Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نحن نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف 2D و 3D المستحثة بالإنسان الخلايا الجذعية متعددة القدرات (hIPSC) القائمة على تطوير القشرة المخية الحديثة بالإضافة إلى منهجيات تكميلية تمكن من التحليل النوعي والكمي للنشأة الحيوية الأولية (PC) ووظيفتها.

Abstract

الأهداب الأولية (PC) هي عضيات ديناميكية غير متحركة قائمة على الأنابيب الدقيقة تبرز من سطح معظم خلايا الثدييات. وهي تخرج من المريكز الأقدم خلال مرحلة G1 / G0 من دورة الخلية ، بينما تتفكك مع عودة الخلايا إلى دورة الخلية عند حدود مرحلة G2 / M. وهي تعمل كمحاور إشارة ، من خلال اكتشاف ونقل الإشارات خارج الخلية الحاسمة للعديد من عمليات الخلايا. على غرار معظم أنواع الخلايا ، فقد ثبت أن جميع الخلايا الجذعية والسلفية العصبية القشرية الجديدة (NSPCs) تؤوي جهاز كمبيوتر يسمح لها باستشعار ونقل إشارات محددة مطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي. هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لإنشاء وتوصيف النماذج القائمة على الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) وثلاثية الأبعاد (3D) من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) لزيادة تشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء تطوير القشرة المخية الجديدة. على وجه الخصوص ، نقدم بروتوكولات لدراسة التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته في NSPCs المشتقة من الوردة العصبية 2D بما في ذلك نقل مسار القنفذ الصوتي (SHH). للاستفادة من التنظيم ثلاثي الأبعاد (3D) للعضويات الدماغية ، نصف طريقة بسيطة للتصوير ثلاثي الأبعاد للعضويات الدماغية الملطخة بالمناعة. بعد التطهير البصري ، يسمح الاكتساب السريع للعضويات بأكملها بالكشف عن كل من الجسيمات المركزية والكمبيوتر الشخصي على أسلاف القشرة المخية الجديدة والخلايا العصبية للعضوي بأكمله. أخيرا ، نقوم بتفصيل الإجراء الخاص بالتلطيخ المناعي وتطهير الأقسام العضوية السميكة العائمة بحرية مع الحفاظ على درجة كبيرة من المعلومات المكانية 3D والسماح بالحصول على دقة عالية المطلوبة للتحليل النوعي والكمي المفصل للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته.

Introduction

الأهداب الأولية (PC) هي عضيات تعتمد على الأنابيب الدقيقة التي تستشعر وتنقل عددا كبيرا من الإشارات الكيميائية والميكانيكية من البيئة خارج الخلية. على وجه الخصوص ، الكمبيوتر الشخصي هو العضية المركزية لنقل مسار إشارات القنفذ في الفقاريات1,2. في حين أن معظم الخلايا العصبية قد ثبت منذ فترة طويلة أنها تؤوي جهاز كمبيوتر ، إلا أن مساهمة هذه العضية في تشكيل الجهاز العصبي المركزي قد تم التقليل من قيمتها منذ فترة طويلة. أدت الدراسات التي أجريت على تطور القشرة المخية الجديدة إلى اكتشاف العديد من الخلايا الجذعية العصبية والسلف (NSPCs) ، وكلها تؤوي جهاز كمبيوتر ، وقد اقترح أن يكون موقعه حاسما لتحديد مصير السلف 3،4،5،6،7. وقد ثبت أن الكمبيوتر الشخصي ضروري لآليات الخلايا المطلوبة للنمو القشري الدماغي الطبيعي ، بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك القطبية القاعدية للسقالة الدبقية الشعاعية التي تدعم الهجرة العصبية13. بالإضافة إلى ذلك ، مطلوب جهاز كمبيوتر أثناء الهجرة العرضية بين الخلايا العصبية إلى اللوحة القشرية 14,15. أخيرا ، تم اقتراح دور للكمبيوتر الشخصي في إنشاء اتصالات متشابكة للخلايا العصبية في القشرة الدماغية16,17. وإجمالا، تجادل هذه النتائج بدور حاسم للكمبيوتر الشخصي في الخطوات الرئيسية للتطور القشري الدماغي18،19 وتثير الحاجة إلى التحقيق في تورطها في الآليات المرضية الكامنة وراء الشذوذ في التطور القشري الدماغي.

وقد حسنت الدراسات الحديثة إلى حد كبير فهمنا للاختلافات الخلوية والجزيئية الهامة بين التطور القشري في النماذج البشرية والحيوانية، مع التأكيد على الحاجة إلى تطوير أنظمة النماذج البشرية. في هذا الرأي، تمثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hIPSCs) نهجا واعدا لدراسة التسبب في الأمراض في سياق جيني وخليوي ذي صلة. تحتوي النماذج الخلوية ثنائية الأبعاد (2D) الملتصقة أو الورود العصبية على NSPCs مماثلة لتلك التي شوهدت في القشرة الدماغية النامية ، والتي تصبح منظمة في هياكل على شكل وردة تظهر قطبية أبيكوبازية صحيحة20،21،22. علاوة على ذلك ، يسمح نظام الاستزراع ثلاثي الأبعاد (3D) بتوليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية التي تلخص العديد من ميزات التطور القشري الدماغي البشري23،24،25،26. يقدم هذان النهجان التكميليان للنمذجة القائمة على الخلايا وجهات نظر مثيرة لتشريح مشاركة الكمبيوتر الشخصي أثناء التطور الطبيعي والمرضي للقشرة الدماغية.

هنا ، نقدم بروتوكولات مفصلة لتوليد وتوصيف الورود العصبية و NSPCs المشتقة وكذلك الأعضاء الظهرية في الدماغ الأمامي. كما نقدم بروتوكولات مفصلة لتحليل التكوين الحيوي ووظيفة الكمبيوتر الموجود على NSPCs من خلال اختبار نقل مسار القنفذ الصوتي وتحليل ديناميكيات الجزيئات الحاسمة المشاركة في هذا المسار. للاستفادة من تنظيم 3D من المواد العضوية الدماغية، ونحن أيضا إعداد طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة للتصوير 3D من في toto المناعية العضوية الدماغية مما يسمح اكتساب سريع، بفضل المجهر ورقة ضوء، من العضوية بأكملها، مع دقة عالية تمكن من تصور جهاز الكمبيوتر على جميع أنواع السلف القشرية الجديدة والخلايا العصبية من العضوية بأكملها. وأخيرا، قمنا بتكييف الكيمياء النسيجية المناعية على أقسام 150 ميكرومتر العائمة الحرة مع التطهير والاقتناء اللاحق باستخدام المجهر البؤري الضوئي الرنين مما يسمح بالحصول على صورة عالية الدقة، وهو أمر مطلوب للتحليل التفصيلي للتكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي ووظيفته. على وجه التحديد ، يسمح برنامج التصوير ثلاثي الأبعاد بإعادة بناء الكمبيوتر الشخصي 3D مع التحليل اللاحق للمعلمات المورفولوجية بما في ذلك طول الكمبيوتر وعدده واتجاهه بالإضافة إلى قياس كثافة الإشارة للمكونات الهدبية على طول axoneme.

Protocol

1. توليد نماذج 2D hIPS القائمة على الخلايا لتطوير القشرة المخية الجديدة

  1. تشكيل وردة عصبية
    1. ابدأ بثقافات hIPSC التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة ، وتظهر أقل من 10٪ من التمايز ولا تزيد عن 80٪ من التقاء.
    2. شطف hIPSCs مع 2 مل من PBS.
    3. أضف 2 مل من وسط الحث NSPC المكمل بمثبط الصخور (NIM + 10 μM من Y-27632).
    4. قم بتشريح كل مستعمرة hIPSC يدويا من طبق واحد 35 مم باستخدام إبرة لقطع كل مستعمرة بدقة في الاتجاهين الأفقي والرأسي لإنشاء نمط لوحة الشطرنج الذي يقسم كل مستعمرة إلى مجموعات متساوية.
    5. افصل المستعمرة باستخدام مكشطة خلايا وانقلها إلى طبق 35 مم منخفض التوصيل.
    6. دعها تطفو بين عشية وضحاها (ON) في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 ، حتى يتمكنوا من تكوين أجسام جنينية (EBs).
      ملاحظة: يتم تعريف الأجسام الجنينية (EBs) على أنها مجموعات كروية عائمة أو مجاميع من hIPSCs.
    7. انقل EBs إلى أطباق 35 مم مغلفة بالبولي L-ornithine / lam (PO / lam) في 2 مل NIM + 10 ميكرومتر من Y-27632.
    8. قم بتحديث متوسط تحريض NSPC يوميا (NIM بدون Y-27632) حتى تكوين وريدات عصبية تستغرق حوالي 12 إلى 14 يوما. تحقق تحت المجهر.
      ملاحظة: بعد هذه الخطوة يمكن توسيع الوريدات العصبية وتمييزها ومعالجتها لتحليل التلطيخ المناعي أو فصلها للحصول على الخلايا الجذعية العصبية والسلفية المعزولة (NSPCs).
  2. توسع الوردة العصبية والتمايز المبكر
    1. قطع الورود العصبية في نمط يشبه الشبكة باستخدام إبرة وإزاحة المجموعات باستخدام مكشطة الخلايا.
    2. انقل الورود إلى صفيحة من 4 آبار تحتوي على غطاء زجاجي مطلي ب PO / lam (4-5 وريدات / بئر) في 0.5 مل من وسيط صيانة NSPC (NMM).
    3. احتضن اللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
    4. قم بتحديث NMM كل يومين حتى اليوم 20.
    5. من اليوم 20 ، استنفدت الورود العصبية المستزرعة في 0.5 مل من السيتوكين NMM للسماح بالتمايز. تحديث الوسط كل 2-3 أيام.
    6. في اليوم 30 واليوم 40 (10 أو 20 يوما من التمايز) ، قم بإصلاح الورود ب 0.5 مل من PFA 4٪ ، 20 دقيقة ، RT.
  3. التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي وتحليل الوظائف على NSPCs المعزولة
    1. انفصال NSPC
      1. قطع الورود العصبية من الخطوة 1.1.8 في نمط يشبه الشبكة بإبرة وإزاحة المجموعات باستخدام مكشطة الخلايا. انقل الخلايا إلى أطباق PO / lam المغلفة ب 35 مم في 2 مل من NMM واحتضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      2. قم بتحديث NMM كل يومين حتى التقاء (حوالي 5-7 أيام).
      3. بعد كشط الخلايا الكبيرة والواضحة المحيطة بالورود العصبية ، قم بالتقاطها يدويا ونقلها إلى أطباق 35 مم الطازجة المغلفة ب PO / lam لإثراء NSPCs واستنزاف أنواع الخلايا غير العصبية.
      4. بعد مرور يدوي واحد أو اثنين (كرر الخطوة 1.3.1.3 إذا لزم الأمر) المطلوب لإزالة جميع أنواع الخلايا الملوثة ، قم بإزالة الوسط وشطفه باستخدام PBS.
      5. أضف 300 ميكرولتر من 0.05٪ من التربسين واحتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل معظم الخلايا.
      6. أضف 2 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS (DMEM + 10٪ FBS) لتعطيل التربسين. جمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل. قم بماصة تعليق الخلية بلطف لأعلى ولأسفل ثلاث مرات لتفتيت كتل الخلايا.
      7. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. استنشق بعناية supernatant وإعادة تعليق الخلايا في NMN.
      9. زرع NSPCs المنفصلة كخلايا واحدة (1 × 105 خلية / سم 2) في NMM على الأطباق المغلفة PO / lam واحتضانها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      10. قم بتوسيع NSPCs في NMM عن طريق تغيير الوسيط كل يومين.
        ملاحظة: يتم زرع NSPCs بكثافة عالية لتجنب التمايز.
    2. تحليل التكوين الحيوي للكمبيوتر الشخصي
      1. تقوم البذور بفصل NSPCs عند 100000 خلية / سم 2 وتحضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في NMM لمدة يومين.
      2. استنشاق NSPCs المتوسطة والجائعة في الوسط المستنفد للسيتوكين (وسط التجويع NSPC ، الجدول التكميلي 1) لمدة 48 ساعة.
      3. إصلاح NSPCs مع PFA 4٪ لمدة 20 دقيقة في RT.
      4. يغسل مرتين مع PBS لمدة 5 دقائق في RT قبل تلطيخ المناعة.
    3. تحليل وظيفة الكمبيوتر: مسار إشارات SHH
      1. تفصل البذور NSPCs في 100000 خلية / سم 2 على شرائح غرفة 8 بئر (300 ميكرولتر) أو T25 (5 مل) مغلفة ب PO / lam (300 ميكرولتر) أو T25 أطباق (5 مل) وتحضن في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 في NMM لمدة يومين.
      2. تجويع NSPCs في وسط تجويع NSPC (300 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 8 آبار و 5 مل في قارورة T25) لمدة 48 ساعة.
      3. للحث على مسار SHH ، احتضان NSPCs مع وسط التجويع المكمل ب SHH المؤتلف (100 نانوغرام / مل) أو SAG (500 نانومتر) ؛ (150 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 8 آبار و 2 مل في قارورة T25) لمدة 24 ساعة.
      4. قم بإصلاح NSPCs المستزرعة على شرائح غرفة 8 بئر في 250 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل بئر لمدة 20 دقيقة في RT واغسلها مرتين ب 250 ميكرولتر من PBS لمدة 5 دقائق في RT قبل تحليل التلطيخ المناعي.
      5. قم بإزالة الوسط واغسل NSPCs المستزرعة في أطباق T25 باستخدام PBS.
      6. أضف 500 ميكرولتر من 0.05٪ من التربسين واحتضنها لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا.
      7. أضف 2 مل من الوسط الذي يحتوي على 10٪ FBS (DMEM + 10٪ FBS) لتعطيل التربسين وجمع تعليق الخلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
      8. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بشفط المادة الفائقة بعناية للحصول على كريات NSPC التي يمكن حفظها بالتجميد عند -80 درجة مئوية قبل استخراج الحمض النووي الريبي وتحليل RT-PCR.

2. توليد عضويات الدماغ الأمامي الظهرية

  1. زراعة خلية واحدة من hIPSCs
    1. ابدأ بثقافات hIPSC التي تؤوي مستعمرات منتظمة كبيرة تظهر أقل من 10٪ من التمايز والتي تم تمريرها مرة واحدة تقريبا. تأكد من أن الخلايا لا تزيد عن 80٪ ملتقية.
    2. اغسل المستعمرات ب 2 مل من PBS.
    3. أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR) واحتضنه لمدة 5 إلى 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    4. استنشق GCDR وأضف 2 مل من وسط mTeRS1 مع 5 ميكرومتر من Y-27632.
    5. ماصة الخلايا بلطف لأعلى ولأسفل 10 مرات لفصل جميع المستعمرات إلى خلايا واحدة.
    6. انقل الخلايا على الأطباق المغلفة بالفيترونيكتين واحتضنها في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: قم بإجراء 1 مرور على الأقل من hIPSCs باستخدام GCDR قبل تجربة التمايز لتكييف hIPSCs مع ظروف زراعة خلية واحدة.
  2. في اليوم 0 ، اسمح ل hIPSCs بتكوين أجسام جنينية في وسط EB يحتوي على تركيز منخفض من FGF2 وتركيز عال من مثبطات الصخور اللازمة للبقاء على قيد الحياة. للقيام بذلك اتبع الخطوات أدناه.
    1. اغسل المستعمرات ب 2 مل من PBS.
    2. أضف 500 ميكرولتر من كاشف تفكك الخلايا اللطيف (GCDR) واحتضنه لمدة 5 إلى 7 دقائق عند 37 درجة مئوية.
    3. شفط GCDR وإضافة 1 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632 ؛ استخدم ماصة 1 مل لفصل الخلايا بلطف ونقلها إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
    4. شطف مرة أخرى مع 2 مل من EB المتوسطة مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632 ، ونقل الخلايا المتبقية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أضف على الفور 3 مل من وسط EB مع 50 ميكرومتر من Y-27632 إلى الأنبوب المخروطي وقم بتجانس المحلول بلطف باستخدام ماصة 5 مل.
    5. الطرد المركزي للخلايا المنفصلة عند 100 × g لمدة 5 دقائق.
    6. استنشق بلطف supernatant وأعد تعليق الخلايا في 6 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632.
    7. الطرد المركزي للخلايا في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
    8. استنشاق supernatant وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط EB مع استكمال 50 ميكرومتر من Y-27632. استخدم ماصة 1 مل لفصل الخلايا بلطف إلى تعليق أحادي الخلية.
    9. مباشرة بعد تعليق الخلايا ، قم بتمييعها وحسابها.
    10. قم بتخفيف الحجم المناسب لتعليق الخلايا (الذي يحتوي على 900000 خلية) إلى 30 مل من وسط EB مع 50 ميكرومتر من Y-27632 و 4 نانوغرام / مل من bFGF واخلط المحلول بلطف.
    11. لوحة 9000 خلية / بئر في لوحة 96U المرفقة منخفضة للغاية (300 ميكرولتر / بئر). لتجنب إزعاج تكوين EB ، احتضن اللوحة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 حتى اليوم 3 دون تغيير متوسط.
  3. الحث العصبي (تثبيط SMAD المزدوج)
    1. في اليوم 3 ، تأكد من قياس EBs 300-400 ميكرومتر وإظهار الحدود العادية. إذا تم الوصول إلى كلا المعيارين ، فاستبدل نصف الوسط (150 ميكرولتر) بوسط تحريضي -1 يحتوي على مثبطات SMAD المزدوجة ، مما يؤدي إلى سطوع محيط EBs بحلول اليوم 6 إلى اليوم 7 مما يشير إلى التمايز العصبي الخارجي للأدمة (الجدول التكميلي 2).
    2. في اليوم 4 ، استبدل 3/4 من الوسط (225 ميكرولتر) بوسط الحث -1.
    3. في اليوم 6 واليوم 8: قم بتحديث نصف متوسط الحث -1 (150 ميكرولتر).
  4. تضمين عضوي في مصفوفة الغشاء السفلي (اليوم 10)
    1. في اليوم 10 ، أدى تضمين EBs في عامل النمو إلى تقليل مصفوفة الغشاء السفلي (BMM).
      ملاحظة: من هذه الخطوة ، استخدم دائما مقص معقم لقطع فتحة أطراف الماصة لتجنب إتلاف المواد العضوية عن طريق السحب المتكرر.
    2. أول نقل حوالي 15-17 العضوية في أنابيب مخروطية. دع EBs تستقر وتزيل الوسيط. أضف 50 ميكرولتر من الحث المتوسط-2 وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 100 ميكرولتر من BMM.
    3. انشر خليط المصفوفة-EB على وسط بئر من صفيحة شديدة الانخفاض في التركيب وافصل EBs لمنعها من الانصهار.
    4. دع BMM يتصلب في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
    5. أضف 3 مل من متوسط الحث -2 في كل بئر وضع اللوحة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: تأكد من أن هذا الإجراء يتم في أسرع وقت ممكن حيث يتصلب BMM في درجة حرارة الغرفة.
  5. الثقافة الثابتة للعضويات المضمنة في مصفوفة الغشاء السفلي
    1. اليوم 12 ، 14: تحديث الحث المتوسط-2.
    2. اليوم 16: تحديث الحث المتوسط-2 والتحقق تحت المجهر من توسع الحلقات الظهارية العصبية.
  6. تفكك مصفوفة الغشاء السفلي وثقافتها على شاكر مداري
    1. في اليوم 17 ، قم بفصل المواد العضوية عن BMM عن طريق السحب لأعلى ولأسفل 10 مرات باستخدام ماصة 5 مل ونقلها إلى وسط التمايز -1 (بدون فيتامين أ). احتضن على شاكر مداري عند 80 دورة في الدقيقة في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 لتحسين الامتصاص الغذائي.
      ملاحظة: استخدم حاضنة مختلفة للزراعة الثابتة والثقافة على شاكر مداري لتجنب أي اهتزازات ضارة بنمو خلايا hIPS الملتصقة.
    2. اليوم 19: تحديث التمايز المتوسط-1.
    3. اليوم 21: تغيير وسط التمايز -1 إلى وسط التمايز -2 (مع فيتامين أ).
    4. من اليوم 23 إلى اليوم 35: تحديث الوسط مع وسط التمايز -2 كل 2-3 أيام.
    5. من اليوم 35 إلى اليوم 70: تحديث التمايز المتوسط-2 مع 1٪ BMM وتحديث كل 2-3 أيام.
    6. جمع المواد العضوية بعد 28 و 42 و 70 +/- يومين من التمايز وإصلاحها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ، في 5 مل 4 ٪ PFA على أنبوب مخروطي 15 مل.
    7. لمزيد من المعلومات في تحليل التلطيخ المناعي المتطاير أو العائم الحر ، يتم شطف المواد العضوية مرتين في PBS وحفظها عند 4 درجات مئوية في PBS + 0.05٪ من أزيد الصوديوم.
    8. لتحليل التلطيخ المناعي على الأقسام المجمدة ، اغمر 4٪ من المواد العضوية الثابتة PFA في 10 مل 30٪ من السكروز عند +4 درجة مئوية (أو حتى تغرق المواد العضوية). قم بتضمينها في مصفوفة تضمين مجمدة وتخزينها على درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى التقسيم بالتبريد.

3. في toto المناعي ، والمقاصة ، والحصول على ورقة الضوء من المواد العضوية الظهرية في الدماغ الأمامي

  1. تثبيت
    1. جمع المواد العضوية في لوحات 6 آبار ، وإزالة الوسط ، وإصلاحها مع 2 مل من PFA 4 ٪ ، في 4 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    2. قم بإجراء ثلاث غسلات في 2 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة.
    3. انقل المواد العضوية إلى أنابيب 2 مل وخزنها عند 4 درجات مئوية في 2 مل من PBS + 0.05٪ من أزيد الصوديوم.
  2. النفاذية
    1. احتضان المواد العضوية في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2٪ Triton X100 في RT لمدة 1 ساعة. افعل ذلك مرتين.
    2. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Triton X100 و 20 ٪ DMSO ، عند 37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    3. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.1 ٪ Tween20 ، 0.1 ٪ Triton X100 ، 0.1 ٪ Deoxycholate ، 0.1 ٪ NP40 و 20 ٪ DMSO ، عند 37 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    4. احتضان في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Triton-X100 ، في RT ، لمدة 1 ساعة. افعل ذلك مرتين.
  3. الحجب ووضع العلامات المناعية
    1. كتلة في 1 مل من محلول الحجب (PBS ، 0.2 ٪ Triton X100 ، 6 ٪ مصل الحمار ، 10 ٪ DMSO) ، في 37 درجة مئوية ، على.
    2. احتضان مع الأجسام المضادة الأولية المخففة في 250 ميكرولتر من PBS ، 0.2 ٪ Tween20 ، 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، 5 ٪ DMSO و 3 ٪ مصل الحمار ، عند 37 درجة مئوية ، لمدة يومين.
    3. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، لمدة 1 ساعة ، عند 37 درجة مئوية. افعل ذلك أربع مرات.
    4. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، بين عشية وضحاها ، عند 37 درجة مئوية.
    5. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المخففة في 250 ميكرولتر من PBS تحتوي على 0.2 ٪ Tween 20 ، 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين و 3 ٪ مصل الحمار ، عند 37 درجة مئوية ، لمدة يومين.
    6. يغسل في 1 مل من PBS التي تحتوي على 0.2٪ Tween 20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، لمدة 1 ساعة ، على عجلة ، في RT. افعل ذلك أربع مرات.
    7. يغسل في 1 مل من PBS تحتوي على 0.2٪ Tween 20 و 0.1 ميكروغرام / مل من الهيبارين ، بين عشية وضحاها ، على عجلة ، في RT.
    8. يغسل في 1 مل من PBS ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    9. يخزن عند +4 درجة مئوية في 1 مل من PBS و 0.05٪ من أزيد الصوديوم حتى المقاصة.
  4. المقاصة في TDE (2,2′ -ثيوديثانول)
    1. احتضان المواد العضوية في 1 مل من 30٪ TDE (3 مل من TDE + 7 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    2. احتضان في 1 مل من 60٪ TDE (6 مل من TDE + 4 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
    3. احتضان في 1 مل من 80٪ TDE (8 مل من TDE + 2 مل من PBS) ، لمدة 24 ساعة ، في RT.
  5. التضمين العضوي قبل الحصول على ورقة الضوء
    ملاحظة: استخدام نظام حسب الطلب؛ مصنوعة من حقنة 1 مل مع قطع الطرف مع مشرط.
    1. تحضير 100 مل من 4٪ Agarose منخفض الذوبان في محلول TDE 60٪ و aliquot في أنابيب 2 مل. يحفظ عند +4 درجة مئوية.
    2. قبل التضمين العضوي ، قم بتسخين أنبوب واحد يحتوي على 1.5 مل من الأغاروز منخفض الذوبان بنسبة 4٪ في 60٪ TDE في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يسيل .
    3. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد نظام صب مصنوع خصيصا من حقنة 1 مل يتم قطع طرفها باستخدام مشرط.
    4. ضخ في حقنة 600 ميكرولتر من محلول هلام باستخدام المكبس.
    5. ضع العينة باستخدام طرف ماصة موسع تم قطع فتحته باستخدام مقص معقم.
    6. املأ المحقنة ب 400 ميكرولتر من محلول الجل بحيث يتم وضع العينة داخل الثلث السفلي من المحقنة.
    7. دع الجل يتبلمر ويخزن في محلول TDE بنسبة 80٪ عند 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى الاكتساب.
    8. للحصول على ورقة الضوء ، استخدم هدفا 20x مغمورا في محلول TDE بنسبة 80٪ المضاف في غرفة العينة للسماح بالتكيف بدقة مع معامل الانكسار لطريقة المقاصة.
    9. أدخل المحقنة التي تحتوي على الأغاروز العضوي المدمج في أكبر حامل عينة مصمم لاستيعاب حقنة 1 مل يمكن تشغيل مكبس منها لوضع العضو أمام الهدف.
      ملاحظة: يستغرق الحصول على ورقة خفيفة من عضوي كامل حوالي 5 إلى 10 دقائق.

4. تلطيخ مناعي وتطهير الأجزاء العائمة الحرة من عضويات الدماغ الأمامي الظهرية

  1. تثبيت، تضمين الأغاروز، وتقسيم المواد العضوية
    1. جمع المواد العضوية بعد 28 و 42 و 70 +/- يومين من التمايز في لوحة من 6 آبار وتثبيتها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في 2 مل من 4٪ PFA.
    2. شطف مرتين في 2 مل من PBS والحفاظ عليها في 4 درجة مئوية في 2 مل من PBS + 0.05 ٪ أزيد الصوديوم.
    3. قم بتضمين المواد العضوية الثابتة في 4٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في قالب تضمين بلاستيكي (7 × 7 مم). قم بإزالة كتلة الأغاروز بعناية من القالب البلاستيكي ولصقها على مرحلة الاهتزاز.
    4. قسم المواد العضوية المضمنة باستخدام اهتزاز للحصول على مقاطع 150 ميكرومتر حرة عائمة يتم نقلها في بئر من صفيحة 24 بئرا تحتوي على 500 ميكرولتر من PBS باستخدام فرشاة طلاء لتجنب إتلاف الأقسام.
      ملاحظة: يوصى باستخدام الأغاروز منخفض الانصهار لأن درجة حرارة انصهاره تبلغ حوالي 60 درجة مئوية فقط. تحضير 4٪ من الأغاروز منخفض الذوبان في محلول PBS واتركه ليبرد فوق 37 درجة مئوية في حمام مائي قبل التضمين العضوي.
  2. التخلل والحجب والتلطيخ المناعي
    1. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 0.3٪ Triton X100 ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك ثلاث مرات.
    2. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS التي تحتوي على 0.3 ٪ Triton X100 و 5 ٪ حليب خالي الدسم ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 2 ساعة.
    3. احتضان الأقسام في 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية (PBS + 0.3 ٪ Triton X100 + 1 ٪ حليب خالي الدسم) ، تحت الإثارة ، عند +4 درجة مئوية ، بين عشية وضحاها.
    4. اغسل الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك أربع مرات.
    5. احتضان الأقسام في 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي (PBS + 0.3 ٪ Triton X100 + 1 ٪ حليب خالي الدسم) ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 2 ساعة.
    6. اغسل الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، في RT ، تحت الإثارة ، لمدة 20 دقيقة. افعل ذلك أربع مرات.
    7. قم بتخزين الأقسام في 500 ميكرولتر من PBS ، عند +4 درجة مئوية حتى التطهير.
  3. المقاصة في TDE (2,2′ -ثيوديثانول)
    1. احتضان الأقسام في 500 ميكرولتر من 30٪ و 60٪ TDE لمدة 1 ساعة لكل منها في RT ، ثم في 500 ميكرولتر من 80٪ TDE بين عشية وضحاها ، في RT.
    2. قم بتخزين الأقسام التي تم تطهيرها في 500 ميكرولتر من 80٪ TDE حتى الاستحواذ عند +4 درجة مئوية.
  4. تركيب المقاطع العائمة بحرية قبل الاستحواذ باستخدام المسح البؤري الرنانة
    1. قم بتركيب قسم عائم حر في غرفة مغلقة تمكن من الحفاظ على العينة في محلول TDE بنسبة 80٪ ومصممة للتكيف مع مرحلة XY الآلية من المجاهر البؤرية.
    2. ضع غطاء دائريا واحدا في نظام الغرفة.
    3. انقل بعناية القسم المناعي الذي تم مسحه باستخدام فرشاة الطلاء.
    4. املأ الغرفة بمحلول TDE بنسبة 80٪.
    5. أضف اثنين من أغطية الغطاء القياسية بالإضافة إلى غطاء دائري ثان واحد وختم سيليكون.
    6. المسمار على حلقة الشد من الغرفة لختم النظام تماما.

5. ورقة الضوء والمسح الرنانة تحليل البؤري

  1. معالجة ورقة الضوء وعمليات الاستحواذ على المسح الضوئي الرنانة باستخدام البرامج التي تمكن من تصور 3D وتحليل العينة المناعية بأكملها.
    ملاحظة: يسمح هذا البرنامج بفتح البيانات الضخمة بسرعة لعمل لقطات ورسوم متحركة بسهولة. يسمح بنقل العينة في اتجاهات مختلفة وإنشاء طرق عرض 2D بفضل أداة تقطيع طرق العرض 2D في اتجاهات مختلفة ، XY و YZ على سبيل المثال.
  2. للكشف التلقائي عن كل من الجسيمات المركزية والأهداب الأولية ، استخدم معالج موضعي يتيح تحديد عددها في الظروف المرضية مقابل ظروف التحكم.
  3. لإعادة بناء 3D للكمبيوتر الشخصي مما يتيح قياسا دقيقا لطولها ، استخدم معالج خيوط لإصلاح نقطة انطلاق الكمبيوتر يدويا ويستخدم البرنامج إشارة التألق لإعادة بناء الكمبيوتر بدقة.

النتائج

نماذج 2D hIPS القائمة على الخلايا لدراسة التخلق الحيوي الأولي للسيليوم ووظيفته
تم تكييف البروتوكول المفصل هنا من الدراسات المنشورة سابقا20،21،22. يسمح هذا البروتوكول بتوليد هياكل وردة عصبية تحتوي على أسلاف قشرة جديدة وخلايا عصبية ...

Discussion

يعتبر الكمبيوتر الشخصي الآن عضيات رئيسية تنظم الخطوات الحاسمة أثناء التطور القشري الدماغي الطبيعي18،19،31 بما في ذلك توسيع NSPC والالتزام 8،9،10،11،12 وكذلك الهجرة العصبية13،14 وتكوين التشابك

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من الوكالة الوطنية للبحوث (ANR) إلى S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) و N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 و ANR-19-CE16-0002-01). يتم دعم LB من قبل ANR في إطار برنامج Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) ومؤسسة Bettencourt Schueller (برنامج MD-PhD). يتم دعم معهد Imagine بتمويل حكومي من ANR في إطار برنامج Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01 ، مشاريع CrossLab) وكجزء من برنامج Investissements d'Avenir الثاني (ANR-17-RHUS-0002).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

References

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181 cilium hIPSCs hIPSC 2D 3D

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved