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* Estos autores han contribuido por igual
Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).
Los cilios primarios (PC) son orgánulos dinámicos no móviles basados en microtúbulos que sobresalen de la superficie de la mayoría de las células de mamíferos. Emergen del centriolo más antiguo durante la fase G1/G0 del ciclo celular, mientras que se desmontan a medida que las células vuelven a entrar en el ciclo celular en el límite de la fase G2/M. Funcionan como centros de señales, detectando y transduciendo señales extracelulares cruciales para muchos procesos celulares. Al igual que en la mayoría de los tipos de células, se ha demostrado que todas las células madre y progenitoras neurales neocorticales (NSPC) albergan una PC que les permite detectar y transducir señales específicas requeridas para el desarrollo cortical cerebral normal. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para generar y caracterizar modelos bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) basados en células a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) para diseccionar aún más la participación de la PC durante el desarrollo neocortical. En particular, presentamos protocolos para estudiar la biogénesis y la función de la PC en NSPC derivados de rosetas neuronales 2D, incluida la transducción de la vía Sonic Hedgehog (SHH). Para aprovechar la organización tridimensional (3D) de los organoides cerebrales, describimos un método simple para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos. Después de la limpieza óptica, la rápida adquisición de organoides completos permite la detección de centrosomas y PC en progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, detallamos el procedimiento para la inmunotinción y limpieza de gruesas secciones organoides que flotan libremente, preservando un grado significativo de información espacial 3D y permitiendo la adquisición de alta resolución requerida para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de la biogénesis y la función de la PC.
Los cilios primarios (PC) son orgánulos basados en microtúbulos que detectan y transducen una gran cantidad de señales químicas y mecánicas del entorno extracelular. En particular, la PC es el orgánulo central para la transducción de la vía de señalización del erizo en vertebrados1,2. Si bien se ha demostrado durante mucho tiempo que la mayoría de las células neuronales albergan una PC, la contribución de este orgánulo en la configuración del sistema nervioso central ha sido subestimada durante mucho tiempo. Los estudios sobre el desarrollo neocortical han llevado al descubrimiento de múltiples células madre y....
1. Generación de modelos 2D basados en células hIPS de desarrollo neocortical
Modelos 2D basados en células hIPS para estudiar la biogénesis y la función del cilio primario
El protocolo aquí detallado ha sido adaptado de estudios publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite la generación de estructuras de rosetas neurales que contienen progenitores neocorticales y neuronas similares a las observadas en el neocórtex en desarrollo. La validación detallada se puede real.......
En la actualidad, los PC se consideran orgánulos clave que regulan pasos cruciales durante el desarrollo cortical cerebral normal18,19,31 incluyendo la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la migración neuronal13,14<.......
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) y N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 y ANR-19-CE16-0002-01). LB cuenta con el apoyo de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) y la Fondation Bettencourt Schueller (programa MD-PhD). El Imagine Institute cuenta con el apoyo de fondos estatales de la ANR en el marco del programa Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, proyectos CrossLab) y como parte del segundo programa Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
2-Mercaptoéthanol (50 mM) | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates | Corning | 3471 | |
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate | Corning | 7007 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587010 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
CellAdhere Dilution Buffer | StemCell Technologies | 7183 | |
DMEM/F-12, Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
DMSO | ATCC | 4-X | |
Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
Easy Grip 35 10mm | Falcon | 353001 | |
EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575020 | |
EGF , 25µg | Thermofischer | PHG0315 | |
FGF2 , 25µg | Thermofischer | PHG0264 | |
Gentle Cell Dissociation Reagent | StemCell Technologies | 7174 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | 12585014 | |
KnockOut Serum | ThermoFisher Scientific | 10828028 | |
Laminin (1mg) | Thermofischer | 23017015 | |
LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
Neural Basal Medium | Thermofischer | 21103049 | |
Orbital shaker | Dutscher | 995002 | |
PBS | ThermoFisher Scientific | 14190094 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
PFA 32% | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
Poly-L-Ornithine (PO) | Sigma | P4957 | |
Recombinant human BDNF 10 µg | Stem Cell Technologies | 78005 | |
Recombinant Human FGF-basic | Peprotech | 100-18B | |
rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
Stembeads FGF2 | StemCulture | SB500 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
Superfrost Plus Adhesion Slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Supplément N2- (100X) | ThermoFisher Scientific | 17502048 | |
TDE 2,2’-Thiodiethanol | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
Vitronectin | StemCell Technologies | 7180 | |
Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
Primary Antibodies | |||
ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
N-Cadherin | BD Transduction Lab | 610921 | 1/500e |
P-Vimentin | MBL | D076-3 | 1/500e |
PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000e |
S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
γTUBULIN | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-rabbit AF488 | ThermoFisher Scientific | A21206 | 1/500e |
Goat anti-mouse AF555 | ThermoFisher Scientific | A21422 | 1/500e |
Goat anti-mouse AF647 | ThermoFisher Scientific | A21236 | 1/500e |
Goat anti-rat AF555 | ThermoFisher Scientific | A21434 | 1/500e |
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