Modelos 2D y 3D basados en células madre pluripotentes inducidas por humanos para diseccionar la participación del cilio primario durante el desarrollo neocortical

Resumen

Presentamos protocolos detallados para la generación y caracterización de modelos de desarrollo neocortical basados en células madre pluripotentes inducidas humanas (hIPSC) 2D y 3D, así como metodologías complementarias que permiten el análisis cualitativo y cuantitativo de la biogénesis y función del cilio primario (PC).

Resumen

Los cilios primarios (PC) son orgánulos dinámicos no móviles basados en microtúbulos que sobresalen de la superficie de la mayoría de las células de mamíferos. Emergen del centriolo más antiguo durante la fase G1/G0 del ciclo celular, mientras que se desmontan a medida que las células vuelven a entrar en el ciclo celular en el límite de la fase G2/M. Funcionan como centros de señales, detectando y transduciendo señales extracelulares cruciales para muchos procesos celulares. Al igual que en la mayoría de los tipos de células, se ha demostrado que todas las células madre y progenitoras neurales neocorticales (NSPC) albergan una PC que les permite detectar y transducir señales específicas requeridas para el desarrollo cortical cerebral normal. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para generar y caracterizar modelos bidimensionales (2D) y tridimensionales (3D) basados en células a partir de células madre pluripotentes inducidas por humanos (hIPSC) para diseccionar aún más la participación de la PC durante el desarrollo neocortical. En particular, presentamos protocolos para estudiar la biogénesis y la función de la PC en NSPC derivados de rosetas neuronales 2D, incluida la transducción de la vía Sonic Hedgehog (SHH). Para aprovechar la organización tridimensional (3D) de los organoides cerebrales, describimos un método simple para la obtención de imágenes 3D de organoides cerebrales in toto inmunoteñidos. Después de la limpieza óptica, la rápida adquisición de organoides completos permite la detección de centrosomas y PC en progenitores neocorticales y neuronas de todo el organoide. Finalmente, detallamos el procedimiento para la inmunotinción y limpieza de gruesas secciones organoides que flotan libremente, preservando un grado significativo de información espacial 3D y permitiendo la adquisición de alta resolución requerida para el análisis cualitativo y cuantitativo detallado de la biogénesis y la función de la PC.

Introducción

Los cilios primarios (PC) son orgánulos basados en microtúbulos que detectan y transducen una gran cantidad de señales químicas y mecánicas del entorno extracelular. En particular, la PC es el orgánulo central para la transducción de la vía de señalización del erizo en ^{vertebrados1,2}. Si bien se ha demostrado durante mucho tiempo que la mayoría de las células neuronales albergan una PC, la contribución de este orgánulo en la configuración del sistema nervioso central ha sido subestimada durante mucho tiempo. Los estudios sobre el desarrollo neocortical han llevado al descubrimiento de múltiples células madre y....

Protocolo

1. Generación de modelos 2D basados en células hIPS de desarrollo neocortical

1. Formación de rosetas neurales
   1. Comience con cultivos hIPSC que albergan grandes colonias regulares, que exhiben menos del 10% de diferenciación y no más del 80% de confluencia.
   2. Enjuague las hIPSC con 2 ml de PBS.
   3. Añadir 2 mL de medio de inducción NSPC suplementado con el inhibidor de Rock (NIM + 10 μM de Y-27632).
   4. Diseccionar manualmente cada colonia hIPSC de un plato de 35 mm usando una aguja para cortar cada colonia con precisión en direcciones horizontales y verticales para crear un patrón de tablero de ....

Resultados

Modelos 2D basados en células hIPS para estudiar la biogénesis y la función del cilio primario
El protocolo aquí detallado ha sido adaptado de estudios publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite la generación de estructuras de rosetas neurales que contienen progenitores neocorticales y neuronas similares a las observadas en el neocórtex en desarrollo. La validación detallada se puede real.......

Discusión

En la actualidad, los PC se consideran orgánulos clave que regulan pasos cruciales durante el desarrollo cortical cerebral ^{normal18,19,31} incluyendo la expansión y el compromiso de NSPC8,9,10,11,12, así como la migración ^{neuronal13,14<.......}

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)	ThermoFisher Scientific	31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate	Corning	7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	ThermoFisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (50X), serum free	ThermoFisher Scientific	17504044
CellAdhere Dilution Buffer	StemCell Technologies	7183
DMEM/F-12, Glutamax	ThermoFisher Scientific	31331028
DMSO	ATCC	4-X
Dorsomorphin	StemCell Technologies	72102
Easy Grip 35 10mm	Falcon	353001
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020
EGF , 25µg	Thermofischer	PHG0315
FGF2 , 25µg	Thermofischer	PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent	StemCell Technologies	7174
Insulin	ThermoFisher Scientific	12585014
KnockOut Serum	ThermoFisher Scientific	10828028
Laminin (1mg)	Thermofischer	23017015
LDN193189	StemCell Technologies	72147
Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381-250G
mTeSR1	StemCell Technologies	85850
Neural Basal Medium	Thermofischer	21103049
Orbital shaker	Dutscher	995002
PBS	ThermoFisher Scientific	14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PFA 32%	Electron Microscopy Sciences	15714
Poly-L-Ornithine (PO)	Sigma	P4957
Recombinant human BDNF 10 µg	Stem Cell Technologies	78005
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
rSHH	R&D Systems	8908-SH
SAG	Santa Cruz	Sc-202814
SB431542	StemCell Technologies	72232
Stembeads FGF2	StemCulture	SB500
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Supplément N2- (100X)	ThermoFisher Scientific	17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol	Sigma Aldrich	166782-500G
Vitronectin	StemCell Technologies	7180
Y-27632	StemCell Technologies	72304
Primary Antibodies
ARL13B	Abcam	Ab136648	1/200e
ARL13B	Proteintech	17711-1-AP	1/500e
CTIP2	Abcam	Ab18465	1/500e
GLI2	R&D Systems	AF3526	1/100
GPR161	Proteintech	13398-1-AP	1/100
N-Cadherin	BD Transduction Lab	610921	1/500e
P-Vimentin	MBL	D076-3	1/500e
PAX6	Biolegend	PRB-278P	1/200e
PCNT	Abcam	Ab4448	1/1000e
S0X2	R&D Systems	MAB2018	1/200e
SATB2	Abcam	Ab51502	1/200e
TBR2	Abcam	Ab216870	1/400e
TPX2	NovusBio	NB500-179	1/500e
γTUBULIN	Sigma Aldrich	T6557	1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher Scientific	A21206	1/500e
Goat anti-mouse AF555	ThermoFisher Scientific	A21422	1/500e
Goat anti-mouse AF647	ThermoFisher Scientific	A21236	1/500e
Goat anti-rat AF555	ThermoFisher Scientific	A21434	1/500e