della membrana e il doppio incapsulamento dei farmaci idrofili e idrofobici^8,9,10,che li rendono forti candidati per la somministrazione di farmaci vengono mantenuti durante la modulazione della forma.

Esistono molti metodi diversi per modulare le forme dei polimerisomi e ognuno presenta i rispettivi vantaggi e svantaggi. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi rientra in due categorie: variazione di pressione osmotica guidata da solvente e da sale¹¹. Entrambi gli approcci mirano a superare l'energia di flessione presente dopo che i polimerisomi si sono formati in una forma di equilibrio sferico. Introducendo un gradiente di pressione osmotica, i polimerisomi possono essere costretti a piegarsi in strutture allungate nonostante le forti energie di flessione^11,12.

Il metodo a base di solventi esplora il cambiamento di forma ispirato al lavoro di Kim e van Hest¹³. Hanno plastificato i polimerisomi in una miscela organica di solvente e acqua per intrappolare i solventi organici nella membrana della vescicola e guidare l'acqua fuori dal nucleo della vescicola. Alla fine, il volume interno della particella è così basso che si allunga. Mentre questo metodo ha mostrato promesse, manca di praticità. Questo metodo richiede solventi diversi per ogni singola spina dorsale polimerica coinvolta nella modulazione. Pertanto, non è ampiamente applicabile per promuovere il cambiamento di forma. Al contrario, il metodo a base di sale è uniforme e utilizza un driver universale che può introdurre pressione osmotica a molti polimerisomi a base di copolimeri a blocchi.

Questo progetto utilizza il metodo a base di sale introdotto da L'Amoreaux et al¹⁴. Questo protocollo prevede due cicli di dialisi. Uno mira a purificare e solidificare i polimeromi poli(glicole etilenico)-b-poli(acido lattico) (PEG-PLA) rimuovendo il solvente organico che potrebbe essere rimasto intrappolato nel doppio strato durante la produzione e uno che promuove il cambiamento di forma. La seconda fase di dialisi introduce una soluzione NaCl da 50 mM che crea un gradiente di pressione osmotica per guidare il cambiamento di forma. Questo metodo è supportato da Salva et al., che notano che lo stress ipertonico in una soluzione causerà la riduzione della vescicola¹⁵. Questo metodo si basa su un metodo precedentemente pubblicato¹⁴ che esamina due diversi polimerisomi a base di poliestere e vari gradienti salini da 50-200 mM NaCl. I poliesteri sono utilizzati grazie alla loro biocompatibilità e biodegradazione. Il gradiente salino ha effetti variabili sulla forma a seconda dell'idrofobicità della spina dorsale del copolimero a blocchi. Può essere usato per creare prolati, bastoncelli e stomatociti. Questo metodo guidato dal sale è stato scelto per la facilità di replica e la versatilità sperimentale.

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Protocollo

1. Formazione di polimerismi sferici utilizzando un metodo di iniezione di solvente

1. Dissoluzione di poliesteri in solvente organico
   NOTA: Un solo poliestere deve essere sciolto nel rispettivo solvente organico alla volta per formare polimerici.
   1. Sciogliere i poliesteri PEG-PLA o PEG-b-poly (acido lattico-co-glicolico) (PEG-PLGA) in dimetilsolfossido (DMSO) ad una concentrazione dell'1,5% in peso. In particolare, sciogliere 0,015 g di poliestere selezionato in 1 mL di DMSO (15 mg/mL). La completa dissoluzione del polimero può richiedere periodi fino a 15 minuti di vortice.
2. Mentre il poliestere si dissolve in solvente organico, impostare l'apparato di iniezione del solvente secondo la Figura 1.
   1. Posizionare una piastra di agitazione direttamente sotto la pompa a siringa verticale. Posizionare un flaconcino di vetro da 5 ml con 1 mL di acqua deionizzata di tipo II e una barra di agitazione in miniatura sulla piastra di agitazione.
   2. Regolare l'altezza della pompa della siringa per consentire alla punta dell'ago di essere completamente immersa in acqua deionizzata di tipo II.
   3. Impostare la velocità di infusione della pompa della siringa a 5 μL/min.
      NOTA: se si utilizza una pompa a siringa di piccolo volume, l'adattatore con la siringa può essere impostato su un supporto ad anello. Se si utilizza una pompa a siringa di grande volume, la pompa può essere posizionata verticalmente su un jack da laboratorio per regolare l'altezza.
3. Eseguire l'iniezione di solvente trafilando il solvente organico e la soluzione di poliestere (punto 1.1.1) in un ago da 27 G con una lunghezza dell'ago di 1/2".
   1. Posizionare l'ago nella pompa della siringa e assicurarsi che sia completamente sicuro. Regolare il blocco di spinta per toccare l'estremità dello stantuffo della siringa.
   2. Avviare la piastra di agitazione in modo che l'acqua stia ruotando a 100 giri / min, quindi avviare la pompa della siringa.
4. Una volta che la pompa della siringa ha completamente infuso il solvente organico e il polimero nell'acqua di agitazione, rimuovere dalla barra di agitazione e tappare il flaconcino di vetro.
5. Caratterizzare i polimerisomi tramite la diffusione dinamica della luce (DLS).
   1. Prendi 1 mL di acqua, ora con una piccola percentuale di solvente organico e polimero, e metti in una cuvetta da 1 mL.
   2. Utilizzando le impostazioni della Tabella 1, eseguire DLS posizionando una cuvetta da 1 mL nel sistema e impostando l'esecuzione. Leggere e raccogliere il diametro ponderato per intensità del polimero e l'indice di polidispersità (PDI).
      NOTA: Una cuvetta di plastica funziona bene in questo caso, poiché la quantità di solvente organico è molto bassa. Tuttavia, una cuvetta di vetro funzionerà anche se esistono preoccupazioni.
6. Confermare la formazione di polimerismi sferici utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e la microscopia elettronica a scansione (SEM).
   1. Ottimizza i protocolli TEM e SEM in base alle apparecchiature disponibili. Risultati rappresentativi sono stati ottenuti a 120 kV nel TEM e 5,0 kV nel SEM.
   2. Se i polimerisomi non sono visibili usando EM, applicare l'acetato di uranile come macchia di fondo.
      NOTA: I dettagli sull'imaging TEM e SEM per la modulazione della forma dei polimerisomi a base di poliestere sono disponibili nel riferimento¹⁴. Le informazioni sulle tecniche di microscopia elettronica per le nanoparticelle molli sono dettagliate nel riferimento¹⁶.

2. Dialisi per rimuovere il solvente organico

1. Lavare una membrana per dialisi da 300 kDa secondo i protocolli forniti dal produttore.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione polimerica nel serbatoio del dispositivo di dialisi.
3. Posizionare il dispositivo di dialisi in un becher da 250 mL con 150 mL di acqua deionizzata di tipo II su una piastra di agitazione. Impostare la piastra di agitazione a una velocità che consenta un movimento delicato del dispositivo di dialisi e lasciare mescolare durante la notte.
   NOTA: Se durante la dialisi si forma un vortice, la velocità deve essere ridotta.
4. Al termine della dialisi, estrarre la soluzione polimerica da 1 mL dal dispositivo di dialisi. Caratterizzare la soluzione polimerica, seguendo il passaggio 1.5.
   NOTA: La raccolta di queste informazioni è rilevante per determinare il successo del protocollo di modulazione della forma, in quanto si dovrebbe essere in grado di identificare un aumento della PDI se il polimeroma è stato allungato.

3. Dialisi contro i gradienti salini

1. Creare 150 mL di tampone salino desiderato, con una concentrazione di 50 mM, 100 mM o 200 mM di cloruro di sodio in base alle proprietà finali del polimero desiderato. In generale, l'aumento della concentrazione di sale porta ad un aumento dell'allungamento dei polimeri.
2. Prendere la soluzione polimerica che è stata dializzata e caratterizzata e reinserire nel dispositivo di dialisi. Posizionare il dispositivo di dialisi caricato in 150 ml della soluzione salina desiderata e lasciare mescolare delicatamente per 18 ore.
   NOTA: i polimerisomi modulati in forma possono essere conservati e mantenere la loro forma in una soluzione isotonica per periodi fino a 7 giorni.

4. Caratterizzazione del polimeroma modulato dalla forma

1. Dopo la modulazione della forma, eseguire la caratterizzazione dei polimerismi tramite DLS, TEM e SEM. Se i polimerisomi non sono visibili usando EM, applicare l'acetato di uranile come macchia di fondo.
2. Eseguire misurazioni DLS come descritto nella fase 1.5, prestando particolare attenzione alle misurazioni PDI rispetto ai polimerismi sferici, poiché un cambiamento nella PDI suggerisce un efficace cambiamento di forma nei polimerisomi.
3. Garantire l'uso di controlli appropriati per l'imaging, in particolare i polimerisomi modulati non di forma, per garantire il successo del metodo.

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Risultati

La Tabella 2 presenta i risultati attesi quando si segue il passaggio 1 del protocollo. Si noti che DMSO è usato come solvente sia per PEG-PLA che per PEG-PLGA nella formazione di polimerisomi. La deviazione da questo solvente è possibile, poiché altri solventi miscibili in acqua dissolveranno i copolimeri ma si prevede che cambino i risultati. Si prevede che la PDI sarà inferiore a 0,2, indicando la formazione di polimerisomi monodispersi¹⁷. Si noti che l'aumento dell'idrofob...

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Discussione

I sistemi autoassemblati sono notoriamente incontrollabili. Le loro proprietà finali, tra cui dimensioni, forma e struttura, sono guidate dalle proprietà idrofobiche dell'anfifilo scelto e dall'ambiente solvente selezionato. I copolimeri a blocchi anfifilici tendono verso forme sferiche, che minimizzano l'energia libera di Gibb e portano all'equilibrio termodinamico²³, formando così polimerisomi. A causa della loro natura di equilibrio, i polimerisomi sono significativamente più difficili da a...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern