Modulation de la forme des polymères à base de polyester en utilisant la pression osmotique

Résumé

Les polymères sont des vésicules polymères auto-assemblées qui sont formées en formes sphériques pour minimiser l’énergie libre de Gibb. Dans le cas de l’administration de médicaments, des structures plus allongées sont bénéfiques. Ce protocole établit des méthodes pour créer plus de polymères en forme de bâtonnets, avec des rapports d’aspect allongés, en utilisant du sel pour induire une pression osmotique et réduire les volumes internes des vésicules.

Résumé

Les polymères sont des vésicules bicouches liées à la membrane créées à partir de copolymères blocs amphiphiles qui peuvent encapsuler des charges utiles hydrophobes et hydrophiles pour des applications d’administration de médicaments. Malgré leurs promesses, les polymères sont limités dans leur application en raison de leur forme sphérique, qui n’est pas facilement prise en charge par les cellules, comme l’ont démontré les scientifiques des nanoparticules solides. Cet article décrit une méthode à base de sel pour augmenter les rapports d’aspect des polymères sphériques à base de poly(éthylène glycol) (PEG). Cette méthode peut allonger les polymères et finalement contrôler leur forme finale en ajoutant du chlorure de sodium dans la dialyse post-formation. La concentration en sel peut varier, comme décrit dans cette méthode, en fonction de l’hydrophobicité du copolymère bloc utilisé comme base pour le polymère et de la forme cible. Les nanoparticules allongées ont le potentiel de mieux cibler l’endothélium dans les vaisseaux sanguins de plus grand diamètre, comme les veines, où la marge est observée. Ce protocole peut étendre les applications thérapeutiques des nanoparticules en utilisant des techniques d’allongement en tandem avec les avantages à double charge et à longue circulation des polymères.

Introduction

La modulation de forme est un moyen relativement nouveau et efficace d’améliorer l’administration de médicaments médiés par des nanoparticules. Non seulement le changement de morphologie augmente la surface des particules, ce qui permet à son tour une plus grande capacité de charge, mais il a également des implications à tous les niveaux pour améliorer la stabilité, le temps de circulation, la biodisponibilité, le ciblage moléculaire et la libération contrôlée¹. Les polymères, la nanoparticule de concentration dans cette méthode, ont tendance à s’auto-assembler thermodynamiquement en une forme sphérique, qui s’est avérée peu pratique dans l’absorption cellulaire et est plus facilement détectée dans le système immunitaire en tant que corps étranger. Être capable d’allonger la structure en un prolate ou une tige permettra au porteur de médicament d’échapper aux macrophages en imitant les cellules natives et de livrer avec plus de succès à leur cible souhaitée^2,3,4,5,6,7. Les avantages significatifs des polymères, y compris la protection des charges utiles liée à la membrane, la réactivité aux stimuli de la membrane et la double encapsulation des médicaments hydrophiles et hydrophobes 8^,9,10, qui en font de solides candidats pour l’administration de médicaments sont maintenus pendant la modulation de la forme.

Il existe de nombreuses méthodes différentes pour moduler les formes des polymères, et chacune présente ses avantages et ses inconvénients respectifs. Cependant, la plupart de ces méthodes se répartissent en deux catégories : le changement de pression osmotique à base de solvant et le changement de pression osmotique induit par le sel¹¹. Les deux approches visent à surmonter l’énergie de flexion présente après la formation de polymères en forme d’équilibre sphérique. En introduisant un gradient de pression osmotique, les polymères peuvent être forcés de se plier en structures allongées malgré de fortes énergies de flexion^11,12.

La méthode à base de solvant explore le changement de forme inspiré par les travaux de Kim et van Hest^13. Ils ont plastifié des polymères dans un solvant organique et un mélange d’eau pour piéger les solvants organiques dans la membrane de la vésicule et chasser l’eau du noyau de la vésicule. Finalement, le volume interne de la particule est si faible qu’il s’allonge. Bien que cette méthode se soit révélée prometteuse, elle manque de praticité. Cette méthode nécessite différents solvants pour chaque squelette polymère individuel impliqué dans la modulation. Par conséquent, il n’est pas largement applicable pour promouvoir le changement de forme. Inversement, la méthode à base de sel est uniforme et utilise un pilote universel qui peut introduire une pression osmotique dans de nombreux polymères à base de copolymères séqueux.

Ce projet utilise la méthode à base de sel introduite par L’Amoreaux et al^14. Ce protocole implique deux cycles de dialyse. L’un vise à purifier et à solidifier les polymères poly(éthylène glycol)-b-poly(acide lactique) (PEG-PLA) en éliminant le solvant organique qui peut avoir été piégé dans la bicouche pendant la production, et celui qui favorise le changement de forme. La deuxième étape de dialyse introduit une solution de NaCl de 50 mM qui crée un gradient de pression osmotique pour entraîner le changement de forme. Cette méthode est soutenue par Salva et al., qui notent que le stress hypertonique dans une solution entraînera le rétrécissement de la vésicule¹⁵. Cette méthode s’appuie sur une méthode¹⁴ publiée précédemment en examinant deux polymères différents à base de polyester et divers gradients de sel de 50 à 200 mM de NaCl. Les polyesters sont utilisés en raison de leur biocompatibilité et de leur biodégradation. Le gradient de sel a des effets variables sur la forme en fonction de l’hydrophobicité de l’épine dorsale du copolymère bloc. Il peut être utilisé pour créer des prolates, des bâtonnets et des stomatocytes. Cette méthode à l’eau salée a été choisie en raison de la facilité de réplication et de la polyvalence expérimentale.

Protocole

1. Formation de polymères sphériques à l’aide d’une méthode d’injection de solvant

1. Dissolution des polyesters dans un solvant organique
   REMARQUE: Un seul polyester doit être dissous dans son solvant organique respectif à la fois pour former des polymères.
   1. Dissoudre les polyesters PEG-PLA ou PEG-b-poly(acide lactique-co-glycolique) (PEG-PLGA) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) à une concentration de 1,5% en poids. Plus précisément, dissoudre 0,015 g de polyester sélectionné dans 1 mL de DMSO (15 mg/mL). La dissolution complète du polymère peut nécessiter des périodes allant jusqu’à 15 minutes de vortex.
2. Pendant que le polyester se dissout dans un solvant organique, configurez l’appareil d’injection de solvant conformément à la figure 1.
   1. Placez une plaque d’agitation directement sous la pompe à seringue verticale. Placer un flacon en verre de 5 mL avec 1 mL d’eau désionisée de type II et une barre d’agitation miniature sur la plaque d’agitation.
   2. Ajustez la hauteur de la pompe à seringue pour permettre à la pointe de l’aiguille d’être complètement immergée dans l’eau désionisée de type II.
   3. Réglez le débit de perfusion de la pompe à seringue à 5 μL/min.
      REMARQUE: Si une pompe à seringue de petit volume est utilisée, l’adaptateur avec la seringue peut être installé sur un support annulaire. Si une pompe à seringue de grand volume est utilisée, la pompe peut être placée verticalement sur une prise de laboratoire pour ajuster la hauteur.
3. Effectuer l’injection de solvant en tirant le solvant organique et la solution de polyester (étape 1.1.1) dans une aiguille de 27 G avec une longueur d’aiguille de 1/2 ».
   1. Placez l’aiguille dans la pompe à seringue et assurez-vous qu’elle est entièrement sécurisée. Ajustez le bloc poussoir pour toucher l’extrémité du piston de la seringue.
   2. Démarrez la plaque d’agitation pour que l’eau tourne à 100 tr/min, puis démarrez la pompe à seringue.
4. Une fois que la pompe à seringue a complètement infusé le solvant organique et le polymère dans l’eau d’agitation, retirez de la barre d’agitation et bouchonnez le flacon en verre.
5. Caractériser les polymères par diffusion dynamique de la lumière (DLS).
   1. Prendre 1 mL d’eau, maintenant avec un faible pourcentage de solvant organique et de polymère, et placer dans une cuvette de 1 mL.
   2. À l’aide des paramètres du tableau 1,effectuez DLS en plaçant une cuvette de 1 mL dans le système et configurez l’exécution. Lire et recueillir le diamètre pondéré en fonction de l’intensité des polymères et l’indice de polydispersité (IDP).
      REMARQUE: Une cuvette en plastique fonctionne bien dans ce cas, car la quantité de solvant organique est très faible. Cependant, une cuvette en verre fonctionnera également si des préoccupations existent.
6. Confirmer la formation de polymères sphériques à l’aide de la microscopie électronique à transmission (TEM) et de la microscopie électronique à balayage (MEB).
   1. Optimisez les protocoles TEM et SEM en fonction de l’équipement disponible. Des résultats représentatifs ont été obtenus à 120 kV dans le TEM et à 5,0 kV dans le SEM.
   2. Si les polymères ne sont pas visibles à l’aide de l’EM, appliquez de l’acétate d’uranyle comme tache de fond.
      REMARQUE: Les détails sur l’imagerie TEM et SEM pour la modulation de forme des polymères à base de polyester peuvent être trouvés dans la référence¹⁴. Les informations sur les techniques de microscopie électronique pour les nanoparticules molles sont détaillées dans la référence¹⁶.

2. Dialyse pour éliminer le solvant organique

1. Lavez une membrane de dialyse de 300 kDa selon les protocoles fournis par le fabricant.
2. Ajouter 1 mL de solution polymère dans le réservoir de l’appareil de dialyse.
3. Placer l’appareil de dialyse dans un bécher de 250 mL avec 150 mL d’eau désionisée de type II sur une plaque d’agitation. Réglez la plaque d’agitation à une vitesse qui permet un mouvement doux de l’appareil de dialyse et laissez remuer pendant la nuit.
   REMARQUE: Si un vortex se forme pendant la dialyse, la vitesse doit être diminuée.
4. Une fois la dialyse terminée, extraire la solution polymère de 1 mL du dispositif de dialyse. Caractériser la solution polymère, en suivant l’étape 1.5.
   REMARQUE: La collecte de ces informations est pertinente pour déterminer le succès du protocole de modulation de forme, car on devrait être en mesure d’identifier une augmentation de la PDI si le polymère a été allongé.

3. Dialyse contre les gradients de sel

1. Créer 150 mL de tampon salin souhaité, avec une concentration de 50 mM, 100 mM ou 200 mM de chlorure de sodium en fonction des propriétés polymères finales souhaitées. En général, l’augmentation de la concentration en sel entraîne une augmentation de l’allongement des polymères.
2. Prenez la solution polymère qui a été dialysée et caractérisée et replacez-la dans le dispositif de dialyse. Placer l’appareil de dialyse chargé dans 150 mL de la solution saline désirée et laisser remuer doucement pendant 18 h.
   REMARQUE: Les polymères modulés en forme peuvent être stockés et maintenir leur forme dans une solution isotonique pendant des périodes allant jusqu’à 7 jours.

4. Caractérisation des polymères modulés de forme

1. Après la modulation de forme, effectuez la caractérisation des polymères via DLS, TEM et SEM. Si les polymères ne sont pas visibles à l’aide de l’EM, appliquez de l’acétate d’uranyle comme tache de fond.
2. Effectuer des mesures DLS comme décrit à l’étape 1.5, en accordant une attention particulière aux mesures PDI par rapport aux polymères sphériques, car un changement de PDI suggère un changement de forme efficace dans les polymères.
3. S’assurer de l’utilisation de contrôles appropriés pour l’imagerie, en particulier les polymères non modulés de forme, afin d’assurer le succès de la méthode.

Résultats

Le tableau 2 présente les résultats attendus en suivant l’étape 1 du protocole. Notez que le DMSO est utilisé comme solvant pour le PEG-PLA et le PEG-PLGA dans la formation de polymères. Un écart par rapport à ce solvant est possible, car d’autres solvants miscibles à l’eau dissoudront les copolymères, mais devraient modifier les résultats. On s’attend à ce que la PDI soit inférieure à 0,2, ce qui indique la formation de polymérsomes monodispersés¹⁷. Notez q...

Discussion

Les systèmes auto-assemblés sont notoirement incontrôlables. Leurs propriétés finales, y compris la taille, la forme et la structure, sont déterminées par les propriétés hydrophobes de l’amphiphile choisi et l’environnement de solvant sélectionné. Les copolymères blocs amphiphiles tendent vers des formes sphériques, ce qui minimise l’énergie libre de Gibb et conduit à l’équilibre thermodynamique^23,formant ainsi des polymères. En raison de leur nature d’équilibre, les po...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern