Modulación de la forma de polimerosomas a base de poliéster mediante presión osmótica

Resumen

Los polimerosomas son vesículas poliméricas autoensambladas que se forman en formas esféricas para minimizar la energía libre de Gibb. En el caso de la administración de fármacos, las estructuras más alargadas son beneficiosas. Este protocolo establece métodos para crear polimerosomas más parecidos a varillas, con relaciones de aspecto alargadas, utilizando sal para inducir presión osmótica y reducir los volúmenes internos de vesículas.

Resumen

Los polimerosomas son vesículas bicapa unidas a la membrana creadas a partir de copolímeros de bloque anfifílico que pueden encapsular cargas útiles hidrofóbicas e hidrófilas para aplicaciones de administración de fármacos. A pesar de su promesa, los polimerosomas tienen una aplicación limitada debido a su forma esférica, que no es fácilmente absorbido por las células, como lo demuestran los científicos de nanopartículas sólidas. Este artículo describe un método a base de sal para aumentar las relaciones de aspecto de los polimerosomas esféricos basados en poli(etilenglicol) (PEG). Este método puede alargar los polimerosomas y, en última instancia, controlar su forma final mediante la adición de cloruro de sodio en diálisis posterior a la formación. La concentración de sal puede variar, como se describe en este método, en función de la hidrofobicidad del copolímero de bloque que se utiliza como base para el polimersoma y la forma objetivo. Las nanopartículas alargadas tienen el potencial de dirigirse mejor al endotelio en vasos sanguíneos de mayor diámetro, como las venas, donde se observa la marginación. Este protocolo puede ampliar las aplicaciones terapéuticas de nanopartículas mediante la utilización de técnicas de elongación en conjunto con los beneficios de doble carga y circulación prolongada de los polimerosomas.

Introducción

La modulación de la forma es una forma relativamente nueva y eficiente de mejorar la administración de fármacos mediados por nanopartículas. El cambio en la morfología no solo aumenta el área de superficie de las partículas, lo que a su vez permite una mayor capacidad de carga, sino que también tiene implicaciones en todos los ámbitos para mejorar la estabilidad, el tiempo de circulación, la biodisponibilidad, la orientación molecular y la liberación controlada¹. Los polimerosomas, la nanopartícula de enfoque en este método, tienden a autoensamblarse termodinámicamente en una forma esférica, que ha demostrado ser poco práctica en la absorción celular y se detecta más fácilmente en el sistema inmunológico como un cuerpo extraño. Ser capaz de alargar la estructura en un prolato o una varilla permitirá al portador de la droga evadir los macrófagos imitando a las células nativas y entregar con más éxito a su objetivo deseado^2,3,4,5,6,7. Los beneficios significativos de los polimerosomas, incluida la protección de las cargas útiles unidas a la membrana, la capacidad de respuesta a los estímulos de la membrana y la encapsulación dual de medicamentos hidrófilos e hidrófobos^8,9,10,que los convierten en candidatos fuertes para la administración de medicamentos se mantienen durante la modulación de la forma.

Hay muchos métodos diferentes para modular las formas de los polimerosomas, y cada uno viene con sus respectivas ventajas y desventajas. Sin embargo, la mayoría de estos métodos se dividen en dos categorías: cambio de presión osmótica impulsada por solvente y presión osmótica impulsada por sal¹¹. Ambos enfoques tienen como objetivo superar la energía de flexión presente después de que los polimerosomas se forman en forma de equilibrio esférico. Al introducir un gradiente de presión osmótica, los polimerosomas pueden ser forzados a doblarse en estructuras alargadas a pesar de las fuertes energías de flexión^11,12.

El método basado en solventes explora el cambio de forma inspirado en el trabajo de Kim y van Hest¹³. Plastificados polimerosomas en una mezcla de solvente orgánico y agua para atrapar los solventes orgánicos en la membrana de la vesícula y expulsar el agua del núcleo de la vesícula. Eventualmente, el volumen interno de la partícula es tan bajo que se alarga. Si bien este método ha demostrado ser prometedor, carece de practicidad. Este método requiere diferentes disolventes para cada columna vertebral polimérica individual involucrada en la modulación. Por lo tanto, no es ampliamente aplicable para promover el cambio de forma. Por el contrario, el método a base de sal es uniforme y utiliza un controlador universal que puede introducir presión osmótica a muchos polimerosomas basados en copolímeros de bloque.

Este proyecto utiliza el método a base de sal introducido por L'Amoreaux et al¹⁴. Este protocolo implica dos rondas de diálisis. Uno tiene como objetivo purificar y solidificar poli(etilenglicol)-b-poli(ácido láctico) (PEG-PLA) polimersomas mediante la eliminación de disolvente orgánico que puede haber quedado atrapado en la bicapa durante la producción, y uno que promueve el cambio de forma. El segundo paso de diálisis introduce una solución de NaCl de 50 mM que crea un gradiente de presión osmótica para impulsar el cambio de forma. Este método es apoyado por Salva et al., quienes señalan que el estrés hipertónico en una solución hará que la vesícula se encoja¹⁵. Este método se basa en un método¹⁴ publicado anteriormente que analiza dos polimerosomas diferentes a base de poliéster y varios gradientes de sal de 50-200 mM NaCl. Los poliésteres se utilizan debido a su biocompatibilidad y biodegradación. El gradiente de sal tiene efectos variables en la forma dependiendo de la hidrofobicidad de la columna vertebral del copolímero de bloque. Se puede utilizar para crear prolatos, bastones y estomatocitos. Este método impulsado por sal fue elegido debido a la facilidad de replicación y versatilidad experimental.

Protocolo

1. Formación de polimersomas esféricos utilizando un método de inyección de disolvente

1. Disolución de poliésteres en disolvente orgánico
   NOTA: Solo se debe disolver un poliéster en su respectivo disolvente orgánico a la vez para formar polimerosomas.
   1. Disolver poliésteres PEG-PLA o PEG-b-poly(ácido láctico-co-glicólico) (PEG-PLGA) en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración del 1,5% en peso. En concreto, disolver 0,015 g de poliéster seleccionado en 1 mL de DMSO (15 mg/mL). La disolución completa del polímero puede requerir períodos de hasta 15 minutos de vórtice.
2. Mientras el poliéster se disuelve en disolvente orgánico, configure el aparato de inyección de disolvente de acuerdo con la Figura 1.
   1. Coloque una placa de agitación directamente debajo de la bomba de jeringa vertical. Coloque un vial de vidrio de 5 ml con 1 ml de agua desionizada tipo II y una barra de agitación en miniatura en la placa de agitación.
   2. Ajuste la altura de la bomba de la jeringa para permitir que la punta de la aguja se sumerja completamente en agua desionizada tipo II.
   3. Fije la velocidad de perfusión de la bomba de jeringa a 5 μL/min.
      NOTA: Si se utiliza una bomba de jeringa de pequeño volumen, el adaptador con la jeringa se puede configurar en un soporte de anillo. Si se utiliza una bomba de jeringa de gran volumen, la bomba se puede colocar verticalmente en un gato de laboratorio para ajustar la altura.
3. Realice la inyección de disolvente extrayendo el disolvente orgánico y la solución de poliéster (paso 1.1.1) en una aguja de 27 G con una longitud de aguja de 1/2".
   1. Coloque la aguja en la bomba de la jeringa y asegúrese de que esté completamente segura. Ajuste el bloque del empujador para tocar el extremo del émbolo de la jeringa.
   2. Encienda la placa de agitación para que el agua gire a 100 rpm y luego inicie la bomba de la jeringa.
4. Una vez que la bomba de la jeringa haya infundido completamente el disolvente orgánico y el polímero en el agua de agitación, retire de la barra de agitación y taple el vial de vidrio.
5. Caracterizar los polimerosomas mediante dispersión dinámica de la luz (DLS).
   1. Tome 1 ml de agua, ahora con un pequeño porcentaje de disolvente orgánico y polímero, y colóquela en una cubeta de 1 ml.
   2. Usando la configuración de la Tabla 1,realice DLS colocando una cubeta de 1 mL en el sistema y configure la ejecución. Lea y recoja el diámetro ponderado por intensidad del polimersoma y el índice de polidispersidad (PDI).
      NOTA: Una cubeta de plástico funciona bien en este caso, ya que la cantidad de disolvente orgánico es muy baja. Sin embargo, una cubeta de vidrio también funcionará si existe alguna inquietud.
6. Confirmar la formación de polimersomas esféricos utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía electrónica de barrido (SEM).
   1. Optimizar los protocolos TEM y SEM en función de los equipos disponibles. Se obtuvieron resultados representativos a 120 kV en el TEM y 5,0 kV en el SEM.
   2. Si los polimerosomas no son visibles usando EM, aplique acetato de uranilo como una mancha de fondo.
      NOTA: Los detalles sobre las imágenes TEM y SEM para la modulación de la forma de los polimerosomas a base de poliéster se pueden encontrar en la referencia^14. La información sobre las técnicas de microscopía electrónica para nanopartículas blandas se detalla en la referencia^16.

2. Diálisis para eliminar el disolvente orgánico

1. Lave una membrana de diálisis de 300 kDa de acuerdo con los protocolos proporcionados por el fabricante.
2. Agregue 1 ml de solución de polimersoma en el depósito del dispositivo de diálisis.
3. Coloque el dispositivo de diálisis en un beaker de 250 ml con 150 ml de agua desionizada tipo II en una placa de agitación. Ajuste la placa de agitación a una velocidad que permita un movimiento suave del dispositivo de diálisis y deje remover durante la noche.
   NOTA: Si se forma un vórtice durante la diálisis, la velocidad debe disminuir.
4. Después de completar la diálisis, extraiga la solución polimersómica de 1 ml del dispositivo de diálisis. Caracterizar la solución polimersómica, siguiendo el paso 1.5.
   NOTA: La recopilación de esta información es relevante para determinar el éxito del protocolo de modulación de forma, ya que se debe poder identificar un aumento en la PDI si el polimerosoma ha sido alargado.

3. Diálisis contra gradientes de sal

1. Cree 150 ml de tampón de sal deseado, con una concentración de cloruro de sodio de 50 mM, 100 mM o 200 mM basada en las propiedades polimersómicas finales deseadas. En general, el aumento de la concentración de sal conduce a un aumento de la elongación del polimerosoma.
2. Tome la solución de polimersoma que fue dializada y caracterizada y vuelva a colocar en el dispositivo de diálisis. Coloque el dispositivo de diálisis cargado en 150 ml de la solución salina deseada y deje remover suavemente durante 18 h.
   NOTA: Los polimerosomas modulados por forma se pueden almacenar y mantener su forma en una solución isotónica durante períodos de hasta 7 días.

4. Caracterización del polimersoma modulado por la forma

1. Después de la modulación de la forma, realice la caracterización del polimersoma a través de DLS, TEM y SEM. Si los polimerosomas no son visibles usando EM, aplique acetato de uranilo como una mancha de fondo.
2. Realice mediciones de DLS como se describe en el paso 1.5, prestando especial atención a las mediciones de PDI en comparación con los polimerosomas esféricos, ya que un cambio en PDI sugiere un cambio de forma efectivo en los polimerosomas.
3. Asegurar el uso de controles apropiados para la obtención de imágenes, especialmente polimerosomas no modulados por forma, para garantizar el éxito del método.

Resultados

La Tabla 2 presenta los resultados esperados al seguir el paso 1 del protocolo. Tenga en cuenta que dmSO se utiliza como disolvente tanto para PEG-PLA como para PEG-PLGA en la formación de polimerosomas. La desviación de este disolvente es posible, ya que otros disolventes miscibles en agua disolverán los copolímeros, pero se espera que cambien los resultados. Se espera que la PDI sea inferior a 0,2, lo que indica la formación de polimerosomas monodispersos¹⁷. Tenga en cuenta...

Discusión

Los sistemas autoensamblados son notoriamente incontrolables. Sus propiedades finales, incluyendo tamaño, forma y estructura, son impulsadas por las propiedades hidrofóbicas del anfífilo elegido y el entorno solvente seleccionado. Los copolímeros de bloque anfifílico tienden hacia formas esféricas, lo que minimiza la energía libre de Gibb y conduce al equilibrio termodinámico^23,formando así polimerosomas. Debido a su naturaleza de equilibrio, los polimerosomas son significativamente más ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern