浸透圧を用いたポリエステル系ポリマーの変形形状

要約

ポリマーソームは、ギブの自由エネルギーを最小限に抑えるために球形で形成される自己組織化されたポリマー小胞である。薬物送達の場合、より細長い構造が有益である。このプロトコルは、塩を使用して浸透圧を誘導し、内部の小胞体積を減少させるために、細長いアスペクト比を持つ、より多くの棒状ポリマーソームを作成する方法を確立します。

要約

ポリマーソームは、薬物送達用途のための疎水性および親水性ペイロードの両方をカプセル化することができる両親媒性ブロック共重合体から作成された膜結合、二重層小胞である。その約束にもかかわらず、ポリマーソームは、固体ナノ粒子科学者によって示されるように、細胞によって容易に取り込まれていない球形のために適用が制限されている。本稿では、球状ポリ(エチレングリコール)(PEG)系ポリマーソームのアスペクト比を高める塩ベースの方法について説明します。この方法はポリマーソームを伸び、最終的には形成後の透析に塩化ナトリウムを加えることによって最終的な形状を制御することができる。塩濃度は、この方法で説明したように、ポリマー類および標的形状の塩基として使用されているブロック共重合体の疎水性に基づいて変化させることができる。細長いナノ粒子は、マージンが観察される静脈のような、より大口径の血管内の内皮をより良く標的にする可能性を有する。このプロトコルは、ポリマーソームの二重ローディング、長い循環の利点と並行して伸びる技術を利用することによって治療ナノ粒子の適用を拡大することができる。

概要

形状変調は、ナノ粒子媒介薬物送達を改善する比較的新しく効率的な方法です。形態の変化は粒子の表面積を増加させるだけでなく、より大きな運搬能力を可能にするが、安定性、循環時間、バイオアベイラビリティ、分子ターゲティング、および制御放出¹を改善するために全面的に影響を及ぼす。この方法で焦点を当てたナノ粒子であるポリマーソームは、熱力学的に球形に自己集合する傾向があり、細胞の取り込みでは非現実的であることが証明されており、免疫系では異物としてより容易に検出される。構造をプロレートまたはロッドに伸ばしることができることは、薬物キャリアがネイティブ細胞を模倣することによってマクロファージを回避し、より正常に所望の目標^{2、3、4、5、6、7}に送達することを可能にする。重合体の重要な利点は、ペイロードの膜結合保護、膜の刺激応答性、および親水性および疎水性薬物の二重カプセル化^8、9、10を含む、それらが形状変調中に薬物送達の有力な候補を維持する。

ポリマーソームの形状を調節する方法は多くあり、それぞれに長所と短所があります。しかし、これらの方法のほとんどは、溶媒駆動および塩駆動浸透圧変化¹¹の2つのカテゴリに分類される。どちらのアプローチも、ポリマーソームが球状平衡形状に形成された後に存在する曲げエネルギーを克服することを目的とする。浸透圧勾配を導入することにより、ポリマーソームは、強い曲げエネルギー^11、12にもかかわらず、細長い構造に曲げることを余儀なくされる。

溶媒ベースの方法は、キムとファンヘスト¹³の仕事に触発された形状の変化を探ります。彼らは有機溶媒と水混合物でポリマーソームを可塑化し、小胞膜中の有機溶媒をトラップし、小胞コアから水を追い出した。最終的には、パーティクルの内部ボリュームが非常に低いため、粒子が伸びるほどになります。この方法は約束を示していますが、実用性に欠けている。この方法では、変調に関与する個々のポリマー骨格ごとに異なる溶媒が必要です。そのため、形状変化を促進するために広く適用されるわけではない。逆に、塩ベースの方法は均一であり、多くのブロック共重合体系ポリマーに浸透圧を導入することができる1つの普遍的なドライバを利用する。

本プロジェクトでは、ラモローら¹⁴によって導入された塩ベースの方法を利用する。このプロトコルは、透析の2ラウンドを含みます。一つは、製造中に二重層に閉じ込められた可能性のある有機溶剤を除去することによりポリ(エチレングリコール)-b-ポリ(PEG-PLA)ポリマーを精製し、固めることを目的とし、形状変化を促進するものである。2番目の透析工程では、50 mM NaCl溶液を導入し、浸透圧勾配を作成して形状変化を促進します。この方法は、溶液中の高調圧ストレスが小胞を¹⁵に縮小させることに注意してSalvaらによってサポートされています。この方法は、2つの異なるポリエステル系ポリマー類と50〜200 mM NaClの様々な塩勾配を見て、以前に公開された方法¹⁴ に基づいています。ポリエステルは、その生体適合性と生分解のために使用されます。塩勾配は、ブロックコポリマー骨格の疎水性に応じて形状に様々な影響を及ぼす。これは、プロレート、ロッド、およびトマト細胞を作成するために使用することができます。この塩駆動法は、複製の容易さと実験的な汎用性のために選択されました。

プロトコル

1. 溶媒噴射法を用いた球状ポリマー形成

1. 有機溶剤中のポリエステルの溶解
   注:ポリエステルを一度に1つの有機溶媒に溶解してポリマーソームを形成する必要があります。
   1. ジメチルスルホキシド(DMSO)の中で、PEG-PLAまたはPEG-b-ポリ(乳酸-コグリコール酸)(PEG-PLGA)を1.5%の濃度で溶解します。具体的には、選択したポリエステルの0.015gをDMSO(15mg/mL)の1mLに溶解する。ポリマーの完全溶解は、最大15分の渦の期間を必要とし得る。
2. ポリエステルが有機溶剤に溶解している間、 図1に従って溶剤噴射装置を設置する。
   1. 垂直シリンジポンプの真下に攪拌板を置きます。5 mL ガラスバイアルに、II型脱イオン水 1 mL と、攪拌プレートにミニチュアの攪拌棒を置きます。
   2. 注射器ポンプの高さを調整して、針の先端をII型脱イオン水に完全に浸します。
   3. シリンジポンプの注入速度を5μL/分に設定します。
      メモ:小容量のシリンジポンプを使用する場合、シリンジ付きアダプタをリングスタンドに設置できます。大ボリュームシリンジポンプを使用する場合、ポンプをラボジャックに垂直に配置して高さを調整できます。
3. 有機溶剤とポリエステル溶液(ステップ1.1.1)を1/2インチの針長で27G針に引き出して溶剤注入を行います。
   1. 注射器ポンプに針を入れ、完全に安全であることを確認します。プッシャーブロックを調整して、シリンジプランジャーの端に触れます。
   2. 水が100rpmで回転するように攪拌プレートを開始し、シリンジポンプを開始します。
4. シリンジポンプが有機溶媒とポリマーを攪拌水に完全に注入したら、攪拌バーから取り出し、ガラスバイアルをキャップします。
5. 動的光散乱(DLS)を介してポリマーを特徴付けます。
   1. 1 mLの水を取り、有機溶媒とポリマーの割合が少ない今、1 mLキュベットに入れます。
   2. 表1の設定を使用して、1 mLキュベットをシステムに配置してDLSを実行し、ランを設定します。ポリマー強度加重径および多分散指数(PDI)を読み取り、収集する。
      注:プラスチックキュベットは、有機溶剤の量が非常に少ないため、この場合は正常に動作します。しかし、懸念がある場合は、ガラスキュベットも同様に機能します。
6. 透過型電子顕微鏡(TEM)と走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて球状ポリマー形成を確認します。
   1. 利用可能な機器に基づいて、TEMおよびSEMプロトコルを最適化します。代表結果は、TEMで120kV、SEMで5.0kVで得られた。
   2. ポリマーソームがEMを用いて見えない場合は、ウラニル酢酸を背景染色剤として適用する。
      注: ポリエステル系ポリマーの形状変調の TEM および SEM イメージングの詳細については、リファレンス¹⁴を参照してください。軟ナノ粒子の電子顕微鏡技術については、参考^文献16に詳述する。

2. 有機溶剤を除去する透析

1. メーカーが提供するプロトコルに従って300kDa透析膜を洗浄してください。
2. 透析装置の貯留槽にポリマー溶液1 mL を加えます。
3. 250 mL ビーカーにダイアルシス装置を入れ、II型脱イオン水を150 mLの攪拌プレートに置きます。攪拌板を透析装置の穏やかな動きを可能にする速度に設定し、一晩かき混ぜるために残します。
   注:透析中に渦が形成された場合、速度を下げる必要があります。
4. 透析が完了したら、透析装置から1mLポリマー溶液を抽出する。ポリマー溶液を特徴付け、ステップ1.5に従う。
   注: この情報の収集は、ポリマーが長くなっていれば PDI の増加を識別することができる必要がありますので、形状変調プロトコルの成功を決定するのに関連しています。

3. 塩勾配に対する透析

1. 最終的に望ましいポリマー特性に基づいて、50 mM、100 mM、または200 mM濃度の塩化ナトリウムのいずれかを使用して、所望の塩バッファーを150 mL作成します。一般に、塩濃度の上昇はポリマー伸びの増加をもたらす。
2. 透析し、特徴付けされたポリマー溶液を透析装置に取り込み、再び配置します。装填された透析装置を所望の塩溶液の150 mLに入れ、18時間軽くかき混ぜるようにします。
   注:形状変調ポリマーは、最大7日間の等張溶液中に保存され、形状を維持することができます。

4. 変形ポリマー特性評価

1. 形状変調後、DLS、TEM、およびSEMを介して重合的な特性を行います。ポリマーソームがEMを用いて見えない場合は、ウラニル酢酸を背景染色剤として適用する。
2. ステップ1.5で説明したようにDLS測定を行い、球状ポリマーと比較してPDI測定に特に注意を払い、PDIの変化がポリマーソームの有効な形状変化を示唆するようにした。
3. イメージング、特に非形状変調ポリマーに適切なコントロールを使用して、メソッドの成功を確実にします。

結果

表 2 は 、プロトコルステップ 1 に従った場合の期待される結果を示しています。DMSOは、ポリマー形成におけるPEG-PLAおよびPEG-PLGAの両方の溶媒として使用されることに注意してください。この溶媒からの偏差は、他の水混和性溶媒が共重合体を溶解するが、結果が変化することが予想されるとして、可能である。PDIが0.2未満になることが予想され、単分散ポリマーソーム

ディスカッション

自己組み立て型システムは、制御不能と言われています。サイズ、形状、構造を含む最終的な特性は、選択された両親媒性の疎水性特性および選択された溶媒環境によって駆動されます。両親媒性ブロックコポリマーは、ギブの自由エネルギーを最小限に抑え、熱力学的平衡²³に導く球形に向かう傾向があり、ポリマーソームを形成する。その平衡性のために、ポリマーソ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15*45 vials screw thread w/cap attached	Fisherbrand	9609104000
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Chemical	D128-1
Dimethyl Sulfoxide	BDH	BDH1115-1LP
Isoremp stirrers, hotplates, and stirring hotplates	Fisher scientific	CIC00008110V19
LEGATO 130 SYRINGE PUMP	kd Scientific	788130
PEG(1000)-b-PLA(5000), Diblock Polymer	Polysciences Inc	24381-1	note the molecular weights when replicating
Poly(ethylene glycol) (2000) Methyl ether-block-poly(lactide-co-glycolide) (4500)	Sigma aldrich	764825-1G	note the molecular weights when replicating
Single-Use Syringe/BD PrecisionGlide Needle combination, sterile, BD medical	BD medical	BD305620	Tuberculin
Sodium Chloride	BDH	BDH9286
Zetasizer Nano ZS	Malvern