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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Presentiamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di modelli 2D e 3D basati su cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) di sviluppo neocorticale, nonché metodologie complementari che consentono l'analisi qualitativa e quantitativa della biogenesi e della funzione del cilio primario (PC).

Abstract

Le ciglia primarie (PC) sono organelli dinamici non mobili a base di microtubuli che sporgono dalla superficie della maggior parte delle cellule di mammifero. Emergono dal centriolo più vecchio durante la fase G1/G0 del ciclo cellulare, mentre si disassemblano quando le cellule rientrano nel ciclo cellulare al limite di fase G2/M. Funzionano come hub di segnale, rilevando e trasducendo segnali extracellulari cruciali per molti processi cellulari. Simile alla maggior parte dei tipi di cellule, tutte le cellule staminali neurali neocorticali e progenitrici (NSPC) hanno dimostrato di ospitare un PC che consente loro di percepire e trasdurre segnali specifici necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale. Qui, forniamo protocolli dettagliati per generare e caratterizzare modelli cellulari bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hIPSC) per sezionare ulteriormente il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo neocorticale. In particolare, presentiamo protocolli per studiare la biogenesi e la funzione del PC in NSPC derivati da rosette neurali 2D, inclusa la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog (SHH). Per sfruttare l'organizzazione tridimensionale (3D) degli organoidi cerebrali, descriviamo un metodo semplice per l'imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto . Dopo la compensazione ottica, la rapida acquisizione di interi organoidi consente il rilevamento sia di centrosomi che di PC su progenitori neocorticali e neuroni dell'intero organoide. Infine, descriviamo in dettaglio la procedura per l'immunocolorazione e la pulizia di spesse sezioni organoidi fluttuanti che preservano un grado significativo di informazioni spaziali 3D e consentendo l'acquisizione ad alta risoluzione necessaria per l'analisi qualitativa e quantitativa dettagliata della biogenesi e della funzione del PC.

Introduzione

Le ciglia primarie (PC) sono organelli a base di microtubuli che percepiscono e trasducono una pletora di segnali chimici e meccanici dall'ambiente extracellulare. In particolare, il PC è l'organello centrale per la trasduzione della via di segnalazione hedgehog nei vertebrati1,2. Mentre la maggior parte delle cellule neurali ha dimostrato a lungo di ospitare un PC, il contributo di questo organello nel modellare il sistema nervoso centrale è stato a lungo sottovalutato. Gli studi sullo sviluppo neocorticale hanno portato alla scoperta di cellule staminali neurali multiple e progenitrici (NSPC), tutte dotate di PC, la cui posizione è stata proposta come cruciale per la determinazione del destino progenitore3,4,5,6,7. Il PC si è dimostrato cruciale per i meccanismi cellulari necessari per il normale sviluppo corticale cerebrale, tra cui l'espansione e l'impegno NSPC8,9,10,11,12 e la polarità apicobasale dello scaffold gliale radiale che supporta la migrazione neuronale13. Inoltre, i PC sono necessari durante la migrazione tangenziale degli interneuroni alla piastra corticale14,15. Infine, è stato proposto un ruolo per il PC nella creazione di connessioni sinaptiche dei neuroni nella corteccia cerebrale16,17. Complessivamente, questi risultati sostengono un ruolo cruciale della PC nelle fasi principali dello sviluppo corticale cerebrale18,19 e sollevano la necessità di indagare il loro coinvolgimento nei meccanismi patologici alla base delle anomalie dello sviluppo corticale cerebrale.

Studi recenti hanno ampiamente migliorato la nostra comprensione di importanti differenze cellulari e molecolari tra lo sviluppo corticale in modelli umani e animali, sottolineando la necessità di sviluppare sistemi modello umani. In questa prospettiva, le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (hIPSC) rappresentano un approccio promettente per studiare la patogenesi della malattia in un contesto genetico e cellulare rilevante. I modelli cellulari bidimensionali aderenti (2D) o rosette neurali contengono NSPC simili a quelli osservati nella corteccia cerebrale in via di sviluppo, che si organizzano in strutture a forma di rosetta che mostrano una corretta polarità apicobasale20,21,22. Inoltre, il sistema di coltura tridimensionale (3D) consente la generazione di organoidi del proencefalo dorsale che ricapitolano molte caratteristiche dello sviluppo corticale cerebrale umano23,24,25,26. Questi due approcci complementari di modellazione basati su cellule offrono prospettive entusiasmanti per sezionare il coinvolgimento del PC durante lo sviluppo normale e patologico della corteccia cerebrale.

Qui forniamo protocolli dettagliati per la generazione e la caratterizzazione di rosette neurali e NSPC derivati, nonché organoidi del proencefalo dorsale. Forniamo inoltre protocolli dettagliati per analizzare la biogenesi e la funzione dei PC presenti sulle NSPC testando la trasduzione del percorso Sonic Hedgehog e analizzando la dinamica delle molecole cruciali coinvolte in questo percorso. Per sfruttare l'organizzazione 3D degli organoidi cerebrali, abbiamo anche impostato un metodo semplice ed economico per l'imaging 3D di organoidi cerebrali immunocolorati in toto che consente una rapida acquisizione, grazie ad un microscopio a foglio luminoso, dell'intero organoide, con alta risoluzione che consente di visualizzare il PC su tutti i tipi di progenitori neocorticali e neuroni dell'intero organoide. Infine, abbiamo adattato l'immunoistochimica su sezioni fluttuanti da 150 μm con successiva pulizia e acquisizione utilizzando il microscopio confocale a scansione risonante che consente l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione, necessaria per l'analisi dettagliata della biogenesi e della funzione del PC. In particolare, il software di imaging 3D consente la ricostruzione 3D del PC con successiva analisi dei parametri morfologici tra cui lunghezza, numero e orientamento del PC, nonché la misurazione dell'intensità del segnale dei componenti ciliari lungo l'axoneme.

Protocollo

1. Generazione di modelli cellulari 2D hIPS di sviluppo neocorticale

  1. Formazione di rosette neurali
    1. Inizia con le colture hIPSC che ospitano grandi colonie regolari, mostrando meno del 10% di differenziazione e non più dell'80% di confluenza.
    2. Risciacquare le hIPSC con 2 ml di PBS.
    3. Aggiungere 2 mL di mezzo di induzione NSPC integrato con l'inibitore Rock (NIM + 10 μM di Y-27632).
    4. Sezionare manualmente ogni colonia hIPSC da un piatto da 35 mm usando un ago per tagliare ogni colonia con precisione in direzioni orizzontali e verticali per creare un modello a scacchiera che divide ogni colonia in gruppi uguali.
    5. Staccare la colonia usando un raschietto cellulare e trasferirli su un piatto da 35 mm ad attacco ultra-basso.
    6. Lasciateli galleggiare durante la notte (ON) in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2, in modo che possano formare corpi embrioidi (EB).
      NOTA: i corpi embrioidi (EB) sono definiti come cluster sferoidi fluttuanti o aggregati di hIPSC.
    7. Trasferire gli EB in piatti da 35 mm rivestiti con poli-L-ornitina/laminina (PO/lam) in 2 mL NIM + 10 μM di Y-27632.
    8. Aggiornamento giornaliero del mezzo di induzione NSPC (NIM senza Y-27632) fino alla formazione di rosette neurali che richiede circa 12-14 giorni. Controllare al microscopio.
      NOTA: Dopo questa fase le rosette neurali possono essere espanse, differenziate ed elaborate per l'analisi immunocolorante o dissociate per ottenere cellule staminali neurali isolate e progenitrici (NSPC).
  2. Espansione della rosetta neurale e differenziazione precoce
    1. Taglia le rosette neurali in uno schema a griglia con un ago e sposta i grappoli usando un raschietto cellulare.
    2. Trasferire le rosette in una piastra a 4 pozzetti contenente un coperchio di vetro rivestito con PO/lam (4-5 rosette/pozzetto) in 0,5 mL di mezzo di manutenzione NSPC (NMM).
    3. Incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
    4. Aggiorna NMM a giorni alterni fino al giorno 20.
    5. Dal giorno 20, le rosette neurali di coltura in 0,5 mL di citochine hanno impoverito NMM per consentire la differenziazione. Aggiorna il mezzo ogni 2-3 giorni.
    6. Al giorno 30 e al giorno 40 (10 o 20 giorni di differenziazione), fissare le rosette con 0,5 ml di PFA al 4%, 20 minuti, RT.
  3. Biogenesi pc e analisi funzionale su NSPC isolati
    1. Dissociazione NSPC
      1. Tagliare le rosette neurali dal passaggio 1.1.8 in uno schema a griglia con un ago e rimuovere i grappoli usando un raschietto cellulare. Trasferire le cellule in piastre da 35 mm rivestite di PO/lam in 2 ml di NMM e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      2. Aggiornare NMM a giorni alterni fino alla confluenza (circa 5-7 giorni).
      3. Dopo aver raschiato via le grandi e chiare cellule che circondano le rosette neurali, raccoglierle manualmente e trasferirle su piatti da 35 mm freschi rivestiti di PO / lam per arricchire le NSPC e esaurire i tipi di cellule non neurali.
      4. Dopo uno o due passaggi manuali (ripetere il passaggio 1.3.1.3, se necessario) necessari per rimuovere tutti i tipi di cellule contaminanti, rimuovere il mezzo e risciacquare con PBS.
      5. Aggiungere 300 μL di tripsina allo 0,05% e incubare per 5 minuti a 37 °C fino a quando la maggior parte delle cellule si stacca.
      6. Aggiungere 2 ml del mezzo contenente il 10% di FBS (DMEM + 10% FBS) per inattivare la tripsina. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù tre volte per rompere i grumi cellulari.
      7. Centrifuga a 300 x g per 5 min.
      8. Aspirare accuratamente il surnatante e risospese le cellule in NMN.
      9. Seminare gli NSPC dissociati come singole cellule (1 x 105 cellule/cm2) in NMM su piatti rivestiti di PO/lam e incubarli in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      10. Espandi NSPC in NMM cambiando il mezzo a giorni alterni.
        NOTA: gli NSPC sono seminati ad alta densità per evitare differenziazioni.
    2. Analisi della biogenesi del PC
      1. Seminare NSPC dissociati a 100.000 cellule/cm2 e incubarli in un incubatore umidificato a 37 °C e co2 al 5% in NMM per 2 giorni.
      2. Aspirare il mezzo e affamare le NSPC nel mezzo impoverito di citochine (mezzo di fame NSPC, Tabella supplementare 1) per 48 ore.
      3. Correggi NSPC con PFA al 4% per 20 minuti a RT.
      4. Lavare due volte con PBS per 5 minuti a RT prima dell'immunocolorazione.
    3. Analisi delle funzioni del PC: percorso di segnalazione SHH
      1. NSPC dissociati con semi a 100.000 cellule/cm2 su vetrini a 8 camere rivestiti di PO/lam (300 μL) o piatti T25 (5 ml) e incubano in un incubatore umidificato a 37 °C e CO2 al 5% in NMM per 2 giorni.
      2. NSPC affamati in mezzo di fame NSPC (300 μL per pozzetto di slitta a 8 pozzetti e 5 mL in pallone T25) per 48 ore.
      3. Per indurre la via SHH, incubare le NSPC con il mezzo di fame integrato con SHH ricombinante (100 ng/mL) o SAG (500 nM); (150 μL per pozzetto di uno scivolo a camera a 8 pozzetti e 2 mL in pallone T25) per 24 ore.
      4. Fissare NSPC coltivati su vetrini a camera a 8 pozzetti in 250 μL di PFA al 4% per pozzetto per 20 minuti a RT e lavarli due volte con 250 μL di PBS per 5 minuti a RT prima dell'analisi immunocolorante.
      5. Rimuovere il mezzo e lavare gli NSPC coltivati in piatti T25 con PBS.
      6. Aggiungere 500 μL di tripsina allo 0,05% e incubare per 5 minuti a 37 °C fino a quando le cellule si staccano.
      7. Aggiungere 2 mL di mezzo contenente il 10% di FBS (DMEM + 10% FBS) per inattivare la tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mL.
      8. Centrifugare a 300 x g per 5 min e aspirare accuratamente il surnatante per ottenere pellet NSPC che possono essere crioconservati a -80 °C prima dell'estrazione dell'RNA e dell'analisi RT-PCR.

2. Generazione di organoidi del proencefalo dorsale

  1. Coltura unicellulare di hIPSC
    1. Inizia con le colture hIPSC che ospitano grandi colonie regolari che mostrano una differenziazione inferiore al 10% e che sono state passate quasi una volta. Assicurarsi che le cellule non siano confluenti per più dell'80%.
    2. Lavare le colonie con 2 ml di PBS.
    3. Aggiungere 500 μL di Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
    4. Aspirare il GCDR e aggiungere 2 mL di mTeRS1 medium integrato con 5 μM di Y-27632.
    5. Pipettare delicatamente le cellule su e giù 10 volte per dissociare tutte le colonie in singole cellule.
    6. Trasferire le cellule su piatti rivestiti in vitronectina e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Eseguire almeno 1 passaggio delle hIPSC utilizzando GCDR prima dell'esperimento di differenziazione per adattare le hIPSC alle condizioni di coltura monocellulare.
  2. Il giorno 0, consentire alle hIPSC di formare corpi embrionali in mezzo EB contenenti una bassa concentrazione di FGF2 e un'alta concentrazione di inibitore della roccia necessaria per la sopravvivenza all'hIPSC. Per fare ciò, segui i passaggi seguenti.
    1. Lavare le colonie con 2 ml di PBS.
    2. Aggiungere 500 μL di Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) e incubare per 5-7 minuti a 37 °C.
    3. Aspirare il GCDR e aggiungere 1 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632; Utilizzare una pipetta da 1 mL per staccare delicatamente le cellule e trasferirle in un tubo conico da 15 mL.
    4. Risciacquare ancora una volta con 2 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632, trasferire le cellule rimanenti nel tubo conico da 15 mL. Aggiungere immediatamente 3 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632 al tubo conico e omogeneizzare delicatamente la soluzione utilizzando una pipetta da 5 mL.
    5. Centrifugare le cellule dissociate a 100 x g per 5 min.
    6. Aspirare delicatamente il surnatante e risospese le cellule in 6 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632.
    7. Centrifugare le celle a 100 x g per 5 min.
    8. Aspirare il surnatante e risospese le cellule in 1 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632. Utilizzare una pipetta da 1 mL per dissociare delicatamente le cellule in una sospensione a cella singola.
    9. Immediatamente dopo aver risospeso le cellule, diluirle e contarle.
    10. Diluire il volume corretto di sospensione cellulare (contenente 900.000 cellule) in 30 mL di mezzo EB integrato con 50 μM di Y-27632 e 4 ng/mL di bFGF e mescolare delicatamente la soluzione.
    11. Piastra 9.000 celle/pozzo in una piastra 96U di attacco ultra-bassa (300 μL/pozzetto). Per evitare fastidiose emissioni di EB, incubare la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 fino al Giorno 3 senza cambio di mezzo.
  3. Induzione neurale (doppia inibizione SMAD)
    1. Il giorno 3, assicurati che gli EB misurino 300-400 μm e mostrino bordi regolari. Se vengono raggiunti entrambi i criteri, sostituire metà del mezzo (150 μL) con un mezzo di induzione-1 contenente inibitori SMAD doppi, portando a un illuminamento del contorno degli EB dal giorno 6 al giorno 7 indicando differenziazione neuroectodermica (Tabella supplementare 2).
    2. Il giorno 4, sostituire 3/4 del mezzo (225 μL) con il mezzo di induzione-1.
    3. Il giorno 6 e il giorno 8: rinfrescare metà dell'induzione media-1 (150 μL).
  4. Incorporamento di organoidi nella matrice della membrana basale (Giorno 10)
    1. Il giorno 10, incorporare gli EB nella matrice della membrana basale ridotta del fattore di crescita (BMM).
      NOTA: Da questo passaggio, utilizzare sempre forbici sterili per tagliare l'apertura delle punte delle pipette per evitare di danneggiare gli organoidi mediante ripetuti pipettaggio.
    2. Primo trasferimento di circa 15-17 organoidi in tubi conici. Lascia che gli EB si depositino e rimuovi il mezzo. Aggiungere 50 μL di media-2 di induzione e trasferirli in un tubo microcentrifuga contenente 100 μL di BMM.
    3. Distribuire la miscela matrice-EB sul centro di un pozzetto di una piastra di attacco ultra-bassa e separare gli EB per evitare che si fondano.
    4. Lasciare solidificare il BMM nell'incubatore a 37 °C per 45 min.
    5. Aggiungere 3 mL di induzione medium-2 in ogni pozzetto e mettere la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2.
      NOTA: Assicurarsi che questa procedura venga eseguita il più rapidamente possibile poiché BMM si solidifica a temperatura ambiente.
  5. Coltura stazionaria di organoidi incorporati nella matrice della membrana basale
    1. Giorno 12, 14: Aggiornamento induzione media-2.
    2. Giorno 16: Aggiornare l'induzione media-2 e controllare al microscopio l'espansione delle anse neuroepiteliali.
  6. Dissociazione e coltura della matrice della membrana basale su uno shaker orbitale
    1. Il giorno 17, dissociare gli organoidi dal BMM pipettando su e giù 10 volte con una pipetta da 5 ml e trasferirli in differenziazione media-1 (senza vitamina A). Incubare su uno shaker orbitale a 80 giri/min in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2 per migliorare l'assorbimento nutrizionale.
      NOTA: Utilizzare un incubatore diverso per la coltura stazionaria e la coltura su uno shaker orbitale per evitare vibrazioni dannose per la crescita delle cellule hIPS aderenti.
    2. Giorno 19: Aggiornamento differenziazione medio-1.
    3. Giorno 21: Cambiare la differenziazione da medio-1 a differenziazione da media-2 (con vitamina A).
    4. Dal giorno 23 al giorno 35: aggiorna il mezzo con differenziazione medio-2 ogni 2-3 giorni.
    5. Dal giorno 35 al giorno 70: aggiorna la differenziazione medio-2 con l'1% di BMM e aggiorna ogni 2-3 giorni.
    6. Raccogliere gli organoidi dopo 28, 42 e 70 +/- 2 giorni di differenziazione e fissarli durante la notte a 4 °C, in 5 mL 4% PFA su un tubo conico da 15 ml.
    7. Per ulteriori analisi di immunocolorazione toto o fluttuanti, gli organoidi vengono quindi risciacquati due volte in PBS e conservati a 4 °C in PBS + 0,05% di azide di sodio.
    8. Per l'analisi immunocolorante su sezioni congelate, immergere organoidi fissi al 4% di PFA in 10 mL 30% di saccarosio a +4 °C ON (o fino a quando gli organoidi non affondano). Incorporarli in una matrice di incorporamento congelata e conservarli a -80 ° C fino alla criosezione.

3. In toto immunolabeling, clearing, and lightsheet acquisition of dorsal forebrain organoids

  1. Fissazione
    1. Raccogliere gli organoidi in piastre a 6 pozzetti, rimuovere il mezzo e fissarli con 2 ml di PFA al 4%, a 4 °C, durante la notte.
    2. Eseguire tre lavaggi in 2 ml di PBS a temperatura ambiente.
    3. Trasferire gli organoidi in tubi da 2 mL e conservare a 4 °C in 2 mL di PBS + 0,05% di sodio azide.
  2. Permeabilizzazione
    1. Incubare gli organoidi in 1 mL di PBS contenenti lo 0,2% di Triton X100 a RT per 1 ora. Fallo due volte.
    2. Incubare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Triton X100 e il 20% di DMSO, a 37 °C, durante la notte.
    3. Incubare in 1 mL di PBS contenente 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Desossicolato, 0,1% NP40 e 20% DMSO, a 37 °C, durante la notte.
    4. Incubare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Triton-X100, a RT, per 1 ora. Fallo due volte.
  3. Blocco e immunolabeling
    1. Blocco in 1 mL di soluzione bloccante (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum, 10% DMSO), a 37 °C, ON.
    2. Incubare con anticorpi primari diluiti in 250 μL di PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL di eparina, 5% DMSO e 3% Siero d'asino, a 37 °C, per 2 giorni.
    3. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% di Tween20 e 0,1 μg/mL di eparina, per 1 ora, a 37 °C. Fallo quattro volte.
    4. Lavare in 1 mL di PBS contenente lo 0,2% di Tween20 e 0,1 μg/mL di eparina, durante la notte, a 37 °C.
    5. Incubare con anticorpi secondari diluiti in 250 μL di PBS contenenti 0,2% di Tween 20, 0,1 μg/mL di eparina e 3% di siero d'asino, a 37 °C, per 2 giorni.
    6. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% tween 20 e 0,1 μg/mL di eparina, per 1 ora, su una ruota, a RT. Fallo quattro volte.
    7. Lavare in 1 mL di PBS contenente 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL di eparina, durante la notte, su una ruota, a RT.
    8. Lavare in 1 mL di PBS, per 24 ore, a RT.
    9. Stock a +4 °C in 1 mL di PBS e 0,05% di azide di sodio fino alla compensazione.
  4. Clearing in TDE (2,2′ -Tiodietanolo)
    1. Incubare gli organoidi in 1 mL di TDE al 30% (3 mL di TDE + 7 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
    2. Incubare in 1 mL di TDE al 60% (6 mL di TDE + 4 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
    3. Incubare in 1 mL di TDE all'80% (8 mL di TDE + 2 mL di PBS), per 24 ore, a RT.
  5. Incorporamento di organoidi prima dell'acquisizione di fogli leggeri
    NOTA: utilizzare un sistema personalizzato; realizzato con una siringa da 1 mL con la punta tagliata con un bisturi.
    1. Preparare 100 mL di agarosio a bassa fusione al 4% in soluzione di TDE al 60% e aliquota in tubi da 2 mL. Conservare a +4 °C.
    2. Prima dell'incorporazione dell'organoide, preriscaldare un tubo contenente 1,5 mL di agarosio a bassa fusione al 4% in TDE al 60% a bagnomaria a 37 °C fino a quando non si liquefa.
    3. Nel frattempo, prepara un sistema di stampaggio su misura realizzato con una siringa da 1 mL la cui punta viene tagliata usando un bisturi.
    4. Pompare nella siringa 600 μL della soluzione gel usando lo stantuffo.
    5. Posizionare il campione utilizzando una punta di pipetta ingrandita la cui apertura è stata tagliata con forbici sterili.
    6. Riempire la siringa con 400 μL di soluzione gel in modo che il campione sia posizionato entro il terzo inferiore della siringa.
    7. Lasciare polimerizzare il gel e conservare in soluzione di TDE all'80% a 4 °C al riparo dalla luce fino all'acquisizione.
    8. Per l'acquisizione di fogli Light, utilizzare un obiettivo 20x immerso in una soluzione TDE all'80% aggiunta nella camera del campione per consentire di adattarsi con precisione all'indice di rifrazione del metodo di compensazione.
    9. Inserire la siringa contenente l'organoide incorporato nell'agarosio nel portacampioni più grande progettato per ospitare una siringa da 1 mL il cui stantuffo può essere azionato per posizionare l'organoide davanti all'obiettivo.
      NOTA: L'acquisizione di un intero organoide in fogli leggeri richiede circa 5-10 min.

4. Immunocolorazione e pulizia di sezioni fluttuanti di organoidi del proencefalo dorsale

  1. Fissazione, incorporamento di agarosio e sezionamento degli organoidi
    1. Raccogliere gli organoidi dopo 28, 42 e 70 +/- 2 giorni di differenziazione in una piastra a 6 pozzetti e fissare durante la notte a 4 °C in 2 ml di PFA al 4%.
    2. Risciacquare due volte in 2 mL di PBS e conservare a 4 °C in 2 mL di PBS + 0,05% di sodio azide.
    3. Incorporare gli organoidi fissi in agarosio a bassa fusione al 4% in uno stampo di incorporamento in plastica (7 x 7 mm). Rimuovere con cura il blocco di agarosio dallo stampo di plastica e incollarlo allo stadio di vibratoma.
    4. Sezionare gli organoidi incorporati utilizzando un vibratoma per ottenere sezioni flottanti da 150 μm trasferite in un pozzo di una piastra a 24 pozzetti contenente 500 μL di PBS utilizzando un pennello per evitare di danneggiare le sezioni.
      NOTA: si raccomanda l'agarosio a bassa fusione in quanto la sua temperatura di fusione è solo di circa 60 °C. Preparare l'agarosio a bassa fusione al 4% in soluzione di PBS e lasciarlo raffreddare appena sopra i 37 °C a bagnomaria prima dell'incorporamento dell'organoide.
  2. Permeabilizzazione, blocco e immunocolorazione
    1. Incubare le sezioni in 500 μL di PBS contenenti lo 0,3% di Triton X100, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo tre volte.
    2. Incubare le sezioni in 500 μL di PBS contenenti lo 0,3% di Triton X100 e il 5% di latte non grasso, a RT, sotto agitazione, per 2 ore.
    3. Incubare le sezioni in 250 μL di soluzione anticorpale primaria (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% di latte non grasso), sotto agitazione, a +4 °C, durante la notte.
    4. Lavare le sezioni in 500 μL di PBS, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo quattro volte.
    5. Incubare le sezioni in 250 μL di soluzione anticorpale secondaria (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% di latte non grasso), a RT, sotto agitazione, per 2 ore.
    6. Lavare le sezioni in 500 μL di PBS, a RT, sotto agitazione, per 20 min. Fallo quattro volte.
    7. Conservare le sezioni in 500 μL di PBS, a +4° C fino alla pulizia.
  3. Clearing in TDE (2,2′ -Tiodietanolo)
    1. Incubare le sezioni in 500 μL di 30% e 60% di TDE per 1 ora ciascuna a RT, e poi in 500 μL di 80% di TDE durante la notte, a RT.
    2. Conservare le sezioni eliminate in 500 μL di TDE all'80% fino all'acquisizione a +4 °C.
  4. Montaggio di sezioni flottanti prima dell'acquisizione con confocale a scansione risonante
    1. Montare una sezione flottante in una camera sigillata che consente di mantenere il campione in soluzione TDE all'80% e progettata per adattarsi a uno stadio XY motorizzato di microscopi confocali.
    2. Metti un coverslip rotondo nel sistema della camera.
    3. Trasferire con cura la sezione immunocolorata eliminata usando un pennello.
    4. Riempire la camera con una soluzione di TDE all'80%.
    5. Aggiungi due coverslip standard più un secondo coverslip rotondo e un sigillo in silicone.
    6. Avvitare l'anello di avvitamento della camera per sigillare perfettamente il sistema.

5. Foglio leggero e analisi confocale a scansione risonante

  1. Elabora le acquisizioni di fogli luminosi e scansioni risonanti utilizzando un software che consente la visualizzazione e l'analisi 3D dell'intero campione immunocolorato.
    NOTA: Tale software consente di aprire rapidamente enormi dati per creare facilmente istantanee e animazioni. Permette di spostare il campione in diversi orientamenti e di generare viste 2D grazie a uno strumento slicer 2D in diversi orientamenti, XY e YZ ad esempio.
  2. Per il rilevamento automatico sia dei centrosomi che delle ciglia primarie, utilizzare una procedura guidata spot che consenta di quantificare il loro numero in condizioni patologiche rispetto a quelle di controllo.
  3. Per la ricostruzione 3D del PC che consente una misurazione precisa della loro lunghezza, utilizzare una procedura guidata del filamento per fissare manualmente il punto di partenza del PC e il software utilizza il segnale di fluorescenza per ricostruire il PC con precisione.

Risultati

Modelli cellulari 2D hIPS per studiare la biogenesi e la funzione del cilio primario
Il protocollo qui dettagliato è stato adattato da studi pubblicati in precedenza20,21,22. Questo protocollo consente la generazione di strutture neurali a rosetta che contengono progenitori neocorticali e neuroni simili a quelli osservati nella neocorteccia in via di sviluppo. La convalida dettagliata può essere eseguita me...

Discussione

I PC sono ora considerati organelli chiave che regolano i passaggi cruciali durante il normale sviluppo corticale cerebrale18,19,31 tra cui l'espansione e l'impegno NSPC8,9,10,11,12, nonché la migrazione neuronale13,14

Divulgazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Agence Nationale de la Recherche (ANR) a S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) e N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 e ANR-19-CE16-0002-01). LB è supportato dall'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) e dalla Fondation Bettencourt Schueller (programma MD-PhD). L'Imagine Institute è sostenuto da finanziamenti statali dell'ANR nell'ambito del programma Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, progetti CrossLab) e come parte del secondo programma Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

Riferimenti

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