Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

2D ve 3D insan kaynaklı pluripotent kök hücre (hIPSC) tabanlı neokortik gelişim modellerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokollerin yanı sıra primer selyyum (PC) biyogenez ve fonksiyonunun nitel ve nicel analizini sağlayan tamamlayıcı metodolojiler sunuyoruz.

Özet

Primer cilia (PC), çoğu memeli hücresinin yüzeyinden çıkıntı yapan hareketli olmayan dinamik mikrotübül bazlı organellerdir. Hücre döngüsünün G1/G0 fazı sırasında eski centriole'den çıkarken, hücreler G2/M faz sınırında hücre döngüsüne yeniden girdikçe parçalara ayırırlar. Birçok hücre işlemi için çok önemli olan hücre dışı sinyalleri algılayarak ve aktararak sinyal hub'ları olarak işlev görürler. Çoğu hücre tipine benzer şekilde, tüm neokortik nöral kök ve progenitör hücreler (NSPC'ler), normal serebral kortikal gelişim için gerekli olan spesifik sinyalleri hissetmelerini ve dönüştürmelerini sağlayan bir PC barındırmaktadır. Burada, neokortik gelişim sırasında PC'nin katılımını daha fazla parçalamak için insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hIPSC) iki boyutlu (2D) ve üç boyutlu (3D) hücre tabanlı modeller oluşturmak ve karakterize etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Özellikle, SONIC Hedgehog (SHH) yolunun transdüksiyonu da dahil olmak üzere 2D nöral rozet türevi NSPC'lerde PC biyogenezini incelemek ve işlev görmek için protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin üç boyutlu (3D) organizasyonundan yararlanmak için , toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülemesi için basit bir yöntem tarif ediyoruz. Optik temizlemeden sonra, tüm organoidlerin hızlı bir şekilde edinimi, tüm organoidin neokortik progenitörlerinde ve nöronlarında hem centrozomların hem de PC'nin tespit edilmesine izin verir. Son olarak, 3D mekansal bilgilerin önemli bir derecesini koruyarak ve PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı nitel ve nicel analizi için gereken yüksek çözünürlüklü kazanıma izin vererek kalın serbest yüzen organoid bölümlerinin immünostaining ve temizlenmesi prosedürünü detaylandırıyoruz.

Giriş

Birincil cilia (PC), hücre dışı ortamdan çok sayıda kimyasal ve mekanik ipucunu algılayan ve transdükleyen mikrotübül bazlı organellerdir. Özellikle, PC omurgalılarda Kirpi sinyal yolunun transdüksiyonunun merkezi organeldir1,2. Çoğu sinir hücresinin uzun zamandır bir PC barındırdığı gösterilmiş olsa da, bu organel merkezi sinir sistemini şekillendirmedeki katkısı uzun zamandır değersizdir. Neokortik gelişim üzerine yapılan çalışmalar, hepsi bir PC barındıran, konumu ata kader tespiti için çok önemli olduğu öne sürülen birden fazla sinir sapı ve progenitör hücrenin (NSPC) keşfine yol açmıştır3,4,5,6,7. PC, NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 ve nöronal göçü destekleyen radyal glial iskelenin apikobasal polaritesi de dahil olmak üzere normal serebral kortikal gelişim için gerekli hücre mekanizmaları için çok önemli gösterilmiştir13. Ek olarak, internöronların kortikal plakaya teğet geçişi sırasında PC gereklidir14,15. Son olarak, serebral kortekste nöronların sinaptik bağlantılarının kurulmasında PC için bir rol önerilmiştir16,17. Tamamen, bu bulgular SEREBRAL KORİkAL Gelİşİmİn ANA ADIMLARUNDA PC'nin önemli bir rolünü savunuyor18,19 ve serebral kortikal gelişimin anomalilerinin altında kalan patolojik mekanizmalara katılımlarını araştırma ihtiyacını gündeme getirmektedir.

Son çalışmalar, insan ve hayvan modellerinde kortikal gelişim arasındaki önemli hücresel ve moleküler farklılıklar hakkındaki anlayışımızı büyük ölçüde geliştirmiş, insan modeli sistemleri geliştirme ihtiyacını vurgulamıştır. Bu görüşe göre, insan indüklenen pluripotent kök hücreler (hIPSC' ler), hastalık patogenezini ilgili genetik ve hücresel bağlamda incelemek için umut verici bir yaklaşımı temsil eder. Yapışık iki boyutlu (2D) hücre bazlı modeller veya nöral rozetler, doğru apikobasal polarite gösteren rozet şeklindeki yapılara dönüşen gelişmekte olan serebral kortekste görülenlere benzer NSPC'ler içerir20,21,22. Ayrıca, üç boyutlu (3D) kültür sistemi, insan serebral kortikal gelişiminin birçok özelliğine yeniden yol açan dorsal forebrain organoidlerinin üretilmesine izin verir23,24,25,26. Bu iki tamamlayıcı hücre tabanlı modelleme yaklaşımı, serebral korteksin normal ve patolojik gelişimi sırasında PC'nin katılımını parçalamak için heyecan verici bakış açıları sunar.

Burada, nöral rozetlerin ve türetilmiş NSPC'lerin yanı sıra dorsal forebrain organoidlerinin üretimi ve karakterizasyonu için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Ayrıca, Sonic Hedgehog yolunun transdüksiyonunu test ederek ve bu yolda yer alan önemli moleküllerin dinamiklerini analiz ederek NSPC'lerde bulunan PC'nin biyogenezini ve işlevini analiz etmek için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Serebral organoidlerin 3D organizasyonundan yararlanmak için, tüm organoidin ışık tabakası mikroskobu sayesinde hızlı bir şekilde edinilmesine izin veren toto immünostained serebral organoidlerin 3D görüntülenmesi için basit ve uygun maliyetli bir yöntem belirledik ve tüm organoidin her türlü neokortik progenitör ve nöronlarında PC'yi görselleştirmeyi sağlayan yüksek çözünürlükte. Son olarak, 150 μm serbest yüzen bölümlere immünhistokimyayı, PC biyogenezinin ve işlevinin ayrıntılı analizi için gerekli olan yüksek çözünürlüklü görüntü alımına izin veren rezonans tarama konfokal mikroskobu kullanarak daha sonra temizleme ve edinme ile uyarladık. Özellikle, 3D görüntüleme yazılımı, PC'nin uzunluğu, sayısı ve yönü dahil olmak üzere morfolojik parametrelerin sonraki analizi ve akonem boyunca silier bileşenlerin sinyal yoğunluğu ölçümü ile PC'nin 3D rekonstrüksiyonuna izin verir.

Protokol

1. Neokortik gelişimin 2D hIPS hücre tabanlı modellerinin üretimi

  1. Nöral rozet oluşumu
    1. Büyük düzenli kolonileri barındıran, % 10'dan az farklılaşma ve% 80'den fazla şekerleme olmayan hIPSC kültürleri ile başlayın.
    2. HIPSC'leri 2 mL PBS ile durulayın.
    3. Kaya inhibitörü (NIM + 10 μM Y-27632) ile desteklenmiş 2 mL NSPC indüksiyon ortamı ekleyin.
    4. Her bir hIPSC kolonisini bir 35 mm'lik çanaktan manuel olarak parçalara ayırarak her koloniyi tam olarak yatay ve dikey yönlerde kesmek için her koloniyi eşit kümelere bölen bir dama tahtası deseni oluşturun.
    5. Koloniyi bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırın ve ultra düşük ekli 35 mm'lik bir tabağa aktarın.
    6. Embriyoid cisimleri (EBs) oluşturabilmeleri için 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde gece boyunca (ON) yüzmelerine izin verin.
      NOT: Embriyoid cisimler (EBs), yüzen küresel kümeler veya hIPSC'lerin agregaları olarak tanımlanır.
    7. 2 mL NIM + 10 μM Y-27632'de 35 mm'lik poli-L-ornit/laminin (PO/lam) kaplı 35 mm'lik yemeklere ES'leri aktarın.
    8. Yaklaşık 12 ila 14 gün süren nöral rozetlerin oluşumuna kadar günlük yenileme NSPC indüksiyon ortamı (Y-27632 içermeyen NIM). Mikroskobun altına bak.
      NOT: Bu adımdan sonra nöral rozetler genişletilebilir, ayırt edilebilir ve immünostaining analizi için işlenebilir veya izole nöral kök ve progenitör hücreler (NSPC' ler) elde etmek için ayrıştırılabilir.
  2. Nöral rozet genişlemesi ve erken farklılaşma
    1. Sinirsel rozetleri ibreyle ızgara benzeri bir desende kesin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kümeleri yerinden sökün.
    2. Rozetleri, 0,5 mL NSPC bakım ortamında (NMM) PO/lam kaplı cam kapak kapağı (4-5 rozet/kuyu) içeren 4 kuyulu bir tabağa aktarın.
    3. Plakayı 37 °C ve%5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
    4. NMM'yi 20.
    5. 20. günden itibaren, farklılaşmaya izin vermek için 0,5 mL sitokin tüketilmiş NMM'deki kültür sinir rozetleri. Ortamı her 2-3 günde bir yenileyin.
    6. 30. Gün ve 40.
  3. İzole NSPC'lerde PC biyogenez ve fonksiyon analizi
    1. NSPC ayrışması
      1. Nöral rozetleri adım 1.1.8'den ibreyle ızgara benzeri bir desende kesin ve bir hücre kazıyıcı kullanarak kümeleri yerinden sökün. Hücreleri 2 mL NMM'de PO/lam kaplı 35 mm'lik yemeklere aktarın ve 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      2. NMM'yi iki günde bir izdiah edene kadar yenileyin (yaklaşık 5-7 gün).
      3. Sinir rozetlerini çevreleyen büyük, berrak hücreleri kazıdıktan sonra, manuel olarak seçin ve NSPC'ler için zenginleştirmek ve sinirsel olmayan hücre tiplerini tükenmek üzere taze PO / lam kaplı 35 mm'lik yemeklere aktarın.
      4. Tüm kirletici hücre tiplerini çıkarmak için gereken bir veya iki manuel geçişten sonra (gerekirse 1.3.1.3 adımını tekrarlayın), ortamı çıkarın ve PBS ile durulayın.
      5. % 0,05 trypsin 300 μL ekleyin ve çoğu hücre kopana kadar 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
      6. Trypsin'i devre dışı bırakmak için %10 FBS (DMEM + %10 FBS) içeren ortamın 2 mL'sini ekleyin. Hücre süspansiyonu 15 mL konik tüpte toplayın. Hücre kümelerini parçalamak için hücre süspansiyonunu üç kez yavaşça pipetle.
      7. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj.
      8. Süpernatantı dikkatlice emiş ve NMN'deki hücreleri yeniden biriktirin.
      9. Ayrışmış NSPC'leri NMM'de tek hücreli (1 x 105 hücre/cm2) PO/lam kaplı yemeklere tohumlayın ve 37 °C ve%5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      10. Ortamı iki günde bir değiştirerek NMM'deki NSPC'leri genişletin.
        NOT: NSPC'ler farklılaşmayı önlemek için yüksek yoğunlukta tohumlanır.
    2. PC biyogenez analizi
      1. Tohum NSPC'leri 100.000 hücre/cm2'de ayrıştırır ve 2 gün boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve NMM'de%5 CO2'de kuluçkaya yatırır.
      2. Ortamı epire edin ve sitokin tükenmiş ortamda (NSPC açlık ortamı, Ek Tablo 1) 48 saat boyunca NSPC'leri aç bırakın.
      3. RT'de 20 dakika boyunca %4 PFA ile NSPC'leri düzeltin.
      4. İmmünasyondan önce RT'de PBS ile iki kez 5 dakika yıkayın.
    3. PC fonksiyon analizi: SHH sinyal yolu
      1. Tohum, PO/lam kaplı 8 kuyulu Oda Kaydıracılarında (300 μL) veya T25 tabaklarda (5 mL) 100.000 hücre/cm2'de NSPC'leri ayrıştırdı ve 2 gün boyunca 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve NMM'de% 5 CO2'de kuluçkaya yatırıldı.
      2. NSPC açlık ortamında (8 kuyulu oda kaydırağı kuyusu başına 300 μL ve T25 şişesinde 5 mL) 48 saat boyunca NSPC'leri aç bırakın.
      3. SHH yolunu indüklamak için, NSPC'leri rekombinant SHH (100 ng/mL) veya SAG (500 nM) ile desteklenmiş açlık ortamıyla kuluçkaya yatırın; (8 kuyulu oda kaydırasının kuyusu başına 150 μL ve T25 şişesinde 2 mL) 24 saat boyunca.
      4. RT'de 20 dakika boyunca kuyu başına %4 PFA'nın 250 μL'sinde 8 kuyulu Oda Kaydıraklarında kültürlenmiş NSPC'leri düzeltin ve immünasyon analizinden önce RT'de 5 dakika boyunca 250 μL PBS ile iki kez yıkayın.
      5. Ortamı çıkarın ve T25 yemeklerinde kültürlenmiş NSPC'leri PBS ile yıkayın.
      6. % 0,05 tripsin 500 μL ekleyin ve hücreler kopana kadar 37 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yaslanın.
      7. Tripsin'i devre dışı bırakmak ve hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpte toplamak için% 10 FBS (DMEM + % 10 FBS) içeren 2 mL orta ekleyin.
      8. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj yapın ve RNA ekstraksiyonu ve RT-PCR analizinden önce -80 °C'de kriyoprezizasyon yapılabilen NSPC peletleri elde etmek için süpernatantı dikkatlice arzu edin.

2. Dorsal forebrain organoidlerinin üretimi

  1. HIPSC'lerin tek hücreli kültürü
    1. %10'dan daha az farklılaşma gösteren ve neredeyse bir kez geçiş yapılan büyük düzenli kolonileri barındıran hIPSC kültürleri ile başlayın. Hücrelerin %80'den fazla birleştiğinden emin olun.
    2. Kolonileri 2 mL PBS ile yıkayın.
    3. 500 μL Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi (GCDR) ekleyin ve 37 °C'de 5 ila 7 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. GCDR'yi epire edin ve 5 μM Y-27632 ile desteklenmiş 2 mL mTeRS1 ortamı ekleyin.
    5. Tüm kolonileri tek bir hücreye ayrıştırmak için hücreleri 10 kez hafifçe yukarı ve aşağı borulayın.
    6. Vitronektin kaplı tabaklardaki hücreleri aktarın ve 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.
      NOT: HIPSC'leri tek hücreli kültür koşullarına uyarlamak için farklılaşma denemesinden önce GCDR kullanarak hIPSC'lerin en az 1 geçişini gerçekleştirin.
  2. 0. Günde, hIPSC'lerin düşük FGF2 konsantrasyonu ve hIPSC sağkalım için gereken yüksek konsantrasyonda kaya inhibitörü içeren EB ortamında embriyonik cisimler oluşturmasına izin verin. Bunu yapmak için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Kolonileri 2 mL PBS ile yıkayın.
    2. 500 μL Nazik Hücre Ayrışması Reaktifi (GCDR) ekleyin ve 37 °C'de 5 ila 7 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. GCDR'yi aspire edin ve 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL EB ortamı ekleyin; Hücreleri hafifçe ayırmak ve 15 mL konik bir tüpe aktarmak için 1 mL pipet kullanın.
    4. 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 2 mL EB ortamı ile bir kez daha durulayın, kalan hücreleri 15 mL konik tüpe aktarın. Konik tüpe hemen 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 3 mL EB ortamı ekleyin ve çözeltiyi 5 mL pipet kullanarak hafifçe homojenize edin.
    5. Ayrışmış hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj edin.
    6. Süpernatantı hafifçe emiş edin ve hücreleri 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 6 mL EB ortamında yeniden biriktirin.
    7. Hücreleri 5 dakika boyunca 100 x g'da santrifüj edin.
    8. Süpernatantı epire edin ve hücreleri 50 μM Y-27632 ile desteklenmiş 1 mL EB ortamında yeniden biriktirin. Hücreleri tek hücreli bir süspansiyona hafifçe ayrıştırmak için 1 mL pipet kullanın.
    9. Hücreleri yeniden steril ettikten hemen sonra seyreltin ve sayın.
    10. Uygun hücre süspansiyonu hacmini (900.000 hücre içeren) 50 μM Y-27632 ve 4 ng/mL bFGF ile desteklenmiş 30 mL EB ortamına seyreltin ve çözeltiyi hafifçe karıştırın.
    11. Plaka 9.000 hücre/kuyuda ultra düşük ekli 96U plakaya (300 μL/kuyu). Rahatsız edici EB oluşumunu önlemek için, plakayı orta değişiklik olmadan 37 °C'de nemlendirilmiş bir inkübatörde ve% 5 CO2'de 3.
  3. Nöral indüksiyon (Çift SMAD inhibisyonu)
    1. 3. Günde, EBs'nin 300-400 μm ölçtmesini ve düzenli sınırları göstermesini sağlayın. Her iki kritere de ulaşılırsa, ortamın yarısını (150 μL) Çift SMAD inhibitörleri içeren indüksiyon orta-1 ile değiştirin, bu da 6- 7. güne kadar ED'lerin konturunun aydınlatılmasına yol açan nöroektodermal farklılaşmayı gösterir (Ek Tablo 2).
    2. 4. Günde, ortamın 3/4'ü (225 μL) indüksiyon orta-1 ile değiştirin.
    3. 6. gün ve 8. gün: İndüksiyon orta-1'in yarısını yenileyin (150 μL).
  4. Bodrum membran matrisine organoid gömme (Gün 10)
    1. 10. günde, EBs'yi büyüme faktörüne katıştırarak bodrum membran matrisini (BMM) azaltın.
      NOT: Bu adımdan itibaren, tekrarlanan pipetleme ile organoidlere zarar vermemek için pipet uçlarının açılmasını kesmek için her zaman steril makas kullanın.
    2. konik tüplerde 15-17 organoid civarında ilk transfer. ÖK'lerin yerleşmesine ve ortamı kaldırmasına izin verin. 50 μL indüksiyon orta-2 ekleyin ve bunları 100 μL BMM içeren bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. Matris-EB karışımını ultra düşük bağlantı plakasının kuyusunun ortasına yayın ve kaynaşmalarını önlemek için EB'leri ayırın.
    4. BMM'nin 37 °C'de inkübatörde 45 dakika katılaşmasını sağlar.
    5. Her kuyuya 3 mL indüksiyon orta-2 ekleyin ve plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatöre koyun.
      NOT: Bmm oda sıcaklığında katılaştıkça bu işlemin mümkün olduğunca çabuk yapıldığından emin olun.
  5. Bodrum membran matrisine gömülü organoidlerin sabit kültürü
    1. 12. Gün, 14: İndüksiyon orta-2'yi yenileyin.
    2. 16. Gün: İndüksiyon orta-2'yi yenileyin ve mikroskop altında nöroepithelial döngülerin genişlemesini kontrol edin.
  6. Yörüngesel çalkalayıcıda bodrum membran matrisi ayrışması ve kültürü
    1. 17. günde, organoidleri 5 mL pipetle 10 kez yukarı ve aşağı pipetle bmm'den ayırır ve farklılaşma orta-1'e (A vitamini olmadan) aktarın. Beslenme emilimini iyileştirmek için 37 °C ve %5 CO2'de nemlendirilmiş bir inkübatörde 80 rpm'de bir yörüngesel çalkalayıcıya inkübasyon.
      NOT: Sabit kültür ve kültür için yörüngesel bir çalkalayıcı üzerine farklı bir inkübatör kullanarak, bağlı hIPS hücre büyümesine zarar verici titreşimleri önler.
    2. 19. Gün: Farklılaşmayı yenile orta-1.
    3. 21. Gün: Farklılaşma orta-1'i farklılaşma orta-2 (A vitamini ile) olarak değiştirin.
    4. 23. Günden 35. Güne: Ortamı her 2-3 günde bir farklılaşma ile orta-2 ile yenileyin.
    5. 35. Günden 70. Güne: Farklılaşmayı %1 BMM ile orta-2'de yenileyin ve 2-3 günde bir yenileyin.
    6. Organoidleri 28, 42 ve 70 +/- 2 günlük farklılaşmadan sonra toplayın ve 15 mL konik tüpte 5 mL% 4 PFA'da 4 °C'de bir gecede sabitlayın.
    7. Toto veya serbest yüzen immünostaining analizinde daha fazla bilgi için organoidler PBS'de iki kez durulanır ve PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de korunur.
    8. Donmuş bölümlerde immünostaining analizi için, %4 PFA sabit organoidleri +4 °C AÇIK'ta (veya organoidler batana kadar) 10 mL%30 sakkaroza daldırin. Onları donmuş gömme matrisine gömün ve kriyoseksiyona kadar -80 °C'de saklayın.

3. Dorsal forebrain organoidlerinin toto immünolabeling, temizleme ve ışık tablosu alımında

  1. Fiksasyon
    1. Organoidleri 6 kuyulu plakalarda toplayın, ortamı çıkarın ve bir gecede 4 °C'de% 4 PFA'nın 2 mL'si ile sabitlayın.
    2. Oda sıcaklığında 2 mL PBS'de üç yıkama gerçekleştirin.
    3. Organoidleri 2 mL tüplere aktarın ve 2 mL PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de saklayın.
  2. Permeabilizasyon
    1. Organoidleri 1 saat boyunca RT'de %0,2 Triton X100 içeren 1 mL PBS'de kuluçkaya yatırın. Bunu iki kez yap.
    2. %0,2 Triton X100 ve %20 DMSO içeren PBS'nin 1 mL'sinde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
    3. %0,1 Tween20, %0,1 Triton X100, %0,1 Deoxycholate, %0,1 NP40 ve %20 DMSO içeren PBS'nin 1 mL'sinde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yaslanın.
    4. 1 saat boyunca RT'de %0,2 Triton-X100 içeren 1 mL PBS'de kuluçkaya yaslanın. Bunu iki kez yap.
  3. Engelleme ve immünoblabeling
    1. 37 °C, ON'da 1 mL bloklama çözeltisi (PBS, %0,2 Triton X100, %6 Eşek Serumu,%10 DMSO).
    2. 2 gün boyunca 37 °C'de 250 μL PBS, %0,2 Tween20, 0,1 μg/mL Heparin, %5 DMSO ve %3 Eşek Serumu'nda seyreltilmiş primer antikorlarla kuluçkaya yatırın.
    3. %0,2 Tween20 ve 0,1 μg/mL Heparin içeren 1 mL PBS'de 1 saat boyunca 37 °C'de yıkayın. Bunu dört kez yap.
    4. %0,2 Tween20 ve 0,1 μg/mL Heparin içeren 1 mL PBS'de bir gecede 37 °C'de yıkayın.
    5. 2 gün boyunca 37 °C'de %0,2 Tween 20, 0,1 μg/mL Heparin ve %3 Eşek Serumu içeren 250 μL PBS'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla kuluçkaya yatırın.
    6. 0.2% Ara 20 ve 0.1 μg / mL Heparin içeren 1 mL PBS'de, 1 saat boyunca, bir tekerlek üzerinde, RT'de yıkayın. Bunu dört kez yap.
    7. Rt'de bir gecede% 0.2 Ara 20 ve 0.1 μg / mL Heparin içeren 1 mL PBS'de yıkayın.
    8. RT'de 24 saat boyunca 1 mL PBS'de yıkayın.
    9. Temizleyene kadar 1 mL PBS'de +4 °C ve %0,05 sodyum azide stok.
  4. TDE'de Takas (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Organoidleri RT'de 24 saat boyunca %30 TDE'nin 1 mL'sinde (3 mL TDE + 7 mL PBS) kuluçkaya yatırın.
    2. RT'de 24 saat boyunca %60 TDE 'nin (6 mL TDE + 4 mL PBS) 1 mL'sinde kuluçkaya yatırın.
    3. RT'de 24 saat boyunca %80 TDE'nin (8 mL TDE + 2 mL PBS) 1 mL'sinde kuluçkaya yatırın.
  5. Işık tabakası alımından önce organoid gömme
    NOT: Özel yapım bir sistem kullanın; neşterle kesilmiş ucu ile 1 mL şırınna ile yapılır.
    1. %60 TDE çözeltisinde %4 Düşük Erimeli Agarose'un 100 mL'sini ve 2 mL tüplerde aliquot hazırlayın. +4 °C'de tasarruf edin.
    2. Organoid gömmeden önce, %60 TDE'de %4 düşük erimeli agarosenun 1,5 mL'sini içeren bir tüpü sıvılaşına kadar 37 °C'de bir su banyosunda önceden ısıtın.
    3. Bu arada, ucu neşter kullanılarak kesilen 1 mL şırıngamdan yapılmış özel yapım bir kalıplama sistemi hazırlayın.
    4. Pistonu kullanarak jel çözeltisinin şırınd 600 μL'sinde pompala.
    5. Numuneyi, açıklığı steril makas kullanılarak kesilmiş genişlemiş bir pipet ucu kullanarak konumlandırın.
    6. Şırınnayı 400 μL jel çözeltisi ile doldurun, böylece numune şırınnanın alt üçte birine yerleşmiştir.
    7. Jel polimerize ve 4 °C'de% 80 TDE çözeltisinde depolamak elde kadar ışıktan korunmasını bırakın.
    8. Işık sayfası alımı için, temizleme yönteminin kırılma indeksine doğru bir şekilde uyum sağlamak için numune odasına eklenen% 80 TDE çözümüne dalmış 20x hedefi kullanın.
    9. Agarose gömülü organoid içeren şırıngayı, pistonu hedefin önüne yerleştirmek için çalıştırılabilen 1 mL şırıngaya uyum sağlayacak şekilde tasarlanmış en büyük numune tutucusuna yerleştirin.
      NOT: Tüm organoidin ışık tabakası alımı yaklaşık 5 ila 10 dakika sürer.

4. Dorsal forebrain organoidlerinin serbest yüzen bölümlerinin immünostaining ve temizlenmesi

  1. Fiksasyon, agarose gömme ve organoidlerin bölümlenmesi
    1. 6 kuyulu bir plakada 28, 42 ve 70 +/- 2 günlük farklılaşmadan sonra organoidleri toplayın ve %4 PFA'nın 2 mL'sinde 4 °C'de bir gecede sabitlayın.
    2. 2 mL PBS'de iki kez durulayın ve 2 mL PBS + % 0.05 sodyum azide 4 °C'de tasarruf edin.
    3. Sabit organoidleri plastik gömme kalıbına (7 x 7 mm) % 4 düşük eriyen agarose içine gömün. Agarose bloğunu plastik kalıptan dikkatlice çıkarın ve vibratom aşamasına yapıştırın.
    4. Bölümlere zarar vermemek için bir boya fırçası kullanarak 500 μL PBS içeren 24 kuyulu bir plakanın kuyusunda aktarılan 150 μm serbest yüzen bölüm elde etmek için vibratom kullanarak gömülü organoidleri bölümle.
      NOT: Erime sıcaklığı sadece yaklaşık 60 °C olduğu için düşük eriyen agarose önerilir. PBS çözeltisinde% 4 düşük eriyen agarose hazırlayın ve organoid gömmeden önce bir su banyosunda 37 ° C'nin hemen üzerinde soğumaya bırakın.
  2. Permeabilizasyon, blokaj ve immünostaining
    1. Bölümleri 500 μL PBS'de % 0,3 Triton X100 içeren, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca kuluçkaya yatırın. Bunu üç kez yap.
    2. Bölümleri% 0.3 Triton X100 ve% 5 yağsız Süt içeren 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında, 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    3. Bölümleri 250 μL primer antikor çözeltisinde (PBS + % 0.3 Triton X100 + % 1 yağsız Süt), ajitasyon altında, +4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
    4. Bölümleri 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca yıkayın. Bunu dört kez yap.
    5. Bölümleri 250 μL ikincil antikor çözeltisinde (PBS + % 0.3 Triton X100 + % 1 yağsız süt), RT'de, ajitasyon altında 2 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
    6. Bölümleri 500 μL PBS'de, RT'de, ajitasyon altında 20 dakika boyunca yıkayın. Bunu dört kez yap.
    7. Bölümleri temizleyene kadar +4° C'de 500 μL PBS'de saklayın.
  3. TDE'de Takas (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Bölümleri RT'de her biri 1 saat boyunca %30 μL ve %60 TDE'de 500 μL'de ve ardından bir gecede %80 TDE'nin 500 μL'sinde KULUÇKAYA YATIRIN.
    2. Temizlenen bölümleri +4 °C'de elde edilene kadar %80 TDE'nin 500 μL'sinde saklayın.
  4. Rezonans tarama konfokal ile satın alarak önce serbest yüzen bölümlerin montajı
    1. Numuneyi %80 TDE çözeltisinde muhafaza etmeyi sağlayan ve konfokal mikroskopların motorlu XY aşamasına uyum sağlamak için tasarlanmış, sızdırmaz bir hazneye serbest yüzen bir bölüm monte edin.
    2. Oda sistemine bir yuvarlak kapak kılıfı koyun.
    3. Temizlenmiş immünostained bölümü bir boya fırçası kullanarak dikkatlice aktarın.
    4. Odayı % 80 TDE çözeltisi ile doldurun.
    5. İki standart kapak kılıfı artı bir ikinci yuvarlak kapak kılıfı ve silikon conta ekleyin.
    6. Sistemi mükemmel bir şekilde kapatmak için haznenin vidalama halkasını vidaleyin.

5. Işık tabakası ve rezonans tarama konfokal analizi

  1. Tüm immünostained örneğin 3D görselleştirme ve analizini sağlayan yazılımı kullanarak ışık levhası ve rezonans tarama alımlarını işleyin.
    NOT: Bu tür yazılımlar, anlık görüntüleri ve animasyonları kolayca yapmak için büyük verileri hızlı bir şekilde açmanıza izin verir. Örneğin XY ve YZ gibi farklı yönlerdeki 2D dilimleyici aracı sayesinde numunenin farklı yönlerde hareket ettirip 2D görünümler oluşturmasına olanak tanır.
  2. Hem centrosomes hem de birincil cilia'nın otomatik olarak algılanmasını sağlamak için, patolojik ve kontrol koşullarında sayılarını ölçmeyi sağlayan bir nokta sihirbazı kullanın.
  3. Uzunluklarının hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan bilgisayarın 3D yeniden yapılandırılması için, bilgisayarın başlangıç noktasını manuel olarak düzeltmek için bir filament sihirbazı kullanın ve yazılım bilgisayarı tam olarak yeniden oluşturmak için floresan sinyalini kullanır.

Sonuçlar

Birincil sesiyum biyogenez ve fonksiyonu incelemek için 2D hIPS hücre bazlı modeller
Burada detaylandırılan protokol daha önce yayınlanan çalışmalardan uyarlanmıştır20,21,22. Bu protokol, gelişmekte olan neokortekste görülenlere benzer neokortik progenitörler ve nöronlar içeren nöral rozet yapılarının üretilmesine izin verir. Ayrıntılı doğrulama, spesifik yapıcılar kullanılarak ...

Tartışmalar

PC artık normal serebral kortikal gelişim sırasında önemli adımları düzenleyen önemli organeller olarak kabul edilmektedir18,19,31 NSPC genişlemesi ve taahhüdü8,9,10,11,12 yanı sıra nöronal göç13,14

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Bu çalışma Agence Nationale de la Recherche'den (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) ve N.B.B.'ye (ANR-16-CE16-0011 ve ANR-19-CE16-0002-01) verilen hibelerle desteklendi. LB, Investissements d'avenir programı (ANR-10-IAHU-01) ve Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD programı) altında ANR tarafından desteklenmektedir. Imagine Enstitüsü, Investissements d'avenir programı (ANR-10-IAHU-01, CrossLab projeleri) ve ikinci Investissements d'Avenir programının (ANR-17-RHUS-0002) bir parçası olarak ANR'den devlet finansmanı ile desteklenmektedir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

Referanslar

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli imsel BiyolojiSay 181primer si yuminsan kaynakl pluripotent k k h crelerhIPSC lern ral k k ve progenit r h crelerinsan serebral kortikal geli imin ral rozetlerdorsal forebrain organoidleri2D ve 3D hIPSC tabanl neokortik geli im modelleriserebral organoidlerSonic kirpit m montajl imm nostainingoptik temizlemek mikroskobu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır