2D 및 3D 인간 유도 만능 줄기 세포 기반 모델은 신코르티컬 개발 중 1 차용성 개입을 해부합니다.

요약

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

초록

1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.

서문

1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관^이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 ^8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인....

프로토콜

1. 신피성 발달의 2D hIPS 세포 기반 모델의 생성

1. 신경 로제트 형성
   1. 큰 일반 식민지를 품고 있는 hIPSC 문화로 시작하여 10% 미만의 차별화와 80% 이상의 인플루엔자를 전시합니다.
   2. PBS2mL로 hIPSC를 헹구세요.
   3. 바위 억제제 (NIM + Y-27632의 10 μM)로 보충 된 NSPC 유도 매체2 mL을 추가합니다.
   4. 바늘을 사용하여 각 hIPSC 콜로니를 35mm 접시에서 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 절단하여 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누는 체커 보드 패턴을 만듭니다.
   5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
   6. 배아 체(EBs)를 형성할 수 있도록 37°C 및 5% _CO2의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오.
      참고: 배아 체(EB)는 부동 스페로이드 클러스터 또는 hIPSC의 집합체로 정의됩니다.
   7. 2mL NIM + Y-27632의 10 μM에서 폴리 L-ornithine/laminin(PO/laminin)으로 EB를 전송합니다.
   ....

결과

2D hIPS 세포 기반 모델은 1 차 적인 실륨 생물 발생 및 기능을 연구합니다
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 연구에서 ^20,21,22로 조정되었습니다. 이 프로토콜은 개발 신피질에서 보인 것과 유사한 신피성 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 특정 제조?.......

토론

PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다^{18,9,10,11,12}뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션^13,14 및.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)	ThermoFisher Scientific	31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate	Corning	7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	ThermoFisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (50X), serum free	ThermoFisher Scientific	17504044
CellAdhere Dilution Buffer	StemCell Technologies	7183
DMEM/F-12, Glutamax	ThermoFisher Scientific	31331028
DMSO	ATCC	4-X
Dorsomorphin	StemCell Technologies	72102
Easy Grip 35 10mm	Falcon	353001
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020
EGF , 25µg	Thermofischer	PHG0315
FGF2 , 25µg	Thermofischer	PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent	StemCell Technologies	7174
Insulin	ThermoFisher Scientific	12585014
KnockOut Serum	ThermoFisher Scientific	10828028
Laminin (1mg)	Thermofischer	23017015
LDN193189	StemCell Technologies	72147
Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381-250G
mTeSR1	StemCell Technologies	85850
Neural Basal Medium	Thermofischer	21103049
Orbital shaker	Dutscher	995002
PBS	ThermoFisher Scientific	14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PFA 32%	Electron Microscopy Sciences	15714
Poly-L-Ornithine (PO)	Sigma	P4957
Recombinant human BDNF 10 µg	Stem Cell Technologies	78005
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
rSHH	R&D Systems	8908-SH
SAG	Santa Cruz	Sc-202814
SB431542	StemCell Technologies	72232
Stembeads FGF2	StemCulture	SB500
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Supplément N2- (100X)	ThermoFisher Scientific	17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol	Sigma Aldrich	166782-500G
Vitronectin	StemCell Technologies	7180
Y-27632	StemCell Technologies	72304
Primary Antibodies
ARL13B	Abcam	Ab136648	1/200e
ARL13B	Proteintech	17711-1-AP	1/500e
CTIP2	Abcam	Ab18465	1/500e
GLI2	R&D Systems	AF3526	1/100
GPR161	Proteintech	13398-1-AP	1/100
N-Cadherin	BD Transduction Lab	610921	1/500e
P-Vimentin	MBL	D076-3	1/500e
PAX6	Biolegend	PRB-278P	1/200e
PCNT	Abcam	Ab4448	1/1000e
S0X2	R&D Systems	MAB2018	1/200e
SATB2	Abcam	Ab51502	1/200e
TBR2	Abcam	Ab216870	1/400e
TPX2	NovusBio	NB500-179	1/500e
γTUBULIN	Sigma Aldrich	T6557	1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher Scientific	A21206	1/500e
Goat anti-mouse AF555	ThermoFisher Scientific	A21422	1/500e
Goat anti-mouse AF647	ThermoFisher Scientific	A21236	1/500e
Goat anti-rat AF555	ThermoFisher Scientific	A21434	1/500e