使用渗透压力调节聚酯聚合物的形状

摘要

聚合物体是自组装的聚合囊泡，形成球形，以尽量减少吉布的自由能量。在药物输送方面，更拉长的结构是有益的。本协议建立了方法，以创建更多的棒状聚合物体，与拉长的纵横比，使用盐诱导渗透压力和减少内部囊泡体积。

摘要

聚合物体是膜结合的双层囊泡，由嗜血块共聚体制成，可以封装疏水和亲水有效载荷，用于药物输送应用。尽管聚合物体很有前途，但由于其球形，其应用有限，而细胞不易被细胞占据，固体纳米粒子科学家证明了这一点。本文描述了一种盐基方法，用于提高球形聚合物（乙二醇）（PEG）基聚合物的纵横比。这种方法可以拉长聚合物体，并最终通过在形成后透析中加入氯化钠来控制其最终形状。盐浓度可以多种多样，如本方法所述，基于用作聚合物和目标形状基础的块聚合物的疏水性。拉长的纳米粒子有可能更好地瞄准直径较大的血管中的内皮，如观察到边缘的静脉。本方案可利用拉长技术与聚合物的双载长循环效益配合，扩大治疗纳米粒子的应用。

引言

形状调制是改善纳米粒子介质药物输送的一种相对较新和有效的方法。形态的变化不仅增加了粒子的表面积，反过来又增加了承载能力，而且对提高稳定性、循环时间、生物可用性、分子靶向和受控释放¹具有全面的影响。聚合物体是该方法中焦点的纳米粒子，它倾向于热力学自我组装成球形，这已被证明在细胞吸收中不切实际，并且更容易在免疫系统中作为异物检测到。能够将结构拉长成一根蛋白石或一根棒子，将使药物携带者通过模仿原生细胞来躲避巨噬细胞，并更成功地将它们交付到他们期望的目标2、3、4、5、6、7。聚合物体的显著优点，包括有效载荷的膜绑定保护，膜的刺激反应，以及亲水药物和疏水药物^8，9，10的双重封装，使他们在形状调制过程中保持药物输送的有力候选者。

调节聚合物体的形状有许多不同的方法，每种方法都有各自的优缺点。然而，这些方法大多分为两类:溶剂驱动和盐驱动的渗透压力变化^11。这两种方法都旨在克服聚合物形成球形平衡形状后存在的弯曲能量。通过引入渗透压力梯度，聚合物体可以被迫弯曲成拉长结构，尽管强弯曲能量^11，12。

基于溶剂的方法探索形状的变化灵感来自金和范赫斯特¹³的工作。他们将有机溶剂和水混合物中的聚合物塑料化，将有机溶剂捕获在囊泡膜中，并将水从囊芯中排出。最终，粒子的内部体积如此之低，以至于拉长了。虽然这种方法已显示出希望，但它缺乏实用性。此方法需要不同的溶剂为每个单独的聚合物骨干参与调制。因此，它并不广泛适用于促进形状的变化。相反，盐基方法是均匀的，并利用一个通用驱动因素，可以引入渗透压力到许多块聚合物为基础的聚合物体。

该项目采用拉莫罗等人引进的盐基^方法。此协议涉及两轮透析。一种旨在通过去除在生产过程中可能困在双层中的有机溶剂来净化和凝固聚（乙二醇）-b-聚合物（乳酸）（PEG-PLA）聚合物，另一种则促进形状变化。第二个透析步骤引入了 50 mM NaCl 溶液，可创建渗透压力梯度以驱动形状变化。这种方法得到了萨尔瓦等人的支持，他们指出，溶液中的超音速应激会导致囊泡收缩^15。此方法基于先前发布的方法^14， 从 50-200 m NaCl 中查看两种不同的聚酯聚合物和各种盐梯度。聚酯由于其生物相容性和生物降解而使用。盐梯度对形状有不同的影响，具体取决于块共聚体骨干的疏水性。它可用于创建前列腺、棒和豆类细胞。之所以选择这种盐驱动的方法，是因为复制的便利性和实验的多功能性。

研究方案

1. 使用溶剂注射法形成球形聚合物

1. 有机溶剂中聚酯溶解
   注:一次只应溶解一个聚酯溶解在各自的有机溶剂中，形成聚合物体。
   1. 溶解聚酯PEG-PLA或PEG-b-poly（乳酸-共甘油酸）（PEG-PLGA）在二甲基硫氧化物（DMSO）的浓度为1.5%的重量。具体来说，溶解 0.015 克选定的聚酯在 1 mL 的 DMSO （15 毫克/毫升）.。聚合物的完全溶解可能需要长达15分钟的涡流。
2. 当聚酯溶解在有机溶剂中时，根据 图1设置溶剂注射装置。
   1. 将搅拌板直接放在垂直注射器泵下面。将一个 5 mL 玻璃瓶与 1 mL 的 II 型电离水和微型搅拌棒放在搅拌盘上。
   2. 调整注射器泵的高度，使针头的尖端完全浸入II型电离水中。
   3. 将注射器泵的输液速率设置为 5 μL/分钟。
      注:如果使用小容量注射器泵，则可以将带注射器的适配器设置在环形支架上。如果使用大容量注射器泵，泵可以垂直放置在实验室插孔上以调整高度。
3. 通过将有机溶剂和聚酯溶液（第 1.1.1 步）绘制成 27 G 针头，针头长度为 1/2"，执行溶剂注射。
   1. 将针头放入注射器泵中，确保完全安全。调整推手块以触摸注射器柱塞的末端。
   2. 启动搅拌盘，使水在 100 rpm 旋转，然后启动注射器泵。
4. 一旦注射器泵将有机溶剂和聚合物充分注入搅拌水中，从搅拌棒中取出并盖住玻璃瓶。
5. 通过动态光散射 （DLS） 来描述聚合物体的特征。
   1. 取1mL的水，现在有一小部分有机溶剂和聚合物，并放置在1mL的cuvette。
   2. 使用 表 1中的设置，通过在系统中放置 1 mL cuvette 并设置运行来执行 DLS。阅读并收集聚合物强度加权直径和聚分散度指数 （PDI）。
      注意:在这种情况下，塑料小面包效果很好，因为有机溶剂的含量非常低。但是，如果存在任何顾虑，玻璃杯也会起作用。
6. 使用传输电子显微镜 （TEM） 和扫描电子显微镜 （SEM） 确认球形聚合物的形成。
   1. 根据可用设备优化 TEM 和 SEM 协议。在 TEM 中获得了 120 kV 的代表性结果，在 SEM 中获得了 5.0 kV 的代表性结果。
   2. 如果使用 EM 看不到聚合物，请将醋酸尿素用作背景污渍。
      注:关于聚酯聚合物形状调制的 TEM 和 SEM 成像的详细信息，请参照¹⁴找到。软纳米粒子电子显微镜技术资料详见^参考16。

2. 透析去除有机溶剂

1. 根据制造商提供的协议清洗 300 kDa 透析膜。
2. 将 1 mL 聚合物溶液加入透析装置的储层中。
3. 将透析装置放在 250 mL 烧饼中，将 150 mL 的 II 型电离水放在搅拌盘上。将搅拌板设置为允许透析装置的轻柔运动的速度，然后离开搅拌过夜。
   注意:如果在透析过程中形成漩涡，则速度需要降低。
4. 透析完成后，从透析装置中提取 1 mL 聚合物溶液。按照第 1.5 步对聚合物溶液进行特征化。
   注:收集此信息与确定形状调制协议的成功相关，因为如果聚合物体已拉长，则应能够识别 PDI 的增加。

3. 对盐梯度进行透析

1. 根据最终所需的聚合物特性，创建 150 mL 的所需盐缓冲区，其氯化钠浓度为 50 mM、100 mM 或 200 mM。一般来说，盐浓度的增加会导致聚合物拉长的增加。
2. 取透析和定性聚合物溶液，重新放入透析装置中。将装载的透析装置放入所需的盐溶液的 150 mL 中，并轻轻搅拌 18 小时。
   注:可将形状调节聚合物体存储并维持其形状，以同位素溶液保存长达 7 天。

4. 形状调制聚合物特征

1. 形状调制后，通过 DLS、TEM 和 SEM 执行聚合物特征。如果使用 EM 看不到聚合物，请将醋酸尿素用作背景污渍。
2. 执行第 1.5 步中描述的 DLS 测量，特别注意 PDI 测量与球形聚合物体相比，因为 PDI 的变化表明聚合物体的形状发生了有效变化。
3. 确保使用适当的成像控制，特别是非形状调制聚合物，以确保该方法的成功。

结果

表 2 在遵循协议步骤 1 时呈现预期结果。请注意，DMSO 在聚合物体形成中用作 PEG-PLA 和 PEG-PLGA 的溶剂。偏离这种溶剂是可能的，因为其他水错溶剂将溶解共聚物，但预计将改变结果。预计PDI将低于0.2，表明单分散聚合物^体17的形成。请注意，水灵性增加会导致聚合物直径和 PDI 的偏差增加。如果运行协议时，聚合物直径与此表中报告的直径有显著差异:最典型的罪魁祸...

讨论

自组装系统是出了名的无法控制。它们的最终属性，包括大小、形状和结构，是由所选的两栖动物的疏水特性和所选溶剂环境驱动的。嗜血块共聚物倾向于球形，从而最大限度地减少吉布的自由能量，并导致热力学平衡^23，从而形成聚合物体。由于其平衡性质，聚合物体在拉长或改变形状方面具有更大的挑战性，因此，与固体纳米粒子相比，研究较少。溶剂驱动的方法已经与PEG-b...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern