צורה מווסתת של פוליאסטר מבוסס פולימרומים באמצעות לחץ אוסמוטי

Summary

פולימרים הם שלטי פולימרים מורכבים בעצמם שנוצרים בצורות כדוריות כדי למזער את האנרגיה החופשית של גיב. במקרה של אספקת סמים, מבנים מוארכים יותר מועילים. פרוטוקול זה קובע שיטות ליצירת פולימרים דמויי מוט יותר, עם יחסי רוחב-גובה מוארכים, תוך שימוש במלח כדי לגרום ללחץ אוסמוטי ולהפחית את נפחי ההדבקה הפנימית.

Abstract

פולימרים הם שלפוחיות דו-שכבתיות קשורות לממברנה שנוצרו מקופולימרים של בלוק אמפיפילי שיכולים לתמצת הן מטענים הידרופוביים והן מטען הידרופילי עבור יישומי אספקת תרופות. למרות ההבטחה שלהם, פולימרומים מוגבלים ביישום בשל צורתם הכדורית, אשר אינו נלקח בקלות על ידי תאים, כפי שהוכח על ידי מדעני ננו-חלקיקים מוצקים. מאמר זה מתאר שיטה מבוססת מלח להגדלת יחסי הגובה-רוחב של פולין גליקול כדורי (אתילן גליקול) (PEG)- פולימרים מבוססי PEG. שיטה זו יכולה להאריך פולימרים ובסופו של דבר לשלוט בצורתם הסופית על ידי הוספת נתרן כלורי בדיאליזה שלאחר היווצרות. ריכוז מלח יכול להיות מגוון, כמתואר בשיטה זו, בהתבסס על ההידרופוביה של קופולימר הבלוק המשמש כבסיס לפולימרים ולצורת היעד. חלקיקים מוארכים יש פוטנציאל טוב יותר למקד את אנדותל בכלי דם בקוטר גדול יותר, כמו ורידים, שבו השוליים הוא ציין. פרוטוקול זה יכול להרחיב יישומי ננו-חלקיקים טיפוליים על ידי שימוש בטכניקות התארכות בד בבד עם היתרונות של טעינה כפולה, במחזור ארוך של פולימרים.

Introduction

אפנון צורה הוא דרך חדשה ויעילה יחסית לשפר את אספקת התרופות בתיווך הננו-חלקיקים. לא רק שהשינוי במורפולוגיה מגדיל את שטח הפנים של החלקיקים, אשר בתורו מאפשר יכולת נשיאה גדולה יותר, אלא שיש לו גם השלכות על פני הלוח כדי לשפר את היציבות, זמן זרימת הדם, הזמינות הביולוגית, פילוח מולקולרי, ושחרור מבוקר¹. פולימרומים, הננו-חלקיק של המיקוד בשיטה זו, נוטים להרכיב את עצמם באופן תרמודינמי לצורה כדורית, אשר הוכיחה את עצמה כבלתי מעשית בספיגה התאית ומזוהה בקלות רבה יותר במערכת החיסון כגוף זר. היכולת להאריך את המבנה לתוך פרולט או מוט תאפשר לנושא הסמים להתחמק מקרופאגים על ידי חיקוי תאים מקומיים ולספק בהצלחה רבה יותר ליעד הרצוי^{שלהם 2,3,4,5,6,7}. היתרונות המשמעותיים של פולימרים, כולל הגנה קשורה ממברנה של מטענים, גירוי-תגובה של הממברנה, אנקפסולציה כפולה של תרופות הידרופיליות הידרופוביות^8,9,10, שהופכים אותם למועמדים חזקים לאספקת סמים נשמרים במהלך אפנון צורה.

ישנן שיטות רבות ושונות באפנון הצורות של פולימרים, וכל אחת מהן מגיעה עם היתרונות והחסרונות שלה. עם זאת, רוב השיטות האלה מתחלקות לשתי קטגוריות: שינוי לחץ אוסמוטי מונחה ממס ומלח¹¹. שתי הגישות שואפות להתגבר על אנרגיית הכיפוף הקיימת לאחר שפולימרים נוצרים בצורת שיווי משקל כדורי. על ידי החדרת שיפוע לחץ אוסמוטי, ניתן לכפות על פולימרומים להתכופף למבנים מוארכים למרות אנרגיות כיפוף חזקות^11,12.

השיטה מבוססת הממס בוחנת שינוי צורה בהשראת עבודתם של קים ואן האסט¹³. הם הפלילו פולימרומים בתערובת ממס ומים אורגנית כדי ללכוד את הממסים האורגניים בקרום הלסת ולהוציא מים ולליבה הארסית. בסופו של דבר, הנפח הפנימי של החלקיק כל כך נמוך שהוא מהאריך את האריך את הספירה. בעוד שיטה זו הוכיחה הבטחה, היא חסרה מעשיות. שיטה זו דורשת ממיסים שונים עבור כל עמוד שדרה פולימרי בודד המעורב אפנון. לכן, אין זה ישים באופן נרחב לקדם שינוי צורה. לעומת זאת, השיטה מבוססת המלח היא אחידה ומשתמשת בנהג אוניברסלי אחד שיכול להכניס לחץ אוסמוטי לרבים חוסמים פולימרים מבוססי קופולימר.

פרויקט זה משתמש בשיטה מבוססת מלח שהוצגה על ידי L'Amoreaux ואח^'14. פרוטוקול זה כרוך בשני סבבים של דיאליזה. האחת שואפת לטהר ולגבש פולי (אתילן גליקול)-b-פולי (חומצה לקטית) (PEG-PLA) פולימרים על ידי הסרת ממס אורגני שאולי נלכד בשכבת הדו-שכבתית במהלך הייצור, ואחד שמקדם את שינוי הצורה. שלב הדיאליזה השני מציג פתרון NaCl של 50 מ"מ שיוצר מעבר צבע של לחץ אוסמוטי כדי להניע את שינוי הצורה. שיטה זו נתמכת על ידי Salva et al., אשר מציינים כי מתח היפרטוני בפתרון יגרום vesicle להתכווץ¹⁵. שיטה זו מתבססת על שיטה¹⁴ שפורסמה בעבר ומסתכלת על שני פולימרים שונים המבוססים על פוליאסטר ושיפועים שונים של מלח מ- NaCl 50-200 מ"מ. פוליאסטרים משמשים בשל תאימות ביולוגית שלהם מתכלה. שיפוע המלח יש השפעות שונות על הצורה בהתאם הידרופוביה של עמוד השדרה קופולימר בלוק. ניתן להשתמש בו ליצירת פרולטים, מוטות וסטומטוציטים. שיטה זו מונחה מלח נבחרה בגלל קלות השכפול ורבגוניות ניסיונית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. היווצרות פולימרית כדורית בשיטת הזרקת ממס

1. פירוק פוליאסטרים בממס אורגני
   הערה: רק פוליאסטר אחד צריך להיות מומס בממס האורגני המתאים שלה בכל פעם כדי ליצור פולימרוזומים.
   1. להמיס פוליאסטרים PEG-PLA או PEG-b-פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) (PEG-PLGA) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) בריכוז של 1.5% משקל. באופן ספציפי, להמיס 0.015 גרם של פוליאסטר נבחר ב 1 מ"ל של DMSO (15 מ"ג / מ"ל). פירוק מלא של הפולימר עשוי לדרוש תקופות של עד 15 דקות של מערבולת.
2. בעוד הפוליאסטר מתמוסס בממס אורגני, הקימו את מנגנון הזרקת הממסים על פי איור 1.
   1. מניחים צלחת ערבוב ישירות מתחת למשאבת המזרק האנכית. מניחים בקבוקון זכוכית בגודל 5 מ"ל עם 1 מ"ל מים מסוג II וחטיף ערבוב מיניאטורי על צלחת הערבוב.
   2. התאימו את גובה משאבת המזרק כדי לאפשר לקצה המחט להיות שקועים לחלוטין במים מסוג II.
   3. הגדר את קצב העירוי של משאבת המזרק ל 5 μL / min.
      הערה: אם נעשה שימוש במשאבת מזרק קטנה בנפח, ניתן להגדיר את המתאם עם המזרק במעמד טבעת. אם נעשה שימוש במשאבת מזרק בנפח גדול, ניתן למקם את המשאבה אנכית על שקע מעבדה כדי להתאים את הגובה.
3. בצע את הזרקת הממס על ידי ציור פתרון ממס אורגני פוליאסטר (שלב 1.1.1) לתוך מחט 27 G עם אורך מחט 1/2 ".
   1. מניחים את המחט לתוך משאבת המזרק ולוודא שהוא מאובטח לחלוטין. כוונן את בלוק הדוחף כדי לגעת בקצה הבוכנה של המזרק.
   2. התחל את צלחת ערבוב כך המים מסתובבים ב 100 סל"ד, ולאחר מכן להתחיל את משאבת המזרק.
4. לאחר משאבת המזרק יש חדורה מלאה את הממס האורגני ואת הפולימר לתוך המים המערבבים, להסיר מן מוט stir וכובע בקבוקון הזכוכית.
5. לאפיין את הפולימרים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS).
   1. קח 1 מ"ל של מים, עכשיו עם אחוז קטן של ממס אורגני ופולימר, ומניחים cuvette 1 מ"ל.
   2. באמצעות ההגדרות מטבלה 1, בצע DLS על-ידי הצבת cuvette 1 מ"ל לתוך המערכת והגדרת הריצה. קרא ואסוף את הקוטר הפולימרי משוקלל ומדד polydispersity (PDI).
      הערה: cuvette פלסטיק עובד בסדר במקרה זה, כמו כמות ממס אורגני הוא נמוך מאוד. עם זאת, יעבוד גם אם כל חששות קיימים.
6. אשר היווצרות פולימרית כדורית באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סריקה (SEM).
   1. מטב את פרוטוקולי TEM ו- SEM בהתבסס על הציוד הזמין. תוצאות מייצגות התקבלו ב 120 kV ב- TEM ו 5.0 kV ב- SEM.
   2. אם פולימרים אינם נראים באמצעות EM, להחיל אצטט אורניל ככתם רקע.
      הערה: פרטים על הדמיית TEM ו- SEM עבור אפנון הצורה של פולימרים מבוססי פוליאסטר ניתן למצוא בהפניה¹⁴. מידע על טכניקות מיקרוסקופיה אלקטרונית עבור חלקיקים רכים מפורט התייחסות¹⁶.

2. דיאליזה להסרת ממס אורגני

1. לשטוף קרום דיאליזה 300 kDa על פי פרוטוקולים שסופקו על ידי היצרן.
2. הוסף 1 מ"ל של פתרון פולימרי למאגר של התקן הדיאליזה.
3. מניחים את התקן הדיאליזה בכוס 250 מ"ל עם 150 מ"ל של מים דה-יוניים מסוג II על צלחת ערבוב. מניחים את צלחת הערבוב למהירות המאפשרת תנועה עדינה של מכשיר הדיאליזה ומשאירים לערבב לילה.
   הערה: אם מערבולת נוצרת במהלך הדיאליזה, יש להקטין את המהירות.
4. לאחר השלמת הדיאליזה, לחלץ את הפתרון פולימרי 1 מ"ל מהתקן הדיאליזה. לאפיין את הפתרון הפולימרי, בעקבות שלב 1.5.
   הערה: איסוף מידע זה רלוונטי כדי לקבוע את ההצלחה של פרוטוקול אפנון הצורה, כמו אחד צריך להיות מסוגל לזהות עלייה PDI אם פולימרום הוארך.

3. דיאליזה נגד שיפועי מלח

1. צור 150 מ"ל של חוצץ המלח הרצוי, עם 50 mM, 100 mM, או 200 mM ריכוז של נתרן כלורי מבוסס על המאפיינים הפולימריים הרצויים הסופיים. באופן כללי, ריכוז מלח מוגבר מוביל התארכות פולימרית מוגברת.
2. קח את הפתרון הפולימרי שחויג ומאופיין והכניס מחדש להתקן הדיאליזה. מניחים את התקן הדיאליזה הטעון לתוך 150 מ"ל של תמיסת המלח הרצויה ולאפשר לערבב בעדינות במשך 18 שעות.
   הערה: ניתן לאחסן פולימרים מכווננים בצורה ולשמור על צורתם בתמיסה איזוטונית לתקופות של עד 7 ימים.

4. אפיון פולימרי מווסת צורה

1. לאחר אפנון הצורה, בצע אפיון פולימרי באמצעות DLS, TEM ו- SEM. אם פולימרים אינם נראים באמצעות EM, להחיל אצטט אורניל ככתם רקע.
2. בצע מדידות DLS כמתואר בשלב 1.5, תוך שימת לב מיוחדת למדידות PDI בהשוואה לפולימרומים כדוריים, שכן שינוי ב- PDI מציע שינוי צורה יעיל בפולימרומים.
3. ודא את השימוש בפקדים מתאימים להדמיה, במיוחד פולימרים מאופננים שאינם צורה, כדי להבטיח את הצלחת השיטה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

טבלה 2 מציגה תוצאות צפויות בעת ביצוע השלב 1 בפרוטוקול. שים לב כי DMSO משמש ממס הן PEG-PLA ו PEG-PLGA בהיווצרות פולימרים. סטייה מממס זה אפשרית, כמו ממיסים אחרים מים miscible יהיה להמיס את הקופולימרים אבל צפוי לשנות את התוצאות. זה צפוי כי PDI יהיה פחות מ 0.2, המציין את היווצרות של monodisperse פולימרים

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מערכות בהרכב עצמי ידועות לשמצה כבלתי נשלטות. המאפיינים הסופיים שלהם, כולל גודל, צורה ומבנה, מונעים על ידי המאפיינים ההידרופוביים של האמפיפיל שנבחר וסביבת הממס שנבחרה. קופולימרים בלוק אמפיפילי נוטים לכיוון צורות כדוריות, אשר ממזער את האנרגיה החופשית של גיב ומוביל שיווי משקל תרמודינמי

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern