Modulierende Form von Polymersomen auf Polyesterbasis mit osmotischem Druck

Zusammenfassung

Polymersomen sind selbstorganisierte polymere Vesikel, die in kugelförmigen Formen gebildet werden, um Gibbs freie Energie zu minimieren. Im Falle der Medikamentenabgabe sind länglichere Strukturen von Vorteil. Dieses Protokoll legt Methoden fest, um mehr stäbchenartige Polymersomen mit länglichen Seitenverhältnissen zu erzeugen, wobei Salz verwendet wird, um osmotischen Druck zu induzieren und das innere Vesikelvolumen zu reduzieren.

Zusammenfassung

Polymersomen sind membrangebundene, zweischichtige Vesikel, die aus amphiphilen Blockcopolymeren hergestellt werden und sowohl hydrophobe als auch hydrophile Nutzlasten für Arzneimittelabgabeanwendungen verkapseln können. Trotz ihres Versprechens sind Polymersomen aufgrund ihrer kugelförmigen Form, die von Zellen nicht ohne weiteres aufgenommen wird, in der Anwendung begrenzt, wie Wissenschaftler für feste Nanopartikel gezeigt haben. Dieser Artikel beschreibt eine salzbasierte Methode zur Erhöhung der Seitenverhältnisse von polymersomen polymersomen auf Basis von sphärischem Poly(ethylenglykol) (PEG). Diese Methode kann Polymersomen verlängern und letztendlich ihre endgültige Form kontrollieren, indem Natriumchlorid in der Post-Formationsdialyse hinzugefügt wird. Die Salzkonzentration kann, wie in diesem Verfahren beschrieben, basierend auf der Hydrophobie des Blockcopolymers, das als Basis für das Polymersom und die Zielform verwendet wird, variiert werden. Längliche Nanopartikel haben das Potenzial, das Endothel in Blutgefäßen mit größerem Durchmesser, wie Venen, wo Eine Randbildung beobachtet wird, besser anzusprechen. Dieses Protokoll kann therapeutische Nanopartikelanwendungen erweitern, indem es Dehnungstechniken zusammen mit den dual-belastenden, lang zirkulierenden Vorteilen von Polymersomen verwendet.

Einleitung

Die Formmodulation ist eine relativ neue und effiziente Möglichkeit, die nanopartikelvermittelte Wirkstoffabgabe zu verbessern. Die Veränderung der Morphologie erhöht nicht nur die Oberfläche der Partikel, was wiederum eine größere Tragfähigkeit ermöglicht, sondern hat auch Auswirkungen auf die gesamte Linie, um stabilität, Zirkulationszeit, Bioverfügbarkeit, molekulares Targeting und kontrollierte Freisetzung zu verbessern¹. Polymersomen, das Nanopartikel des Fokus bei dieser Methode, neigen dazu, sich thermodynamisch selbst zu einer kugelförmigen Form zusammenzusetzen, die sich in der zellulären Aufnahme als unpraktisch erwiesen hat und im Immunsystem leichter als Fremdkörper nachgewiesen werden kann. Die Fähigkeit, die Struktur in ein Prolat oder einen Stab zu verlängern, ermöglicht es dem Wirkstoffträger, Makrophagen zu umgehen, indem er native Zellen nachahmt und erfolgreicher an ihr gewünschtes Ziel^2,3,4 ,^5,6,7liefert . Die signifikanten Vorteile von Polymersomen, einschließlich des membrangebundenen Schutzes von Nutzlasten, der Reizreaktionsfähigkeit der Membran und der doppelten Verkapselung hydrophiler und hydrophober Medikamente^8,9,10, die sie zu starken Kandidaten für die Wirkstoffabgabe machen, bleiben während der Formmodulation erhalten.

Es gibt viele verschiedene Methoden zur Modulation der Formen von Polymersomen, und jede hat ihre jeweiligen Vor- und Nachteile. Die meisten dieser Verfahren lassen sich jedoch in zwei Kategorien einteilen: lösemittelhaltige und salzgetriebene osmotische Druckänderung¹¹. Beide Ansätze zielen darauf ab, die Biegeenergie zu überwinden, die nach der Bildung von Polymersomen in einer sphärischen Gleichgewichtsform vorhanden ist. Durch die Einführung eines osmotischen Druckgradienten können Polymersomen gezwungen werden, sich trotz starker Biegeenergien in längliche Strukturen zu biegen^11,12.

Die lösungsmittelbasierte Methode erforscht formwandel, inspiriert von der Arbeit von Kim und van Hest¹³. Sie plastifizierten Polymersomen in einem organischen Lösungsmittel- und Wassergemisch, um die organischen Lösungsmittel in der Vesikelmembran einzufangen und Wasser aus dem Vesikelkern zu treiben. Schließlich ist das innere Volumen des Partikels so gering, dass es sich verlängert. Während sich diese Methode als vielversprechend erwiesen hat, fehlt es ihr an Praktikabilität. Diese Methode erfordert unterschiedliche Lösungsmittel für jedes einzelne polymere Rückgrat, das an der Modulation beteiligt ist. Daher ist es nicht weit verbreitet, Formveränderungen zu fördern. Umgekehrt ist die salzbasierte Methode einheitlich und verwendet einen universellen Treiber, der osmotischen Druck auf viele Blockcopolymer-basierte Polymersomen ausüben kann.

Dieses Projekt verwendet die salzbasierte Methode, die von L'Amoreaux et al¹⁴eingeführt wurde. Dieses Protokoll beinhaltet zwei Dialyserunden. Eines zielt darauf ab, Poly(ethylenglykol)-b-Poly(milchsäure)(PEG-PLA)-Polymersomen zu reinigen und zu verfestigen, indem organische Lösungsmittel entfernt werden, die während der Produktion in der Doppelschicht eingeschlossen sein könnten, und eines, das die Formänderung fördert. Im zweiten Dialyseschritt wird eine 50 mM NaCl-Lösung eingeführt, die einen osmotischen Druckgradienten erzeugt, um die Formänderung voranzutreiben. Diese Methode wird von Salva et al. unterstützt, die feststellen, dass hypertoner Stress in einer Lösung dazu führt, dass das Vesikel^{um 15}schrumpft. Diese Methode baut auf einer zuvor veröffentlichten Methode¹⁴ auf, die zwei verschiedene Polymersomen auf Polyesterbasis und verschiedene Salzgradienten von 50-200 mM NaCl untersucht. Polyester werden aufgrund ihrer Biokompatibilität und ihres biologischen Abbaus verwendet. Der Salzgradient hat je nach Hydrophobie des Blockcopolymer-Rückgrats unterschiedliche Auswirkungen auf die Form. Es kann verwendet werden, um Prolate, Stäbchen und Stomatozyten zu erzeugen. Diese salzhaltige Methode wurde aufgrund der einfachen Replikation und der experimentellen Vielseitigkeit gewählt.

Protokoll

1. Sphärische Polymersomenbildung mittels Lösungsmittelinjektionsverfahren

1. Auflösung von Polyestern in organischem Lösungsmittel
   HINWEIS: Es sollte jeweils nur ein Polyester in seinem jeweiligen organischen Lösungsmittel gelöst werden, um Polymersomen zu bilden.
   1. Polyester PEG-PLA oder PEG-b-poly(milch-co-glykolsäure) (PEG-PLGA) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 1,5 % Gewicht auflösen. Insbesondere 0,015 g ausgewähltes Polyester in 1 ml DMSO (15 mg/ml) auflösen. Die vollständige Auflösung des Polymers kann Zeiträume von bis zu 15 minuten Wirbeln erfordern.
2. Während sich das Polyester in organischem Lösungsmittel auflöst, richten Sie die Lösungsmittelinjektionsvorrichtung gemäß Abbildung 1 ein.
   1. Legen Sie eine Rührplatte direkt unter die vertikale Spritzenpumpe. Legen Sie ein 5-ml-Glasfläschchen mit 1 ml entionisiertem Wasser vom Typ II und einem Miniatur-Rührstab auf die Rührplatte.
   2. Stellen Sie die Höhe der Spritzenpumpe so ein, dass die Nadelspitze vollständig in entionisiertes Wasser vom Typ II eingetaucht werden kann.
   3. Stellen Sie die Infusionsrate der Spritzenpumpe auf 5 μL/min ein.
      HINWEIS: Wenn eine Spritzenpumpe mit kleinem Volumen verwendet wird, kann der Adapter mit der Spritze auf einem Ringständer aufgestellt werden. Wenn eine großvolumige Spritzenpumpe verwendet wird, kann die Pumpe vertikal auf einem Laborheber platziert werden, um die Höhe einzustellen.
3. Führen Sie die Lösungsmittelinjektion durch, indem Sie das organische Lösungsmittel und die Polyesterlösung (Schritt 1.1.1) in eine 27 G-Nadel mit einer Nadellänge von 1/2 Zoll ziehen.
   1. Setzen Sie die Nadel in die Spritzenpumpe ein und stellen Sie sicher, dass sie absolut sicher ist. Stellen Sie den Drückerblock so ein, dass er das Ende des Spritzenkolbens berührt.
   2. Starten Sie die Rührplatte, damit sich das Wasser bei 100 U / min dreht, und starten Sie dann die Spritzenpumpe.
4. Sobald die Spritzenpumpe das organische Lösungsmittel und das Polymer vollständig in das Rührwasser infundiert hat, entfernen Sie es aus dem Rührstab und verschließen Sie die Glasfläschchen.
5. Charakterisierung der Polymersomen mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS).
   1. Nehmen Sie 1 ml Wasser, jetzt mit einem kleinen Prozentsatz an organischem Lösungsmittel und Polymer, und legen Sie es in eine 1 ml Küvette.
   2. Führen Sie dlS mithilfe der Einstellungen aus Tabelle 1durch, indem Sie eine 1-ml-Küvette in das System einlegen und den Lauf einrichten. Lesen und sammeln Sie den polymersomenintensitätsgewichteten Durchmesser und den Polydispersitätsindex (PDI).
      HINWEIS: Eine Kunststoffküvette funktioniert in diesem Fall gut, da die Menge an organischem Lösungsmittel sehr gering ist. Eine Glasküvette funktioniert jedoch auch, wenn Bedenken bestehen.
6. Bestätigen Sie die Sphärische Polymersomenbildung mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) und Rasterelektronenmikroskopie (REM).
   1. Optimieren Sie TEM- und SEM-Protokolle basierend auf den verfügbaren Geräten. Repräsentative Ergebnisse wurden bei 120 kV im TEM und 5,0 kV im SEM erzielt.
   2. Wenn Polymersomen mit EM nicht sichtbar sind, tragen Sie Uranylacetat als Hintergrundfleck auf.
      HINWEIS: Details zur TEM- und REM-Bildgebung für die Formmodulation von Polymersomen auf Polyesterbasis finden Sie in Referenz¹⁴. Informationen zu elektronenmikroskopischen Techniken für weiche Nanopartikel sind in Referenz^{16 aufgeführt.}

2. Dialyse zur Entfernung organischer Lösungsmittel

1. Waschen Sie eine 300 kDa Dialysemembran gemäß den vom Hersteller bereitgestellten Protokollen.
2. Fügen Sie 1 ml Polymersomenlösung in das Reservoir des Dialysegeräts hinzu.
3. Legen Sie das Dialysegerät in ein 250-ml-Becherglas mit 150 ml entionisiertem Wasser Typ II auf eine Rührplatte. Stellen Sie die Rührplatte auf eine Geschwindigkeit, die eine sanfte Bewegung des Dialysegeräts ermöglicht, und lassen Sie sie über Nacht umrühren.
   HINWEIS: Wenn während der Dialyse ein Wirbel gebildet wird, muss die Geschwindigkeit verringert werden.
4. Nachdem die Dialyse abgeschlossen ist, extrahieren Sie die 1 ml Polymersomenlösung aus dem Dialysegerät. Charakterisieren Sie die Polymersomenlösung gemäß Schritt 1.5.
   HINWEIS: Die Erfassung dieser Informationen ist relevant, um den Erfolg des Formmodulationsprotokolls zu bestimmen, da man in der Lage sein sollte, einen Anstieg der PDI zu identifizieren, wenn das Polymersom verlängert wurde.

3. Dialyse gegen Salzgradienten

1. Erzeugen Sie 150 ml des gewünschten Salzpuffers mit einer Natriumchloridkonzentration von 50 mM, 100 mM oder 200 mM basierend auf den endgültigen gewünschten Polymersomeneigenschaften. Im Allgemeinen führt eine erhöhte Salzkonzentration zu einer erhöhten Polymersomendehnung.
2. Nehmen Sie die Polymersomenlösung, die dialysiert und charakterisiert wurde, und setzen Sie sie wieder in das Dialysegerät. Legen Sie das beladene Dialysegerät in 150 ml der gewünschten Salzlösung und lassen Sie es 18 h vorsichtig umrühren.
   HINWEIS: Formmodulierte Polymersomen können in einer isotonischen Lösung für Zeiträume von bis zu 7 Tagen gelagert werden und ihre Form behalten.

4. Formmodulierte Polymersomencharakterisierung

1. Führen Sie nach der Formmodulation eine Polymersomencharakterisierung über DLS, TEM und SEM durch. Wenn Polymersomen mit EM nicht sichtbar sind, tragen Sie Uranylacetat als Hintergrundfleck auf.
2. Führen Sie DLS-Messungen wie in Schritt 1.5 beschrieben durch, wobei sie besonders auf PDI-Messungen im Vergleich zu sphärischen Polymersomen achten, da eine Änderung der PDI auf eine effektive Formänderung in Polymersomen hindeutet.
3. Stellen Sie sicher, dass geeignete Kontrollen für die Bildgebung verwendet werden, insbesondere nicht formmodulierte Polymersomen, um den Erfolg der Methode sicherzustellen.

Ergebnisse

Tabelle 2 zeigt die erwarteten Ergebnisse beim Befolgen des Protokollschritts 1. Beachten Sie, dass DMSO als Lösungsmittel sowohl für PEG-PLA als auch für PEG-PLGA bei der Polymersomenbildung verwendet wird. Abweichungen von diesem Lösungsmittel sind möglich, da andere wassermischbare Lösungsmittel die Copolymere auflösen, aber voraussichtlich die Ergebnisse verändern werden. Es wird erwartet, dass der PDI-Swert kleiner als 0,2 sein wird, was auf die Bildung von monodispersen Polymersomen hinweis...

Diskussion

Selbstmontierte Systeme sind notorisch unkontrollierbar. Ihre endgültigen Eigenschaften, einschließlich Größe, Form und Struktur, werden durch die hydrophoben Eigenschaften des ausgewählten Amphiphilen und die ausgewählte Lösungsmittelumgebung bestimmt. Amphiphile Blockcopolymere neigen zu kugelförmigen Formen, was Gibbs freie Energie minimiert und zum thermodynamischen Gleichgewicht²³führt und so Polymersomen bildet. Aufgrund ihrer Gleichgewichtsnatur sind Polymersomen deutlich schwierig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern