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요약

당사는 2D 및 3D 인간 유도 다능성 줄기세포(hIPSC)의 생성 및 특성화에 대한 상세한 프로토콜뿐만 아니라 1차 실슘(PC) 생체 발생 및 기능의 질적 및 정량적 분석을 가능하게 하는 보완적 방법론을 제시합니다.

초록

1차 섬모(PC)는 대부분의 포유류 세포의 표면에서 튀어나온 비운동적 동적 마이크로투룰계 세포기관이다. 그(것)들은 세포 주기의 G1/G0 단계 도중 오래된 중심에서 나타나고, 세포가 G2/M 상 경계에서 세포 주기를 다시 입력할 때 분해하는 동안. 그들은 많은 세포 프로세스에 중요한 세포 외 신호를 감지하고 변환하여 신호 허브로 작동합니다. 대부분의 세포 유형과 유사하게, 모든 신코르티칼 신경줄기 및 전구 세포(NSPC)는 정상 뇌피질 발달에 필요한 특정 신호를 감지하고 변환할 수 있도록 PC를 수용하는 것으로 나타났습니다. 여기서, 신피성 발달 시 PC의 참여를 더욱 해부하기 위해 인간 유도 만능 줄기 세포(hIPSC)로부터 2차원(2D) 및 3차원(3D) 세포 기반 모델을 생성하고 특성화하는 상세한 프로토콜을 제공합니다. 특히 소닉 고슴도치(SHH) 경로의 트랜스듀션을 포함한 2D 신경 로제트 유래 NSPC에서 PC 생체 발생 및 기능을 연구하는 프로토콜을 제시합니다. 대뇌 오르가노이드의 3차원(3D) 조직을 활용하기 위해 토토 면역스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을 위한 간단한 방법을 설명합니다. 광학 클리어링 후, 전체 오르가노이드를 빠르게 획득하면 전체 오르가노이드의 신코르테컬 전구및 뉴런에서 센트로좀과 PC를 모두 검출할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 3D 공간 정보의 상당한 정도를 보존하고 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 질적 및 정량적 분석에 필요한 고해상도 획득을 허용하는 두꺼운 자유 부동 오르가노이드 섹션의 면역 염색 및 청산 절차를 자세히 설명합니다.

서문

1차 섬모(PC)는 세포외 환경에서 과다한 화학 및 기계적 단서를 감지하고 트랜스포우하는 마이크로투벨계 세포기관입니다. 특히, PC는 척추동물에서 고슴도치 신호 경로의 침투를 위한 중앙 세포기관이다1,2. 대부분의 신경 세포는 오랫동안 PC를 품고 있는 것으로 나타났지만, 중추 신경계를 형성하는 이 세포기관의 기여는 오랫동안 저평가되어 왔습니다. 신구체 발달에 대한 연구는 여러 신경 줄기와 전구 세포 (NSPC)의 발견으로 이어졌으며, 모두 PC를 수용하고 있으며, 그 위치는 선조 운명 결정에 매우 중요하다고 제안되었습니다3,4,5,6,7. PC는 NSPC 확장 및 약정 8,9,10,11,12뿐만 아니라 신경 마이그레이션을 지원하는 방사형 신경교질 비계의 apicobasal 극성을 포함하여 정상적인 뇌 피질 개발에 필요한 세포 메커니즘에 중요한 것으로 나타났습니다13. 또한, PC는 피질 판14,15로의 접선 간 이동 중에 요구된다. 마지막으로, 대뇌 피질16,17에 있는 뉴런의 시냅스 연결의 확립에서 PC에 대한 역할이 제안되었습니다. 전부, 이 사실 인정은 대뇌 피질 발달의 중요한 단계에서 PC의 중요한 역할을 주장하고 뇌성 피질 발달의 근본적인 병리학 기계장치에 그들의 관여를 조사할 필요를 제기합니다.

최근 연구는 인간 모델과 동물 모델의 피질 발달 사이의 중요한 세포 및 분자 차이에 대한 이해를 크게 향상시켜 인간 모델 시스템을 개발할 필요성을 강조했습니다. 이 보기에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포 (hIPSCs)는 관련 유전 및 세포 맥락에서 질병 병발생을 연구하는 유망한 접근을 나타냅니다. 부착 된 2 차원 (2D) 세포 기반 모델 또는 신경 로제트는 개발 대뇌 피질에서 볼 수있는 것과 유사한 NSPC를 포함, 이는 올바른 apicobasal 극성을 보여주는 로제트 모양의 구조로 조직된다20,21,22. 더욱이, 3차원(3D) 배양 시스템은 인간 뇌피질 발달의 많은 특징을 재구성하는 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성을 가능하게 한다23,24,25,26. 이 두 가지 보완적인 세포 기반 모델링 접근법은 대뇌 피질의 정상 및 병리학 적 발달 중에 PC의 참여를 해부하는 흥미로운 관점을 제공합니다.

여기에서는 신경 로제트및 파생 된 NSPC뿐만 아니라 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성 및 특성화를위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 또한 소닉 고슴도치 통로의 전도를 테스트하고 이 경로에 관련된 중요한 분자의 역학을 분석하여 NSPC에 존재하는 PC의 생체 발생 및 기능을 분석하기 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 대뇌 오르가노이드의 3D 조직을 활용하기 위해, 우리는 또한 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 전체 오르가노이드의 가벼운 시트 현미경 덕분에, 빠른 취득을 허용하는 토토 면역 스테인드 대뇌 오르가노이드의 3D 이미징을위한 간단하고 비용 효율적인 방법을 설정, 고해상도와 전장기의 뉴런의 모든 유형에 PC를 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 150μm 자유부동 구간에 면역조직화학을 적용하여 공진스캐닝 공초점 현미경을 사용하여 후속 개간 및 획득을 통해 PC 생체 발생 및 기능의 상세한 분석에 필요한 고해상도 이미지 수집을 가능하게 했습니다. 구체적으로, 3D 이미징 소프트웨어는 PC의 길이, 수 및 방향을 포함한 형태학적 매개변수의 후속 분석과 함께 PC의 3D 재구성뿐만 아니라 축사메를 따라 섬모 구성 요소의 신호 강도 측정을 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 신피성 발달의 2D hIPS 세포 기반 모델의 생성

  1. 신경 로제트 형성
    1. 큰 일반 식민지를 품고 있는 hIPSC 문화로 시작하여 10% 미만의 차별화와 80% 이상의 인플루엔자를 전시합니다.
    2. PBS2mL로 hIPSC를 헹구세요.
    3. 바위 억제제 (NIM + Y-27632의 10 μM)로 보충 된 NSPC 유도 매체2 mL을 추가합니다.
    4. 바늘을 사용하여 각 hIPSC 콜로니를 35mm 접시에서 수동으로 해부하여 각 식민지를 수평 및 수직 방향으로 정확하게 절단하여 각 식민지를 동일한 클러스터로 나누는 체커 보드 패턴을 만듭니다.
    5. 세포 스크레이퍼를 사용하여 식민지를 분리하고 초저 부착 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
    6. 배아 체(EBs)를 형성할 수 있도록 37°C 및 5% CO2의 가습 인큐베이터에서 하룻밤 동안 떠있게 하십시오.
      참고: 배아 체(EB)는 부동 스페로이드 클러스터 또는 hIPSC의 집합체로 정의됩니다.
    7. 2mL NIM + Y-27632의 10 μM에서 폴리 L-ornithine/laminin(PO/laminin)으로 EB를 전송합니다.
    8. 매일 침고 NSPC 유도 매체 (Y-27632없이 NIM) 약 12 ~ 14 일이 걸리는 신경 로제트의 형성까지. 현미경으로 확인하십시오.
      참고: 이 단계 후에 신경 로제트는 분리된 신경 줄기 및 전구 세포 (NSPC)를 얻기 위하여 면역 염색 분석 또는 해리를 위해 확장, 분화 및 처리될 수 있습니다.
  2. 신경 장미 팽창 및 조기 분화
    1. 바늘로 격자 모양의 패턴으로 신경 로제트를 자르고 세포 스크레이퍼를 사용하여 클러스터를 제거합니다.
    2. 로제트를 NSPC 유지 보수 매체(NMM)의 0.5mL에서 PO/lam 코팅 유리 커버슬립(4-5 로제트/웰)을 포함하는 4웰 플레이트로 옮겨 넣습니다.
    3. 37°C 및 5% CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 플레이트를 배양합니다.
    4. 20일까지 매일 NMM을 새로 고칩니다.
    5. 20일부터 0.5mL의 사이토카인의 배양 신경 로제트는 NMM을 고갈하여 분화를 허용했습니다. 매 2-3 일 마다 매체를 새로 고칩니다.
    6. 30일차와 40일(분화 10일 또는 20일)에 0.5mL의 PFA, 20분, RT로 로제트를 수정합니다.
  3. 고립된 NSPC에 대한 PC 생체 발생 및 기능 분석
    1. NSPC 해리
      1. 바늘을 가진 격자 모양의 패턴에서 1.1.8 단계에서 신경 로젯을 자르고 세포 스크레이퍼를 사용하여 클러스터를 제거합니다. 세포를 NMM 2mL로 PO/lam 코팅 35mm 요리로 옮기고 37°C 및 5% CO2에서 가습된 인큐베이터에서 인큐베이션을 합니다.
      2. NMM을 수렴할 때까지 격일로 새로 고칩니다(약 5-7일).
      3. 신경 장미를 둘러싼 크고 맑은 세포를 긁어 낸 후 수동으로 선택하고 NSPC를 풍부하게하고 비 신경 세포 유형을 고갈시키기 위해 신선한 PO / lam 코팅 35mm 접시에 옮겨 넣습니다.
      4. 모든 오염 세포 유형을 제거하는 데 필요한 하나 또는 두 개의 수동 통로(필요한 경우 반복 단계 1.3.1.3)를 한 후, 중간을 제거하고 PBS로 헹구는 다.
      5. 대부분의 세포가 분리될 때까지 300 μL00%의 트립신을 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      6. 트립신을 비활성화하려면 10% FBS(DMEM + 10% FBS)를 포함하는 매체2mL을 추가합니다. 15 mL 원상 관에서 셀 서스펜션을 수집합니다. 셀 서스펜션을 세 번 위아래로 부드럽게 피펫하여 세포 덩어리를 분해합니다.
      7. 300 x g 의 원심분리기는 5분 동안.
      8. 조심스럽게 슈퍼 내를 흡인하고 NMN에서 세포를 다시 중단합니다.
      9. NMM에서 단일 세포(1 x 105 셀/cm2)로 해리된 NSPC를 PO/lam 코팅 된 접시에 시드하고 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에서 배양하십시오.
      10. 매일 매체를 변경하여 NMM에서 NSPC를 확장합니다.
        참고: NSPC는 차별화를 피하기 위해 고밀도로 시드됩니다.
    2. PC 생물발생 분석
      1. 종자 100,000 세포 /cm2 에서 NSPC를 해리하고 2 일 동안 NMM에서 37 °C 및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 배양합니다.
      2. 48h에 대한 세포카인 고갈 매체(NSPC 기아 매체, 보충표 1)에서 배지및 굶주린 NSPC를 흡인한다.
      3. RT에서 20분 동안 4%의 PFA로 NSPC를 수정합니다.
      4. 면역 염색 하기 전에 RT에서 5 분 동안 PBS와 함께 두 번 세척.
    3. PC 기능 분석: SHH 시그널링 경로
      1. 종자 해리 NSPC는 PO/lam 코팅 된 8 웰 챔버 슬라이드 (300 μL) 또는 T25 접시 (5 mL)에 100,000 세포 / cm2 에서 CPC를 분리하고 2 일 동안 NMM에서 37 ° C및 5 % CO2 에서 가습 된 인큐베이터에서 배양합니다.
      2. NSPC 기아 매체(8웰 챔버 슬라이드의 웰당 300 μL, T25 플라스크5mL)에서 48h에 굶주린 NSPC.
      3. SHH 통로를 유도하기 위하여는, 재조합 SHH (100 ng/mL) 또는 SAG (500 nM)로 보충된 기아 매체로 NSPC를 배양합니다; (8웰 챔버 슬라이드의 웰당 150 μL, T25 플라스크2mL).
      4. 8웰 챔버 슬라이드에서 250 μL의 250 μL에서 RT에서 20분 동안 250μL로 배양된 NSPC를 수정하고 면역 염색 분석 전에 RT에서 5분 동안 250 μL의 PBS로 두 번 세척합니다.
      5. PBS로 T25 접시에서 배양된 중간 식NSPC를 제거하고 세척합니다.
      6. 세포가 분리될 때까지 500 μL의 0.05% 트립신을 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다.
      7. 트립신을 비활성화하고 15 mL 원추형 튜브에서 세포 현탁액을 수집하기 위해 10 % FBS (DMEM + 10 % FBS)를 포함하는 배지 2 mL을 추가합니다.
      8. 원심분리기는 300 x g 에서 5분 동안 조심스럽게 슈퍼나탄을 흡인하여 RNA 추출 및 RT-PCR 분석 전에 -80°C에서 냉동보존될 수 있는 NSPC 펠릿을 획득한다.

2. 등쪽 전뇌 오르가노이드의 생성

  1. hIPSC의 단세포 배양
    1. 10% 미만의 차별화를 나타내는 대규모 일반 식민지를 수용하는 hIPSC 문화로 시작하여 거의 한 번 통과되었습니다. 세포가 80% 이하의 컨할 수 없는지 확인합니다.
    2. PBS의 2mL로 식민지를 씻으시다.
    3. 젠틀 셀 해리 시약 (GCDR)의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 5 ~ 7 분 동안 배양하십시오.
    4. GCDR을 흡인하고 Y-27632의 5 μM으로 보충된 mTeRS1 배지 2mL를 추가합니다.
    5. 파이펫 세포를 부드럽게 위아래로 10 번 하여 모든 식민지를 단일 세포로 해리시합니다.
    6. 비트론틴 코팅 접시에 세포를 옮기고 37°C 및 5% CO2에서 가습된 인큐베이터에서 배양한다.
      참고: hIPSC를 단일 세포 배양 조건에 적응하기 위해 분화 실험 전에 GCDR을 사용하여 hIPSC의 적어도 1개의 통과를 수행한다.
  2. 0일째에, hIPSC는 hIPSC 생존을 위해 요구되는 FGF2의 낮은 농도 및 고농도암 억제제를 포함하는 EB 매체에서 배아 체를 형성하는 것을 허용합니다. 이렇게하려면 아래 단계를 따르십시오.
    1. PBS의 2mL로 식민지를 씻으시다.
    2. 젠틀 셀 해리 시약 (GCDR)의 500 μL을 추가하고 37 ° C에서 5 ~ 7 분 동안 배양하십시오.
    3. GCDR을 흡인하고 Y-27632의 50 μM로 보충된 EB 배지 1mL을 추가합니다. 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 부드럽게 분리하고 15mL 원추형 튜브로 옮겨넣습니다.
    4. Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지 2mL로 다시 한 번 헹구고, 나머지 세포를 15mL 원추형 튜브로 이송한다. 즉시 원추형 튜브에 Y-27632의 50 μM로 보충 된 EB 매체 3mL을 추가하고 부드럽게 5mL 파이펫을 사용하여 용액을 균질화합니다.
    5. 5 분 동안 100 x g 에서 해리 된 세포를 원심 분리합니다.
    6. 슈퍼나탄을 부드럽게 흡인시키고 Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지의 6mL에서 세포를 재연한다.
    7. 세포를 100 x g 에서 5 분 동안 원심 분리합니다.
    8. 슈퍼나탄을 흡인시키고 Y-27632의 50 μM으로 보충된 EB 배지의 1mL에서 세포를 재연한다. 1mL 파이펫을 사용하여 세포를 단일 셀 서스펜션으로 부드럽게 해리시합니다.
    9. 세포를 다시 중단한 직후 희석하고 계산합니다.
    10. 적절한 양의 세포 현탁액(900,000세포 함유)을 Y-27632의 50 μM 및 bFGF의 4 ng/mL로 보충한 EB 배지30mL로 희석하고 용액을 부드럽게 혼합합니다.
    11. 9,000개의 셀/웰을 초저 부착 96U 플레이트(300 μL/well)로 플레이트합니다. EB 형성을 방해하지 않으려면 중간 변화 없이 3일까지 37°C및 5% CO2 에서 가습된 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
  3. 신경 유도 (듀얼 SMAD 억제)
    1. 3일째에, EB가 300-400 μm을 측정하고 일반 테두리를 표시하도록 보장합니다. 두 기준모두에 도달하면, 배지의 절반을 이중 SMAD 억제제를 함유하는 유도 매체-1로 교체하여 6일째부터 7일까지 EB의 윤곽을 밝게 하여 신경 절제술 분화를 나타낸다(보충표 2).
    2. 4일째에, 배지(225 μL)의 3/4를 유도 중간-1로 바꿉니다.
    3. 6일째와 8일째: 유도 중간-1(150 μL)의 절반을 새로 고칩니다.
  4. 지하 막 매트릭스에 내장 된 오르간 (10 일)
    1. 10일째에, 성장인자에 EB를 포함하여 지하 막 매트릭스(BMM)를 감소시킵니다.
      참고: 이 단계에서는 항상 멸균 가위를 사용하여 파이펫 팁의 개구부를 잘라 서 반복된 파이펫팅으로 오르가노이드가 손상되지 않도록 하십시오.
    2. 원물 튜브에서 15-17 개의 오르가노이드를 처음 옮기십시오. EB가 정착하여 매체를 제거하도록 합니다. 유도 중간-2의 50 μL을 추가하고 BMM의 100 μL을 포함하는 미세 원심 분리기 튜브로 전송합니다.
    3. 매트릭스-EB 혼합물을 초저 부착 플레이트의 우물 중앙에 펴고 EB를 분리하여 융합을 방지합니다.
    4. BMM이 인큐베이터에서 37°C에서 45분 동안 고성화하게 하십시오.
    5. 각 우물에 유도 매체-2의 3mL을 추가하고 37 °C 및 5 % CO2에서 가습 된 인큐베이터에 플레이트를 넣습니다.
      참고: BMM이 실온에서 고형화될 때 이 절차가 가능한 한 빨리 수행되는지 확인합니다.
  5. 지하 막 매트릭스에 내장 된 오르가노이드의 고정 문화
    1. 12일, 14일: 상쾌 유도 중간-2.
    2. 16일: 유도 중간-2를 새로 고치고 현미경으로 신경상피성 루프의 확장을 확인하십시오.
  6. 궤도 셰이커의 지하 멤브레인 매트릭스 해리 및 문화
    1. 17일, BMM의 오르가노이드를 5mL 파이펫으로 10회 위아래로 피펫으로 분리하여 비타민 A 없이 차별화 매체-1로 옮기습니다. 영양 흡수를 향상시키기 위해 37°C및 5% CO2 의 가습 된 인큐베이터에서 80 rpm의 궤도 셰이커에 배양하십시오.
      참고: 고정된 배양및 배양에 대해 다른 인큐베이터를 사용하여 궤도 셰이커에 부착된 hIPS 세포 성장에 해로운 진동을 방지합니다.
    2. 19일: 비리 차별화 중간-1을 새로 고칩니다.
    3. 21일: 분화 중간-1을 분화 중간-2(비타민 A)로 변경합니다.
    4. 23일부터 35일까지: 2~3일마다 차별화 매체-2로 배지를 새로 고칩니다.
    5. 35일부터 70일까지: 1%의 BMM로 차별화 중간-2를 새로 고치고 2-3일마다 새로 고칩니다.
    6. 28, 42 및 70 +/- 2일 분화 후 오르가노이드를 수집하고 15mL 원문 튜브에 5mL 4% PFA로 4°C에서 하룻밤을 고정합니다.
    7. 토토 또는 자유 부동 면역 스테인닝 분석에서 추가로 오르가노이드는 PBS에서 두 번 헹구고 PBS + 0.05 % 나트륨 아지드에서 4 °C에서 보존됩니다.
    8. 냉동 된 섹션에 면역 염색 분석을 위해, 몰입 4% PFA 고정 오르가노이드 에 10 mL 30% 자당 +4°C ON (또는 오르가노이드 가면까지). 냉동 포함 매트릭스에 포함하 고 동결 될 때까지 -80°C에 저장합니다.

3. 토토 면역 라벨링, 클리어링 및 등쪽 전뇌 오르가노이드의 광시트 획득

  1. 고정
    1. 6웰 플레이트에서 오르가노이드를 수집하고, 배지를 제거하고, 4°C에서 4%의 PFA2mL로 하룻밤 사이에 고정한다.
    2. 실온에서 PBS의 2mL에서 세 개의 세척을 수행합니다.
    3. 오가노이드를 2mL 튜브로 옮기고 PBS + 0.05% 나트륨 아지드의 2mL에 4°C로 저장합니다.
  2. 투과성
    1. 1 h에 대 한 RT에서 0.2% 트리톤 X100을 포함 하는 PBS의 1 mL에서 유기인을 배양. 두 번 이 작업을 수행합니다.
    2. PBS의 1mL에서 0.2% 트리톤 X100 및 20% DMSO를 함유하고 있으며, 37°C에서 하룻밤 사이에 배양한다.
    3. PBS의 1mL에서 0.1% Tween20, 0.1% 트리톤 X100, 0.1% 데옥시콜린, 0.1% NP40 및 20% DMSO를 함유한 PBS의 1mL에서 하룻밤 사이에 37°C에서 배양한다.
    4. 1mL의 PBS에서 0.2% 트리톤-X100을 함유하고 있으며, RT에서 1h. 두 번 이 작업을 수행합니다.
  3. 차단 및 면역 라벨링
    1. 블로킹 용액 1mL(PBS, 0.2% 트리톤 X100, 6% 당나귀 세럼, 10% DMSO)에서 37°C, ON에서 차단한다.
    2. PBS의 250 μL, 0.2% Tween20, Heparin의 0.1 μg/mL, 5% DMSO 및 3% 당나귀 세럼, 37°C에서 2일간 희석된 1차 항체를 배양한다.
    3. 헤파린의 0.2% Tween20 및 0.1 μg/mL을 함유한 PBS의 1mL에서 1시간 동안 37°C로 세척한다. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    4. 1mL의 PBS로 세척하여 0.2% Tween20 및 0.1 μg/mL의 헤파린을 함유하고 있으며, 하룻밤 사이에 37°C에서 세척한다.
    5. PBS의 250 μL에서 희석된 이차 항체를 함유한 배양은 2일 동안 37°C에서 0.2% 트웬 20, 0.1 μg/mL, 3% 당나귀 혈청을 함유한다.
    6. HEparin의 0.2% Tween 20 및 0.1 μg/mL을 포함하는 PBS의 1mL에서 1 시간 동안, 휠에, RT에서 세척하십시오. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    7. PBS의 1mL에서 0.2% Tween 20 및 0.1 μg/mL의 헤파린을 밤새 바퀴에, RT에서 세척하십시오.
    8. PBS의 1mL에서 24 시간 동안 RT에서 세척하십시오.
    9. PBS 1mL에 +4°C, 청산전까지 0.05% 아지드 나트륨으로 재고하십시오.
  4. TDE에서 클리어링 (2,2′ -티오디에탄올)
    1. RT에서 24h에 대해 30% TDE(TDE 3mL + PBS 7mL)의 1mL에서 오르가노이드를 배양합니다.
    2. 60% TDE의 1mL (TDE의 6mL + PBS4 mL)에서 24 시간, RT에서 인큐베이션하십시오.
    3. RT에서 24h에 대해 80 % TDE (TDE 8 mL + PBS 2 mL)의 1 mL에서 배양하십시오.
  5. 라이트 시트 획득 전에 오가노이드 포함
    참고: 맞춤 제작 시스템을 사용합니다. 메스로 잘라 팁1 mL 주사기로 만든.
    1. 2mL 튜브에 60% TDE 용액과 알리쿼트로 4% 저융 아가로즈 100mL를 준비합니다. +4°C에서 보존하십시오.
    2. 오르가노이드 포함이전에는 1.5mL의 4%의 저용아가로즈를 함유한 튜브 1개를 37°C의 수조에서 60%TDE로 예열하여 액화할 때까지 예열한다.
    3. 한편, 1mL 주사기로 만든 맞춤형 성형 시스템을 준비하여 메스를 사용하여 잘라냅니다.
    4. 플런저를 사용하여 젤 용액의 주사기 600 μL에 펌프.
    5. 비늘 가위를 사용하여 절단 된 개구부를 확대 파이펫 팁을 사용하여 샘플을 배치합니다.
    6. 시료가 주사기의 낮은 3분의 1 내에 위치되도록 젤 용액의 400 μL로 주사기를 채웁니다.
    7. 겔을 폴리머로 하여 4°C에서 80% TDE 용액을 획득할 때까지 빛으로부터 보호합니다.
    8. 라이트 시트 획득의 경우 샘플 챔버에 추가된 80% TDE 솔루션에 침지된 20배 목표를 사용하여 클리어링 방법의 굴절률에 정확하게 적응할 수 있습니다.
    9. 1mL 주사기를 수용할 수 있도록 설계된 가장 큰 샘플 홀더에 아가로즈 임베디드 오르가노이드를 함유한 주사기를 삽입하여 목표 앞에 오르가노이드를 배치하도록 조작할 수 있다.
      참고: 전체 오르가노이드의 라이트 시트 획득에는 약 5~10분이 소요됩니다.

4. 등쪽 전뇌 오르가노이드의 자유 부동 부분의 면역 염색 및 제거

  1. 고정, 아가로즈 포함, 및 오르가노이드의 절편
    1. 28, 42 및 70 +/- 2일 후에 오가노이드를 6웰 플레이트에서 수집하고 4% PFA의 2mL에서 4°C에서 하룻밤을 고정합니다.
    2. PBS 2mL에서 두 번 헹구고 PBS + 0.05 % 나트륨 아지드의 2 mL에서 4 °C에서 보존하십시오.
    3. 고정 된 오르가노이드를 플라스틱 포함 금형 (7 x 7mm)에 4 % 저용 아가로즈에 포함시십시오. 조심스럽게 플라스틱 금형에서 아가로즈 블록을 제거하고 진동 단계에 접착제.
    4. 부속은 진동을 사용하여 임베디드 오르가노이드를 사용하여 섹션에 손상을 입히는 것을 방지하기 위해 페인트 브러시를 사용하여 PBS의 500 μL을 포함하는 24 웰 플레이트의 우물에서 전송된 150 μm 자유 부동 섹션을 얻습니다.
      참고: 녹는 온도는 약 60°C에 불과하기 때문에 저융 아가로즈가 권장됩니다. PBS 용액에 4% 저용해액을 준비하고 오르가노이드 를 내장하기 전에 수조에서 37°C 바로 위에 식힙니다.
  2. 투과, 차단 및 면역 염색
    1. 0.3% 트리톤 X100을 포함하는 PBS의 500 μL에서 섹션을 교반 하에 20분 동안 배양합니다. 세 번 이 작업을 수행합니다.
    2. 0.3% 트리톤 X100 및 5% 비지방 우유를 포함하는 PBS의 500 μL에서 섹션을 2 시간 동안 교반 하에 RT에서 배양합니다.
    3. 1 차 적인 항체 용액의 250 μL (PBS + 0.3 % 트리톤 X100 + 1 % 비지방 우유)의 섹션을 교반 하에 + 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
    4. PBS의 500 μL에서 섹션을 세척, RT에서, 교반에서, 20 분 동안. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    5. 이차 항체 용액의 250 μL (PBS + 0.3 % 트리톤 X100 + 1 % 무지방 우유)의 섹션을 2 시간 동안 RT에서 배양합니다.
    6. PBS의 500 μL에서 섹션을 세척, RT에서, 교반에서, 20 분 동안. 이 작업을 네 번 수행합니다.
    7. 섹션은 PBS의 500 μL에 섹션을 저장, 에서 +4° C 는 지울 때까지.
  3. TDE에서 클리어링 (2,2′ -티오디에탄올)
    1. 500 μL의 30% 및 60% TDE로 섹션을 RT에서 각각 1h에 대해 배양한 다음 RT에서 하룻밤 사이에 80% TDE의 500 μL에서 배양합니다.
    2. +4°C에서 획득할 때까지 500μL의 80% TDE로 정리된 섹션을 저장합니다.
  4. 공명 스캐닝 공초점으로 인수하기 전에 자유 부동 섹션 장착
    1. 밀봉된 챔버에 자유 부동 섹션을 장착하여 80% TDE 용액으로 샘플을 유지하고 공초점 현미경의 전동 XY 단계에 적응하도록 설계되었습니다.
    2. 챔버 시스템에 둥근 커버슬립 1개를 넣습니다.
    3. 페인트 브러시를 사용하여 지워진 면역 스테인드 섹션을 조심스럽게 전달합니다.
    4. 챔버를 80% TDE 용액으로 채웁니다.
    5. 2개의 표준 커버립과 1초 라운드 커버슬립, 실리콘 씰을 추가합니다.
    6. 완벽하게 시스템을 밀봉 챔버의 나사 링에 나사.

5. 라이트 시트 및 공명 스캐닝 공초점 분석

  1. 전체 면역스테인드 샘플의 3D 시각화 및 분석을 가능하게 하는 소프트웨어를 사용하여 라이트 시트 및 공진 스캐닝 수집을 처리합니다.
    참고: 이러한 소프트웨어를 사용하면 거대한 데이터를 빠르게 열어 스냅샷과 애니메이션을 쉽게 만들 수 있습니다. 예를 들어 다양한 방향, XY 및 YZ의 2D 슬라이서 도구 덕분에 샘플을 서로 다른 방향으로 이동하고 2D 뷰를 생성할 수 있습니다.
  2. 중추 및 기본 섬모를 자동으로 감지하려면 스팟 마법사를 사용하여 병리학적 대 제어 조건에서 해당 수를 정량화할 수 있습니다.
  3. PC의 3D 재구성을 통해 길이를 정밀하게 측정할 수 있도록 필라멘트 마법사를 사용하여 PC의 시작점을 수동으로 수정하고 소프트웨어는 형광 신호를 사용하여 PC를 정밀하게 재구성합니다.

결과

2D hIPS 세포 기반 모델은 1 차 적인 실륨 생물 발생 및 기능을 연구합니다
여기에 자세히 설명된 프로토콜은 이전에 발표된 연구에서 20,21,22로 조정되었습니다. 이 프로토콜은 개발 신피질에서 보인 것과 유사한 신피성 전구 및 뉴런을 포함하는 신경 로제트 구조물의 생성을 허용합니다. 상세한 검증은 특정 제조?...

토론

PC는 이제 NSPC 확장 및 약정을 포함하여 정상 뇌 피질 발달 18,19,31 동안 중요한 단계를 조절하는 주요 세포 기관으로 간주됩니다18,9,10,11,12뿐만 아니라 뉴런 마이그레이션13,14 및...

공개

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

감사의 말

이 작품은 S.T.(ANR-17-CE16-0003-01) 및 N.B.B.(ANR-16-CE16-0011 및 ANR-19-CE16-0002-01)에 대한 국가 국립 기관 드 라 레체쉬(ANR)의 보조금에 의해 지원되었습니다. LB는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01)과 베텐코트 슈엘러 (MD-PhD 프로그램)에서 ANR에 의해 지원됩니다. 이매진 연구소는 투자 d'avenir 프로그램 (ANR-10-IAHU-01, CrossLab 프로젝트)에 따라 ANR의 국가 자금 지원및 두 번째 인베스트먼트 d'Avenir 프로그램 (ANR-17-RHUS-0002)의 일환으로 지원됩니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

참고문헌

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

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