Forma modulada de poliéster baseado em polimeroses usando pressão osmótica

Resumo

Polímeros são vesículas poliméricas auto-montadas que são formadas em formas esféricas para minimizar a Energia Livre de Gibb. No caso da entrega de medicamentos, estruturas mais alongadas são benéficas. Este protocolo estabelece métodos para criar mais polímeros parecidos com varas, com proporções alongadas, usando sal para induzir pressão osmótica e reduzir os volumes de vesículas internas.

Resumo

Os polímeros são vesículas bicamadas ligadas à membrana criadas a partir de copolímeros de blocos anfílicos que podem encapsular cargas hidrofóbicas e hidrofílicas para aplicações de entrega de medicamentos. Apesar de sua promessa, os polímeros são limitados em aplicação devido à sua forma esférica, que não é prontamente ocupada pelas células, como demonstrado pelos cientistas de nanopartículas sólidas. Este artigo descreve um método à base de sal para aumentar as proporções de poliglicol esférico (etileno glicol) (PEG)- polímeros à base de PEG. Este método pode alongar polímeros e, finalmente, controlar sua forma final adicionando cloreto de sódio na diálise pós-formação. A concentração de sal pode ser variada, como descrito neste método, com base na hidroofobidade do copolímero do bloco sendo usado como base para o polímero e a forma alvo. As nanopartículas alongadas têm o potencial de direcionar melhor o endotélio em vasos sanguíneos de maior diâmetro, como veias, onde a margem é observada. Este protocolo pode expandir as aplicações de nanopartículas terapêuticas utilizando técnicas de alongamento em conjunto com os benefícios de carregamento duplo e de longa circulação de polimerosos.

Introdução

A modulação da forma é uma maneira relativamente nova e eficiente de melhorar a entrega de drogas mediadas por nanopartículas. Não só a mudança na morfologia aumenta a área superficial das partículas, o que, por sua vez, permite uma maior capacidade de transporte, mas também tem implicações em toda a placa para melhorar a estabilidade, o tempo de circulação, a biodisponibilidade, a segmentação molecular e a liberação controlada¹. Polímeros, a nanopartícula de foco neste método, tendem a se auto-montar termodinamicamente em uma forma esférica, que provou ser impraticável na absorção celular e é mais facilmente detectada no sistema imunológico como um corpo estranho. Ser capaz de alongar a estrutura em um prolato ou uma vara permitirá que o portador de drogas evite macrófagos imitando células nativas e entregue com mais sucesso ao alvo desejado^2,3,4,5,6,7. Os benefícios significativos dos polimerosos, incluindo proteção ligada à membrana de cargas, resposta a estímulos da membrana e encapsulamento duplo de drogas hidrofílicas e hidrofóbicas^8,9,10, que os tornam fortes candidatos à entrega de medicamentos são mantidos durante a modulação da forma.

Existem muitos métodos diferentes na modulação das formas dos polímeros, e cada um vem com suas respectivas vantagens e desvantagens. No entanto, a maioria desses métodos se enquadra em duas categorias: mudança de pressão osmótica orientada por solventes e salgada¹¹. Ambas as abordagens visam superar a energia de dobra presente após polimerosos serem formados em uma forma de equilíbrio esférico. Ao introduzir um gradiente de pressão osmótica, os polímeros podem ser forçados a se curvar em estruturas alongadas, apesar das fortes energias de dobra^11,12.

O método baseado em solventes explora a mudança de forma inspirada no trabalho de Kim e van Hest¹³. Eles plastificaram polímeros em uma mistura orgânica de solvente e água para prender os solventes orgânicos na membrana vesícula e expulsar a água do núcleo vesícula. Eventualmente, o volume interno da partícula é tão baixo que se alonga. Embora este método tenha se mostrado promissor, falta praticidade. Este método requer diferentes solventes para cada espinha dorsal polimérica individual envolvida na modulação. Portanto, não é amplamente aplicável promover a mudança de forma. Por outro lado, o método à base de sal é uniforme e utiliza um driver universal que pode introduzir pressão osmótica em muitos polímeros à base de copolímeros.

Este projeto utiliza o método à base de sal introduzido por L'Amoreaux et al¹⁴. Este protocolo envolve duas rodadas de diálise. Um deles visa purificar e solidificar polímeros poli (etileno glicol)-b-poly(ácido láctico) (PEG-PLA) removendo solventes orgânicos que podem ter ficado presos na bicamada durante a produção, e um que promove a mudança de forma. A segunda etapa de diálise introduz uma solução NaCl de 50 mM que cria um gradiente de pressão osmótica para conduzir a mudança de forma. Este método é suportado por Salva et al., que observam que o estresse hipertônico em uma solução fará com que a vesícula encolha¹⁵. Este método baseia-se em um método publicado anteriormente¹⁴ olhando para dois polimerosos diferentes à base de poliéster e vários gradientes de sal de 50-200 mM NaCl. Os poliésteres são usados devido à sua biocompatibilidade e biodegradação. O gradiente de sal tem efeitos variados na forma, dependendo da hidroofobidade da espinha dorsal copolímero do bloco. Pode ser usado para criar prolatos, hastes e estomatócitos. Este método movido a sal foi escolhido devido à facilidade de replicação e versatilidade experimental.

Protocolo

1. Formação polímero esférica usando um método de injeção de solvente

1. Dissolução de poliésteres em solvente orgânico
   NOTA: Apenas um poliéster deve ser dissolvido em seu respectivo solvente orgânico de cada vez para formar polímeros.
   1. Dissolver poliésteres PEG-PLA ou PEG-b-poly (ácido láctico-coglicólico) (PEG-PLGA) em sulfóxido de dimetila (DMSO) com uma concentração de 1,5% de peso. Especificamente, dissolva 0,015 g de poliéster selecionado em 1 mL de DMSO (15 mg/mL). A dissolução total do polímero pode exigir períodos de até 15 minutos de vórtice.
2. Enquanto o poliéster está se dissolvendo em solvente orgânico, configure o aparelho de injeção de solvente de acordo com a Figura 1.
   1. Coloque uma placa de mexida diretamente abaixo da bomba de seringa vertical. Coloque um frasco de vidro de 5 mL com 1 mL de água desionizada tipo II e uma barra de mexida em miniatura na placa de mexida.
   2. Ajuste a altura da bomba de seringa para permitir que a ponta da agulha esteja totalmente imersa na água desionizada tipo II.
   3. Coloque a taxa de infusão da bomba de seringa em 5 μL/min.
      NOTA: Se uma pequena bomba de seringa de volume for usada, o adaptador com a seringa pode ser configurado em um suporte de anel. Se for usada uma bomba de seringa de grande volume, a bomba pode ser colocada verticalmente em uma tomada de laboratório para ajustar a altura.
3. Realize a injeção de solvente desenhando a solução orgânica de solvente e poliéster (passo 1.1.1) em uma agulha de 27 G com um comprimento de agulha de 1/2".
   1. Coloque a agulha na bomba de seringa e certifique-se de que ela está totalmente segura. Ajuste o bloco de empurrador para tocar na extremidade do êmbolo da seringa.
   2. Inicie a placa de mexida para que a água esteja girando a 100 rpm e, em seguida, inicie a bomba de seringa.
4. Uma vez que a bomba de seringa tenha infundido totalmente o solvente orgânico e o polímero na água de agitação, retire da barra de agitação e tampe o frasco de vidro.
5. Caracterize os polímeros através de dispersão dinâmica de luz (DLS).
   1. Tome 1 mL de água, agora com uma pequena porcentagem de solvente orgânico e polímero, e coloque em um cuvette de 1 mL.
   2. Usando as configurações da Tabela 1,execute dLS colocando um cuvette de 1 mL no sistema e configure a execução. Leia e colete o diâmetro ponderado pela intensidade polímera e o índice de polidispersidade (PDI).
      NOTA: Um cuvette plástico funciona bem neste caso, pois a quantidade de solvente orgânico é muito baixa. No entanto, uma cuvette de vidro funcionará também se houver alguma preocupação.
6. Confirme a formação de polímeros esféricos utilizando microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e Microscopia eletrônica de varredura (SEM).
   1. Otimize os protocolos TEM e SEM com base nos equipamentos disponíveis. Os resultados representativos foram obtidos a 120 kV no TEM e 5,0 kV no SEM.
   2. Se os polímeros não forem visíveis usando EM, aplique acetato de urano como uma mancha de fundo.
      NOTA: Detalhes sobre imagens TEM e SEM para a modulação da forma de poliéster à base de polimeroses podem ser encontrados na referência¹⁴. As informações sobre técnicas de microscopia eletrônica para nanopartículas macias são detalhadas na referência¹⁶.

2. Diálise para remover solvente orgânico

1. Lave uma membrana de diálise de 300 kDa de acordo com os protocolos fornecidos pelo fabricante.
2. Adicione 1 mL de solução polímera no reservatório do dispositivo de diálise.
3. Coloque o dispositivo de diálise em um béquer de 250 mL com 150 mL de água deionizada tipo II em uma placa de mexida. Coloque a placa de mexida a uma velocidade que permita o movimento suave do dispositivo de diálise e deixe mexer durante a noite.
   NOTA: Se um vórtice for formado durante a diálise, a velocidade precisa ser diminuída.
4. Após a conclusão da diálise, extraia a solução de polímero de 1 mL do dispositivo de diálise. Caracterize a solução polímero, seguindo o passo 1.5.
   NOTA: A coleta dessas informações é relevante para determinar o sucesso do protocolo de modulação de formas, pois deve-se identificar um aumento no PDI se o polímero tiver sido alongado.

3. Diálise contra gradientes de sal

1. Crie 150 mL de tampão de sal desejado, com concentração de 50 mM, 100 mM ou 200 mM de cloreto de sódio com base nas propriedades de polímero desejadas. Em geral, o aumento da concentração de sal leva ao aumento do alongamento do polímero.
2. Pegue a solução polímera que foi dialisada e caracterizada e recônco no dispositivo de diálise. Coloque o dispositivo de diálise carregado em 150 mL da solução de sal desejada e deixe mexer suavemente por 18h.
   NOTA: Polímeros modulados por forma podem ser armazenados e manter sua forma em uma solução isotônica por períodos de até 7 dias.

4. Caracterização de polímero modulado de forma

1. Após a modulação da forma, realize a caracterização de polímeros via DLS, TEM e SEM. Se os polímeros não forem visíveis usando EM, aplique acetato de urano como uma mancha de fundo.
2. Realizar medições de DLS conforme descrito na etapa 1.5, prestando especial atenção às medições de PDI em comparação com polímeros esféricos, pois uma mudança no PDI sugere uma mudança efetiva de forma nos polímeros.
3. Certifique-se do uso de controles apropriados para imagens, especialmente polímeros modulados não-forma, para garantir o sucesso do método.

Resultados

A Tabela 2 apresenta os resultados esperados ao seguir o protocolo passo 1. Observe que o DMSO é usado como solvente tanto para PEG-PLA quanto para PEG-PLGA na formação de polímeros. O desvio deste solvente é possível, pois outros solventes miscíveis da água dissolverão os copolímeros, mas espera-se que mudem os resultados. Espera-se que o PDI seja inferior a 0,2, indicando a formação de polímeros monodisperses¹⁷. Note que o aumento da hidroofobidade leva ao aumento d...

Discussão

Sistemas auto-montados são notoriamente incontroláveis. Suas propriedades finais, incluindo tamanho, forma e estrutura, são impulsionadas pelas propriedades hidrofóbicas do anfífilo escolhido e pelo ambiente solvente selecionado. Copolímeros de blocos anfílicos tendem a formas esféricas, o que minimiza a energia livre de Gibb e leva ao equilíbrio termodinâmico²³, formando polímeros. Devido à sua natureza de equilíbrio, os polímeros são significativamente mais desafiadores para along...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern