АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем подробные протоколы для генерации и характеристики 2D и 3D моделей неокортикального развития на основе 2D и 3D индуцированных человеком стволовых клеток (hIPSC), а также дополнительные методологии, позволяющие качественно и количественно анализировать биогенез и функцию первичной реснички (ПК).

Аннотация

Первичные реснички (ПК) представляют собой неподвижные динамические органеллы на основе микротрубочек, которые выступают из поверхности большинства клеток млекопитающих. Они выходят из более старой центриолы во время фазы G1 / G0 клеточного цикла, в то время как они разбираются, когда клетки возвращаются в клеточный цикл на границе фазы G2 / M. Они функционируют как концентраторы сигналов, обнаруживая и преобразуя внеклеточные сигналы, имеющие решающее значение для многих клеточных процессов. Как и в большинстве типов клеток, все неокортикальные нервные стволовые и прогениторные клетки (НСПК) содержат ПК, позволяющий им ощущать и передавать специфические сигналы, необходимые для нормального развития коры головного мозга. Здесь мы предоставляем подробные протоколы для создания и характеристики двумерных (2D) и трехмерных (3D) клеточных моделей из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hIPSC) для дальнейшего анализа участия ПК во время неокортикального развития. В частности, мы представляем протоколы для изучения биогенеза и функции ПК в 2D-нейронных розетках NFPC, включая трансдукцию пути Sonic Hedgehog (SHH). Чтобы воспользоваться преимуществами трехмерной (3D) организации церебральных органоидов, мы опишем простой метод 3D-визуализации иммуноструктурированных церебральных органоидов. После оптической очистки быстрое получение целых органоидов позволяет обнаруживать как центросомы, так и ПК на неокортикальных предшественниках и нейронах всего органоида. Наконец, мы подробно описываем процедуру иммуноокрашения и очистки толстых свободно плавающих органоидных срезов, сохраняющих значительную степень пространственной 3D-информации и позволяющих получать данные с высоким разрешением, необходимые для детального качественного и количественного анализа биогенеза и функции ПК.

Введение

Первичные реснички (ПК) представляют собой органеллы на основе микротрубочек, которые чувствуют и передают множество химических и механических сигналов из внеклеточной среды. В частности, ПК является центральной органеллой для трансдукции сигнального пути Ежа у позвоночных1,2. В то время как большинство нервных клеток уже давно имеют ПК, вклад этой органеллы в формирование центральной нервной системы уже давно недооценен. Исследования неокортикального развития привели к открытию нескольких нервных стволовых и прародительных клеток (НСПК), все из которых содержат ПК, местоположение которого, как было предложено, имеет решающее значение для определения судьбы прародителя3,4,5,6,7. Было показано, что ПК имеет решающее значение для клеточных механизмов, которые необходимы для нормального развития коры головного мозга, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также апикобазальную полярность радиального глиального каркаса, поддерживающего миграцию нейронов13. Кроме того, ПК требуются при тангенциальной миграции интернейронов на кортикальную пластину14,15. Наконец, предложена роль ПК в установлении синаптических связей нейронов в коре головного мозга16,17. В целом, эти результаты доказывают решающую роль ПК на основных этапах развития коры головного мозга18,19 и повышают необходимость исследования их участия в патологических механизмах, лежащих в основе аномалий развития коры головного мозга.

Недавние исследования в значительной степени улучшили наше понимание важных клеточных и молекулярных различий между развитием коры в моделях человека и животных, подчеркнув необходимость разработки модельных систем человека. С этой точки зрения, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hIPSC) представляют собой многообещающий подход к изучению патогенеза заболеваний в соответствующем генетическом и клеточном контексте. Адгезивные двумерные (2D) клеточные модели или нейронные розетки содержат НСПК, аналогичные тем, которые наблюдаются в развивающейся коре головного мозга, которые организуются в розеткообразные структуры, показывающие правильную апикобазальную полярность20,21,22. Кроме того, трехмерная (3D) система культивирования позволяет генерировать органоиды дорсального переднего мозга, которые повторяют многие особенности развития коры головного мозга человека23,24,25,26. Эти два комплементарных подхода к моделированию на основе клеток предлагают захватывающие перспективы для препарирования участия ПК во время нормального и патологического развития коры головного мозга.

Здесь мы предоставляем подробные протоколы для генерации и характеристики нейронных розеток и производных НСПК, а также органоидов дорсального переднего мозга. Мы также предоставляем подробные протоколы для анализа биогенеза и функции ПК, присутствующего на НСПК, путем тестирования трансдукции пути Sonic Hedgehog и анализа динамики ключевых молекул, участвующих в этом пути. Чтобы воспользоваться преимуществами 3D-организации церебральных органоидов, мы также создали простой и экономически эффективный метод 3D-визуализации иммуноокрашенных церебральных органоидов, позволяющий быстро получать, благодаря световому листовому микроскопу, весь органоид с высоким разрешением, позволяющим визуализировать ПК на всех типах неокортикальных предшественников и нейронов всего органоида. Наконец, мы адаптировали иммуногистохимию на свободно плавающих участках 150 мкм с последующей очисткой и получением с помощью резонансного сканирующего конфокального микроскопа, позволяющего получать изображения с высоким разрешением, что необходимо для детального анализа биогенеза и функции ПК. В частности, программное обеспечение для 3D-визуализации позволяет осуществлять 3D-реконструкцию ПК с последующим анализом морфологических параметров, включая длину, количество и ориентацию ПК, а также измерение интенсивности сигнала цилиарных компонентов вдоль аксонемы.

протокол

1. Генерация 2D hIPS клеточных моделей неокортикального развития

  1. Формирование нейронных розеток
    1. Начните с культур hIPSC, содержащих большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и не более 80% слияния.
    2. Промывайте hIPSC 2 мл PBS.
    3. Добавьте 2 мл индукционной среды NSPC, дополненной ингибитором Rock (NIM + 10 мкМ Y-27632).
    4. Вручную рассекайте каждую колонию hIPSC из одной 35-миллиметровой чашки с помощью иглы, чтобы разрезать каждую колонию точно в горизонтальном и вертикальном направлениях, чтобы создать узор шахматной доски, разделяющий каждую колонию на равные кластеры.
    5. Отсоедините колонию с помощью клеточного скребка и перенесите их на тарелку со сверхнизким креплением 35 мм.
    6. Пусть они плавают в течение ночи (ON) в увлажненном инкубаторе при 37 ° C и 5% CO2, чтобы они могли образовывать эмбриональные тела (EB).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбриоидные тела (ЭБ) определяются как плавающие сфероидные кластеры или агрегаты hIPSC.
    7. Переложите ЭБ в поли-L-орнитин/ламинин (PO/лам) покрытые 35 мм тарелки в 2 мл NIM + 10 мкМ Y-27632.
    8. Ежедневное обновление индукционной среды NSPC (NIM без Y-27632) до образования нейронных розеток занимает примерно от 12 до 14 дней. Проверьте под микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После этого этапа нейронные розетки могут быть расширены, дифференцированы и обработаны для анализа иммуноокрашивания или диссоциированы для получения изолированных нервных стволовых и прогениторных клеток (НСПК).
  2. Расширение нейронной розетки и ранняя дифференциация
    1. Вырежьте нейронные розетки в виде сетки с помощью иглы и вытесните кластеры с помощью клеточного скребка.
    2. Переложите розетки в 4-луночную пластину, содержащую стеклянную крышку с PO/лам-покрытием (4-5 розеток/лунку) в 0,5 мл среды технического обслуживания NSPC (NMM).
    3. Инкубируют пластину в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
    4. Обновляйте NMM через день до 20 дня.
    5. С 20-го дня культивирование нейронных розеток в 0,5 мл цитокина истощает НММ, чтобы обеспечить дифференцировку. Обновляйте среду каждые 2-3 дня.
    6. На 30-й и 40-й день (10 или 20 дней дифференциации) зафиксируют розетки с 0,5 мл 4% ПФА, 20 мин, РТ.
  3. Анализ биогенеза и функций ПК на изолированных НСПК
    1. Диссоциация NSPC
      1. Вырежьте нейронные розетки с шага 1.1.8 в сетчатый узор с помощью иглы и вытесните кластеры с помощью клеточного скребка. Переложите клетки в покрытые PO/лам 35 мм чашки в 2 мл НММ и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      2. Обновляйте НММ через день до слияния (примерно 5-7 дней).
      3. После соскабливания больших, прозрачных клеток, окружающих нейронные розетки, соберите их вручную и перенесите на свежие 35-миллиметровые чашки с покрытием PO / лам, чтобы обогатить NPPC и истощить ненейронные типы клеток.
      4. После одного или двух ручных проходов (при необходимости повторите этап 1.3.1.3) необходимо удалить все загрязняющие типы клеток, удалить среду и промыть PBS.
      5. Добавьте 300 мкл 0,05% трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C до тех пор, пока большинство клеток не отсоединятся.
      6. Добавьте 2 мл среды, содержащей 10% FBS (DMEM + 10% FBS), чтобы инактивировать трипсин. Соберите клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл. Аккуратно пипеткой суспензию клетки вверх и вниз три раза, чтобы разбить клеточные сгустки.
      7. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.
      8. Осторожно аспирируйте супернатант и повторно суспендируйте клетки в NMN.
      9. Высевают диссоциированные НСПК в виде одиночных клеток (1 х 105 клеток/см2) в НММ на посуду, покрытую PO/ламом, и инкубируют их в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      10. Расширяйте НСПК в НММ, меняя среду через день.
        ПРИМЕЧАНИЕ: НСПК высеиваются с высокой плотностью, чтобы избежать дифференциации.
    2. Анализ биогенеза ПК
      1. Семена диссоциируют НСПК при 100 000 клеток/см2 и инкубируют их в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в NMM в течение 2 дней.
      2. Аспирировать среду и голодать НСПК в среде, обедненной цитокинами (среде голодания NSPC, дополнительная таблица 1) в течение 48 ч.
      3. Исправьте НСПК с 4% PFA в течение 20 мин при RT.
      4. Дважды промыть PBS в течение 5 мин при RT перед иммуноокрашиванием.
    3. Анализ функции ПК: сигнальный путь SHH
      1. Семена диссоциированных НСПК при 100 000 клеток/см2 на 8-луночных камерных слайдах с покрытием PO/лам (300 мкл) или T25 (5 мл) и инкубируют в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 в NMM в течение 2 дней.
      2. Голодать НСПК в голодной среде NSPC (300 мкл на скважину с 8-луночным камерным затвором и 5 мл в колбе T25) в течение 48 ч.
      3. Чтобы индуцировать путь SHH, инкубируют НСПК с голодующей средой, дополненной рекомбинантным SHH (100 нг/мл) или SAG (500 нМ); (150 мкл на скважину 8-луночного камерного затвора и 2 мл в колбе Т25) в течение 24 ч.
      4. Зафиксируйте НСПК, культивируемые на 8-луночных камерных слайдах в 250 мкл 4% PFA на скважину в течение 20 мин при РТ, и дважды промывайте их 250 мкл PBS в течение 5 мин при РТ перед иммуноокрашивающим анализом.
      5. Удалите среду и вымойте НСПК, культивированные в посуде T25, PBS.
      6. Добавьте 500 мкл 0,05% трипсина и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C до тех пор, пока клетки не отсоединятся.
      7. Добавьте 2 мл среды, содержащей 10% FBS (DMEM + 10% FBS), чтобы инактивировать трипсин и собрать клеточную суспензию в коническую трубку объемом 15 мл.
      8. Центрифугу при 300 х г в течение 5 мин и тщательно аспирируют супернатант для получения гранул NSPC, которые могут быть криоконсервированы при -80 °C перед экстракцией РНК и анализом ОТ-ПЦР.

2. Генерация органоидов дорсального переднего мозга

  1. Одноклеточная культура hIPSC
    1. Начнем с культур hIPSC, в которых обитают большие регулярные колонии, демонстрирующие дифференциацию менее 10% и которые были пройдены почти один раз. Убедитесь, что клетки не более чем на 80% сливаются.
    2. Промыть колонии 2 мл PBS.
    3. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток (GCDR) и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C.
    4. Аспирировать GCDR и добавить 2 мл среды mTeRS1, дополненной 5 мкМ Y-27632.
    5. Пипетку клеток осторожно вверх и вниз 10 раз, чтобы диссоциировать все колонии на отдельные клетки.
    6. Переложите клетки на посуду, покрытую витронектином, и инкубируйте в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните, по меньшей мере, 1 прохождение hIPSC с использованием GCDR до эксперимента дифференцировки для адаптации hIPSC к условиям одноклеточной культуры.
  2. На 0-й день позвольте hIPSC сформировать эмбриональные тела в среде EB, содержащей низкую концентрацию FGF2 и высокую концентрацию ингибитора горных пород, необходимую для выживания hIPSC. Для этого выполните следующие действия.
    1. Промыть колонии 2 мл PBS.
    2. Добавьте 500 мкл реагента для диссоциации клеток (GCDR) и инкубируйте в течение 5-7 мин при 37 °C.
    3. Аспирировать GCDR и добавить 1 мл среды EB с добавлением 50 мкМ Y-27632; Используйте пипетку 1 мл, чтобы аккуратно отсоединить клетки и перенести их в коническую трубку объемом 15 мл.
    4. Промыть еще раз 2 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632, перенести оставшиеся клетки в коническую трубку объемом 15 мл. Немедленно добавьте 3 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632, в коническую трубку и осторожно гомогенизируйте раствор с помощью пипетки 5 мл.
    5. Центрифугируют диссоциированные клетки при 100 х г в течение 5 мин.
    6. Осторожно аспирируют супернатант и повторно суспендируют клетки в 6 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632.
    7. Центрифугировать ячейки при 100 х г в течение 5 мин.
    8. Аспирировать супернатант и повторно суспендировать клетки в 1 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632. Используйте пипетку объемом 1 мл, чтобы аккуратно диссоциировать клетки в одноклеточную суспензию.
    9. Сразу после повторного использования клеток разбавьте и посчитайте их.
    10. Разбавить надлежащий объем клеточной суспензии (содержащей 900 000 клеток) в 30 мл среды EB, дополненной 50 мкМ Y-27632 и 4 нг/мл bFGF и осторожно перемешать раствор.
    11. Пластина 9 000 ячеек/лунка в сверхнизкую пластину 96U (300 мкл/лунка). Чтобы избежать нарушения образования ЭБ, инкубируйте пластину в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 до 3-го дня без изменения среды.
  3. Нейронная индукция (двойное ингибирование SMAD)
    1. На 3-й день убедитесь, что ЭБ измеряют 300-400 мкм и показывают регулярные границы. Если оба критерия достигнуты, замените половину среды (150 мкл) индукционной средой-1, содержащей двойные ингибиторы SMAD, что приведет к осветлению контура ЭБ с 6-го по 7-й день, что указывает на нейроэктодермальную дифференцировку (дополнительная таблица 2).
    2. На 4-й день замените 3/4 среды (225 мкл) на индукционную среду-1.
    3. На 6-й и 8-й день: Обновите половину индукционной среды-1 (150 мкл).
  4. Встраивание органоидов в матрицу базальной мембраны (День 10)
    1. На 10-й день встраивают ЭБ в матрицу базальной мембраны с уменьшенным фактором роста (BMM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе всегда используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать отверстие кончиков пипетки, чтобы избежать повреждения органоидов путем повторного пипетирования.
    2. Сначала переносят около 15-17 органоидов в конические трубки. Дайте EB осесть и удалите среду. Добавьте 50 мкл индукционной среды-2 и переложите их в микроцентрифужную трубку, содержащую 100 мкл BMM.
    3. Нанесите матрично-ЭБ-смесь на центр колодца пластины со сверхнизким креплением и отделите ЭБ, чтобы предотвратить их плавление.
    4. Дайте BMM затвердеть в инкубаторе при 37 °C в течение 45 мин.
    5. Добавьте 3 мл индукционной среды-2 в каждую лунку и поместите пластину в увлажненный инкубатор при 37 °C и 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что эта процедура выполнена как можно быстрее, так как BMM затвердевает при комнатной температуре.
  5. Стационарная культура органоидов, встроенных в матрицу базальной мембраны
    1. День 12, 14: Освежите индукционную среду-2.
    2. День 16: Освежите индукционную среду-2 и проверьте под микроскопом расширение нейроэпителиальных петель.
  6. Диссоциация и культивирование матрицы базальной мембраны на орбитальном шейкере
    1. На 17-й день диссоциируют органоиды от БММ путем пипетки вверх и вниз 10 раз пипеткой 5 мл и переносят их в дифференцирующую среду-1 (без витамина А). Инкубируйте на орбитальном шейкере со скоростью 80 оборотов в минуту в увлажненном инкубаторе при 37 °C и 5% CO2 для улучшения усвоения питательных веществ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте другой инкубатор для стационарной культуры и культивирования на орбитальном шейкере, чтобы избежать любых вибраций, наносящих ущерб росту клеток прилипшего hIPS.
    2. День 19: Обновление дифференциации среды-1.
    3. День 21: Изменение дифференцировки среды-1 на дифференцировочной среды-2 (с витамином А).
    4. С 23-го по 35-й день: Обновляйте среду с дифференцировкой-2 раза в 2-3 дня.
    5. С 35-го по 70-й день: Обновите дифференцировочную среду-2 с 1% BMM и обновляйте каждые 2-3 дня.
    6. Собирают органоиды через 28, 42 и 70 +/- 2 дня дифференцировки и фиксируют их на ночь при 4 °C, в 5 мл 4% PFA на конической трубке объемом 15 мл.
    7. Для дальнейшего анализа внутри или свободно плавающего иммунонаказания органоиды затем дважды промывают в PBS и сохраняют при 4 °C в PBS + 0,05% азида натрия.
    8. Для иммунонаказательного анализа на замороженных срезах погружают 4% фиксированных органоидов PFA в 10 мл 30% сахарозы при +4 °C ON (или до тех пор, пока органоиды не утонут). Вставьте их в замороженную матрицу встраивания и храните при температуре -80°C до криосечения.

3. In toto иммуномаркировка, очистка и получение светового листа органоидов дорсального переднего мозга

  1. Фиксация
    1. Соберите органоиды в 6-луночные пластины, удалите среду и зафиксируйте их 2 мл 4% PFA при 4 °C на ночь.
    2. Выполните три промывки в 2 мл PBS при комнатной температуре.
    3. Переведите органоиды в пробирки по 2 мл и храните при 4 °C в 2 мл PBS + 0,05% азида натрия.
  2. Пермеабилизация
    1. Инкубируют органоиды в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Triton X100 при RT в течение 1 ч. Сделайте это дважды.
    2. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Triton X100 и 20% DMSO, при 37 °C, в течение ночи.
    3. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащего 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% дезоксихолата, 0,1% NP40 и 20% DMSO, при 37 °C, в течение ночи.
    4. Инкубировать в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Triton-X100, на RT, в течение 1 ч. Сделайте это дважды.
  3. Блокирование и иммуномаркировка
    1. Блокируют в 1 мл блокирующего раствора (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Ослиная сыворотка, 10% DMSO), при 37 °C, ON.
    2. Инкубировать с первичными антителами, разведенными в 250 мкл PBS, 0,2% Tween20, 0,1 мкг/мл гепарина, 5% DMSO и 3% Ослиной сыворотки, при 37 °C, в течение 2 дней.
    3. Промывать в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween20 и 0,1 мкг/мл гепарина, в течение 1 ч при 37 °C. Сделайте это четыре раза.
    4. Промыть в 1 мл PBS, содержащих 0,2% Tween20 и 0,1 мкг/мл гепарина, на ночь при 37 °C.
    5. Инкубат с вторичными антителами, разведенными в 250 мкл PBS, содержащих 0,2% Tween 20, 0,1 мкг/мл гепарина и 3% Ослиной сыворотки, при 37 °C, в течение 2 дней.
    6. Промывайте в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween 20 и 0,1 мкг/мл гепарина, в течение 1 ч, на колесе, при RT. Сделайте это четыре раза.
    7. Промыть в 1 мл PBS, содержащего 0,2% Tween 20 и 0,1 мкг/мл гепарина, на ночь, на колесе, на RT.
    8. Промыть в 1 мл PBS, в течение 24 ч, на RT.
    9. Хранить при +4 °С в 1 мл PBS и 0,05% азида натрия до очистки.
  4. Очистка в ТДЭ (2,2′ -тиодиэтанол)
    1. Инкубируют органоиды в 1 мл 30% TDE (3 мл TDE + 7 мл PBS), в течение 24 ч, при RT.
    2. Инкубировать в 1 мл 60% TDE (6 мл TDE + 4 мл PBS), в течение 24 ч, на RT.
    3. Инкубировать в 1 мл 80% ТДЭ (8 мл ТДЭ + 2 мл ПБС), в течение 24 ч, на РТ.
  5. Встраивание органоидов перед приобретением светового листа
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте индивидуальную систему; изготовлен шприцем объемом 1 мл с наконечником, вырезанным скальпелем.
    1. Готовят 100 мл 4% низкоплавкой агарозы в 60% растворе ТДЭ и аликвоту в пробирках по 2 мл. Сохраняется при температуре +4 °C.
    2. Перед встраиванием органоидов предварительно разогрейте одну трубку, содержащую 1,5 мл 4% низкоплавкой агарозы в 60% ТДЭ, на водяной бане при 37 °C до тех пор, пока она не разжижится.
    3. Тем временем подготовьте изготовленную на заказ систему формования из шприца объемом 1 мл, кончик которого отрезается с помощью скальпеля.
    4. Вставьте в шприц 600 мкл раствора геля с помощью плунжера.
    5. Расположите образец с помощью увеличенного наконечника пипетки, отверстие которого было разрезано стерильными ножницами.
    6. Заполните шприц 400 мкл раствора геля так, чтобы образец располагался в нижней трети шприца.
    7. Дайте гелю полимеризоваться и хранить в 80% растворе TDE при 4 °C, защищенном от света, до момента получения.
    8. Для получения светового листа используйте 20-кратный объектив, погруженный в 80% раствор TDE, добавленный в камеру для отбора проб, чтобы точно отрегулировать показатель преломления метода очистки.
    9. Вставьте шприц, содержащий органоид, встроенный в агарозу, в самый большой держатель образца, предназначенный для размещения шприца объемом 1 мл, плунжер которого может быть использован для позиционирования органоида перед объективом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение легкого листа всего органоида занимает примерно от 5 до 10 минут.

4. Иммуноокрашивание и очистка свободно плавающих участков органоидов дорсального переднего мозга

  1. Фиксация, встраивание агарозы и сечение органоидов
    1. Собирают органоиды через 28, 42 и 70 +/- 2 дня дифференцировки в 6-луночную пластину и фиксируют на ночь при 4 °C в 2 мл 4% PFA.
    2. Промыть дважды в 2 мл PBS и сохранить при 4 °C в 2 мл PBS + 0,05% азида натрия.
    3. Встраиваем фиксированные органоиды в 4% низкоплавкую агарозу в пластиковую форму для встраивания (7 х 7 мм). Аккуратно извлеките блок агарозы из пластиковой формы и приклейте его к стадии вибратома.
    4. Секционирование встроенных органоидов с помощью вибратома для получения 150 мкм свободно плавающих секций, перенесенных в скважину из 24-луночной пластины, содержащей 500 мкл PBS, с помощью кисти, чтобы избежать повреждения секций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется низкоплавящая агароза, так как температура ее плавления составляет всего около 60 °C. Приготовьте 4% низкоплавкущую агарозу в растворе PBS и оставьте ее остывать чуть выше 37 °C на водяной бане перед встраиванием органоидов.
  2. Пермеабилизация, блокирование и иммуноокрашивание
    1. Инкубируют срезы в 500 мкл PBS, содержащие 0,3% Triton X100, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это три раза.
    2. Инкубируют участки в 500 мкл PBS, содержащих 0,3% Triton X100 и 5% обезжиренного молока, на RT, при перемешивании, в течение 2 ч.
    3. Инкубируют срезы в 250 мкл раствора первичных антител (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% обезжиренное молоко), при перемешивании, при +4 °C, в течение ночи.
    4. Промыть срезы в 500 мкл PBS, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это четыре раза.
    5. Инкубировать срезы в 250 мкл раствора вторичных антител (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% обезжиренное молоко), на RT, при перемешивании, в течение 2 ч.
    6. Промыть срезы в 500 мкл PBS, на RT, при перемешивании, в течение 20 мин. Сделайте это четыре раза.
    7. Хранить срезы в 500 мкл PBS при температуре +4°C до очистки.
  3. Очистка в ТДЭ (2,2′ -тиодиэтанол)
    1. Инкубируют срезы в 500 мкл 30% и 60% TDE в течение 1 ч каждый при RT, а затем в 500 мкл 80% TDE в течение ночи, на RT.
    2. Хранить очищенные срезы в 500 мкл 80% TDE до получения при температуре +4 °C.
  4. Монтаж свободно плавающих секций перед приобретением с резонансным сканированием конфокаль
    1. Установите свободно плавающую секцию в герметичной камере, позволяющую поддерживать образец в 80% растворе TDE и предназначенную для адаптации на моторизованной ступени XY конфокальных микроскопов.
    2. Поместите одну круглую крышку в систему камеры.
    3. Аккуратно перенесите очищенный иммуноокрашенный участок с помощью кисти.
    4. Заполните камеру 80% раствором TDE.
    5. Добавьте два стандартных обтекателя плюс один второй круглый чехл и силиконовое уплотнение.
    6. Навинтите на завинчивающееся кольцо камеры, чтобы идеально герметизировать систему.

5. Легкий лист и резонансное сканирование конфокального анализа

  1. Обрабатывайте световые листы и резонансные сканирующие сборы с помощью программного обеспечения, которое позволяет осуществлять 3D-визуализацию и анализ всего иммуноокрашенного образца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такое программное обеспечение позволяет быстро открывать огромные данные, чтобы легко делать снимки и анимацию. Это позволяет перемещать образец в разных ориентациях и генерировать 2D-виды благодаря инструменту 2D-слайсера в разных ориентациях, например, XY и YZ.
  2. Для автоматического обнаружения как центросом, так и первичных ресничек используйте точечный мастер, позволяющий количественно оценить их количество в патологических и контрольных состояниях.
  3. Для 3D-реконструкции ПК, позволяющей точно измерить их длину, используйте мастер нити накаливания, чтобы вручную зафиксировать начальную точку ПК, а программное обеспечение использует флуоресцентный сигнал для точной реконструкции ПК.

Результаты

2D hIPS клеточные модели для изучения первичного биогенеза и функции ресничек
Протокол, подробно описанный здесь, был адаптирован из ранее опубликованных исследований20,21,22. Этот протокол позволяет генерировать нейронные розе?...

Обсуждение

ПК в настоящее время рассматриваются как ключевые органеллы, регулирующие важнейшие этапы нормального развития коры головного мозга18,19,31, включая расширение и приверженность NSPC8,9,10,11,12, а также

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального агентства исследований (ANR) S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) и N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 и ANR-19-CE16-0002-01). LB поддерживается ANR в рамках программы Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) и Фондом Бетанкур Шуллер (программа MD-PhD). Институт Imagine поддерживается государственным финансированием ANR в рамках программы Investissements d'avenir (проекты ANR-10-IAHU-01, CrossLab) и в рамках второй программы Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

Ссылки

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181hIPSC2D 3D hIPSC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены