Osmotik Basınç Kullanarak Polyester Bazlı Polimeromların Modülasyon Şekli

Özet

Polimeromlar, Gibb'in Serbest Enerjisini en aza indirmek için küresel şekillerde oluşturulan kendi kendine monte edilmiş polimerik veziküllerdir. İlaç teslimi durumunda, daha uzun yapılar faydalıdır. Bu protokol, ozmotik basıncı teşvik etmek ve iç veziklin hacimlerini azaltmak için tuz kullanarak uzun en boy oranlarına sahip daha çubuk benzeri polimeromlar oluşturmak için yöntemler oluşturur.

Özet

Polimeromlar, ilaç dağıtım uygulamaları için hem hidrofobik hem de hidrofilik yükleri kapsülleyebilen amfifilik blok koalizörlerden oluşturulan membran bağlı, bilayer veziküllerdir. Sözlerine rağmen, polimeromlar, katı nanopartikül bilim adamları tarafından gösterildiği gibi hücreler tarafından kolayca alınmayan küresel şekilleri nedeniyle uygulamada sınırlıdır. Bu makalede, küresel poli(etilen glikol) (PEG) bazlı polimeromların en boy oranlarını artırmak için tuz bazlı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem polimeromları uzatabilir ve sonuçta oluşum sonrası diyalize sodyum klorür ekleyerek son şekillerini kontrol edebilir. Tuz konsantrasyonu, bu yöntemde açıklandığı gibi, polimerom ve hedef şekil için temel olarak kullanılan blok koalizerinin hidrofobikliğine dayanarak değiştirilebilir. Uzun nanopartiküller, kenar boşluğunun gözlendiği damarlar gibi daha büyük çaplı kan damarlarında endotelleri daha iyi hedefleme potansiyeline sahiptir. Bu protokol, polimeromların çift yüklemeli, uzun süre dolaşan yararları ile birlikte uzama tekniklerini kullanarak terapötik nanopartikül uygulamalarını genişletebilir.

Giriş

Şekil modülasyonu, nanopartikül aracılı ilaç dağıtımını iyileştirmenin nispeten yeni ve verimli bir yoludur. Morfolojideki değişiklik sadece parçacıkların yüzey alanını artırmakla kalmaz, bu da daha fazla taşıma kapasitesi sağlar, aynı zamanda stabiliteyi, dolaşım süresini, biyoyararlanımı, moleküler hedeflemeyi ve kontrollü salınımı iyileştirmek için tahta genelinde etkileri vardır¹. Bu yöntemdeki odak nanopartikül olan polimeromlar, hücresel alımda pratik olmadığı kanıtlanmış ve yabancı bir cisim olarak bağışıklık sisteminde daha kolay tespit edilen termodinamik olarak kendi kendine küresel bir şekle dönüşme eğilimindedir. Yapıyı bir prolate veya çubuk haline getirebilmek, ilaç taşıyıcısının yerel hücreleri taklit ederek makrofajlardan kaçmasına ve istenen hedefe 2 , 3 , 4^,5,6,7daha başarılı bir şekilde teslim etmesine izin verecektir. Membranlara bağlı yüklerin korunması, zarın uyaranlara yanıt vermesi ve hidrofilik ve hidrofobik ilaçların çift kapsüllenmesi de dahil olmak üzere polimeromların önemli yararları⁸,^9,10, onları ilaç teslimatı için güçlü adaylar haline getiren şekil modülasyonu sırasında korunur.

Polimeromların şekillerini modüle etmede birçok farklı yöntem vardır ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları ile birlikte gelir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin çoğu iki kategoriye ayrılır: solvent tahrikli ve tuz tahrikli ozmotik basınç değişimi¹¹. Her iki yaklaşım da polimeromlar küresel denge şeklinde oluştuktan sonra mevcut bükme enerjisinin üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. Osmotik basınç gradyanı getirilerek, polimeromlar güçlü bükme enerjilerine rağmen uzun yapılara bükülmeye zorlanabilir^11,12.

Solvent tabanlı yöntem, Kim ve van Hest^13'ünçalışmalarından esinlenerek şekil değişikliğini araştırıyor. Organik çözücüleri vezikül zarında hapsetmek ve suyu veziklin çekirdeğinden çıkarmak için organik bir çözücü ve su karışımında polimeromları plastikleştirdiler. Sonunda, parçacığın iç hacmi o kadar düşüktür ki, uzadı. Bu yöntem umut vaat etse de, pratiklikten yoksun. Bu yöntem, modülasyonda yer alan her bir polimerik omurga için farklı çözücüler gerektirir. Bu nedenle, şekil değişikliğini teşvik etmek yaygın olarak geçerli değildir. Tersine, tuz bazlı yöntem tekdüzedir ve birçok blok koolimer bazlı polimeromlara ozmotik basınç getirebilen tek bir evrensel sürücü kullanır.

Bu proje L'Amoreaux ve^ark. Bu protokol iki tur diyaliz içeriyor. Biri, üretim sırasında bilayerde sıkışmış olabilecek organik çözücüyü çıkararak poli (etilen glikol)-b-poli(laktik asit) (PEG-PLA) polimeromlarını arındırmayı ve katılaştırmayı amaçlamaktadır ve şekil değişikliğini teşvik eder. İkinci diyaliz adımı, şekil değişimini sağlamak için ozmotik basınç gradyanı oluşturan 50 mM NaCl çözümünü sunar. Bu yöntem, bir çözeltideki hipertonik stresin veziklinin küçülmesine neden olacağını belirten Salva ve ark.,¹⁵. Bu yöntem, 50-200 mM NaCl'den iki farklı polyester bazlı polimerom ve çeşitli tuz gradyanlarına bakarak daha önce yayınlanan bir yöntem¹⁴ üzerine kuruludur. Polyesterler biyouyumları ve biyobozunurlukları nedeniyle kullanılır. Tuz gradyanı, blok koalyolimer omurgasının hidrofobikliğine bağlı olarak şekil üzerinde çeşitli etkilere sahiptir. Prolates, çubuklar ve stomatositler oluşturmak için kullanılabilir. Bu tuz tahrikli yöntem, replikasyon kolaylığı ve deneysel çok yönlülük nedeniyle seçildi.

Protokol

1. Solvent enjeksiyon yöntemi kullanılarak küresel polimerom oluşumu

1. Organik çözücüde polyesterlerin çözünmesi
   NOT: Polimerom oluşturmak için ilgili organik çözücüde aynı anda sadece bir polyester çözülmelidir.
   1. Polyesterleri PEG-PLA veya PEG-b-poly (laktik-ko-glikolik asit) (PEG-PLGA) dimetil sülfit (DMSO) içinde % 1,5 ağırlıkta çözün. Özellikle, 0.015 g seçili polyesteri 1 mL DMSO (15 mg/mL) içinde çözün. Polimerin tam çözünmesi için 15 dakikaya kadar girdaplanma dönemleri gerekebilir.
2. Polyester organik çözücüde çözülürken, solvent enjeksiyon cihazını Şekil 1'e göre ayarlayın.
   1. Bir karıştırma plakasını dikey şırınna pompasının tam altına yerleştirin. Karıştırma plakasına 1 mL Tip II deiyonize su ve minyatür bir karıştırma çubuğu ile 5 mL cam şişe yerleştirin.
   2. Şırınga pompasının yüksekliğini, iğne ucunun Tip II deiyonize suya tamamen batırılmasını sağlayacak şekilde ayarlayın.
   3. Şırınna pompasının infüzyon oranını 5 μL/dk olarak ayarlayın.
      NOT: Küçük hacimli bir şırınna pompası kullanılırsa, şırınnalı adaptör bir halka standına kurulabilir. Büyük hacimli bir şırınna pompası kullanılırsa, pompa yüksekliği ayarlamak için bir laboratuvar jakına dikey olarak yerlenebilir.
3. Organik çözücü ve polyester çözeltisini (adım 1.1.1) 1/2" iğne uzunluğuna sahip 27 G'lık bir iğneye çekerek çözücü enjeksiyonu gerçekleştirin.
   1. İğneyi şırınga pompasına yerleştirin ve tamamen güvenli olduğundan emin olun. Şırıngan pistonun ucuna dokunmak için itici bloğunu ayarlayın.
   2. Karıştırma plakasını, suyun 100 rpm'de dönmesi için başlatın ve ardından şırınna pompasını çalıştırın.
4. Şırınd pompası organik çözücü ve polimeri karıştırma suyuna tamamen aşıladıktan sonra, karıştırma çubuğundan çıkarın ve cam şişeyi kaplayın.
5. Polimeromları dinamik ışık saçılımı (DLS) ile karakterize eder.
   1. Şimdi küçük bir organik çözücü ve polimer yüzdesi ile 1 mL su alın ve 1 mL'lik bir cuvette yerleştirin.
   2. Tablo 1'denayarları kullanarak, sisteme 1 mL cuvette yerleştirerek DLS gerçekleştirin ve çalıştırmayı ayarlayın. Polimerom yoğunluk ağırlıklı çapı ve polidisperlik indeksini (PDI) okuyun ve toplayın.
      NOT: Organik çözücü miktarı çok düşük olduğu için plastik bir cuvette bu durumda iyi çalışır. Bununla birlikte, herhangi bir endişe varsa, bir cam cuvette de çalışacaktır.
6. İletim Elektron Mikroskopisi (TEM) ve TaramaLı Elektron Mikroskopisi (SEM) kullanarak küresel polimerom oluşumunu onaylayın.
   1. TEM ve SEM protokollerini mevcut ekipmanlara göre optimize edin. TEM'de 120 kV, SEM'de 5.0 kV'de temsili sonuçlar alındı.
   2. Em kullanılarak polimeromlar görünmüyorsa, arka plan lekesi olarak uranil asetat uygulayın.
      NOT: Polyester bazlı polimeromların şekil modülasyonu için TEM ve SEM görüntüleme ile ilgili ayrıntılar referans^14'tebulunabilir. Yumuşak nanopartiküller için elektron mikroskopi teknikleri hakkında bilgi referansta ayrıntılı olarak açıklanmıştır^16.

2. Organik çözücüyü çıkarmak için diyaliz

1. Üretici tarafından sağlanan protokollere göre 300 kDa diyaliz membranı yıkayın.
2. Diyaliz cihazının rezervuarına 1 mL polimerom çözeltisi ekleyin.
3. Diyaliz cihazını bir karıştırma plakasına 150 mL Tip II deiyonize su ile 250 mL'lik bir kabın içine yerleştirin. Karıştırma plakasını diyaliz cihazının hafifçe hareket etmesine izin veren bir hıza ayarlayın ve gece boyunca karıştırmaya bırakın.
   NOT: Diyaliz sırasında bir girdap oluşursa hızın düşürülmesi gerekir.
4. Diyaliz tamamlandıktan sonra, diyaliz cihazından 1 mL polimerom çözeltisini çıkarın. 1.5. adımı izleyerek polimerom çözeltisini karakterize edin.
   NOT: Bu bilgilerin toplanması, şekil modülasyon protokolünün başarısını belirlemek için geçerlidir, çünkü polimerom uzamışsa PDI'daki bir artışı tanımlayabilmelidir.

3. Tuz gradyanlarına karşı diyaliz

1. İstenilen son polimerom özelliklerine göre 50 mM, 100 mM veya 200 mM sodyum klorür konsantrasyonu ile 150 mL istenen tuz tamponu oluşturun. Genel olarak, artan tuz konsantrasyonu polimerom uzamasının artmasına neden olan şey.
2. Diyalize edilmiş ve karakterize edilmiş polimerom çözeltisini alın ve diyaliz cihazına yeniden yerleştirin. Yüklenen diyaliz cihazını istenen tuz çözeltisinin 150 mL'sine yerleştirin ve 18 saat boyunca hafifçe karıştırmaya bırakın.
   NOT: Şekil modüle edilmiş polimeromlar 7 güne kadar bir süre boyunca izotonik bir çözeltide saklanabilir ve şekillerini koruyabilir.

4. Şekil modüle polimerom karakterizasyonu

1. Şekil modülasyonundan sonra DLS, TEM ve SEM üzerinden polimerom karakterizasyonu gerçekleştirin. Em kullanılarak polimeromlar görünmüyorsa, arka plan lekesi olarak uranil asetat uygulayın.
2. PDI'daki bir değişiklik polimeromlarda etkili şekil değişikliğine işaret ettiği için, küresel polimeromlara kıyasla PDI ölçümlerine özellikle dikkat ederek, adım 1.5'te açıklandığı gibi DLS ölçümleri gerçekleştirin.
3. Yöntemin başarısını sağlamak için görüntüleme için uygun kontrollerin, özellikle şekilsiz modüle edilmiş polimeromların kullanılmasını sağlayın.

Sonuçlar

Tablo 2, protokol adım 1'i takip ederken beklenen sonuçları sunar. DMSO'nun polimerom oluşumunda hem PEG-PLA hem de PEG-PLGA için çözücü olarak kullanıldığını unutmayın. Bu çözücüden sapma mümkündür, çünkü diğer suda karışır çözücüler koalizörleri çözecektir, ancak sonuçları değiştirmesi beklenir. PDI'nın monodisperz polimeromlarının oluşumunu gösteren 0,2'den az olması beklenebilir¹⁷. Artan hidrofobikliğin hem polimerom çapında hem...

Tartışmalar

Kendi kendine monte edilen sistemler kontrol edilemez. Boyut, şekil ve yapı dahil olmak üzere son özellikleri, seçilen amfifilin hidrofobik özellikleri ve seçilen çözücü ortamı tarafından tahrik edilir. Amfifilik blok koalize ediciler, Gibb'in serbest enerjisini en aza indiren ve termodinamik denge^23'eyol açan küresel şekillere yönelir, böylece polimeromlar oluşturur. Denge doğası nedeniyle, polimeromların şekillerini uzatmak veya değiştirmek önemli ölçüde daha zordur ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern