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摘要

我们提出了基于2D和3D人类诱导多能干细胞（hIPSC）的新皮质发育模型的生成和表征的详细方案，以及能够对原发性纤毛（PC）生物发生和功能进行定性和定量分析的补充方法。

摘要

原代纤毛（PC）是非运动动态微管基细胞器，从大多数哺乳动物细胞表面突出。它们在细胞周期的G1 / G0阶段从较旧的中心粒中出现，而当细胞在G2 / M相边界重新进入细胞周期时，它们会分解。它们通过检测和转导对许多细胞过程至关重要的细胞外信号来充当信号中枢。与大多数细胞类型类似，所有新皮质神经干和祖细胞（NSPCs）已被证明携带PC，允许它们感知和转导正常大脑皮质发育所需的特定信号。在这里，我们提供详细的方案来生成和表征来自人类诱导多能干细胞（hIPSC）的二维（2D）和三维（3D）细胞模型，以进一步剖析PC在新皮质发育过程中的参与。特别是，我们提出了研究2D神经玫瑰花衍生NSPC中的PC生物发生和功能的方案，包括声波刺猬（SHH）途径的转导。为了利用大脑类器官的三维（3D）组织，我们描述了一种简单的方法，用于 对免疫染色 的大脑类器官进行3D成像。光学清除后，快速采集整个类器官可以检测整个类器官的新皮质祖细胞和神经元上的中心体和PC。最后，我们详细介绍了免疫染色和清除厚厚的自由漂浮类器官切片的程序，保留了大量3D空间信息，并允许对PC生物发生和功能进行详细的定性和定量分析所需的高分辨率采集。

引言

原代纤毛（PC）是基于微管的细胞器，可感知和转导来自细胞外环境的大量化学和机械线索。特别是，PC是脊椎动物中刺猬信号通路转导的中心细胞器1，2。虽然大多数神经细胞早已被证明含有PC，但这种细胞器在塑造中枢神经系统方面的贡献长期以来一直被低估。对新皮质发育的研究导致发现了多个神经干和祖细胞（NSPCs），它们都含有PC，其位置被认为对祖细胞命运的确定至关重要3，4，5，6，7。PC已被证明对于正常大脑皮层发育所需的细胞机制至关重要，包括NSPC扩增和承诺8，9，10，11，12 以及支持神经元迁移的桡神经胶质支架的心基底极性13。此外，在神经元切向皮质板迁移期间需要PC14，15。最后，已经提出了PC在大脑皮层中建立神经元突触连接中的作用16，17。总而言之，这些发现证明了PC在大脑皮质发育的主要步骤中起着至关重要的作用18，19 ，并提出了调查它们参与大脑皮质发育异常的病理机制的必要性。

最近的研究在很大程度上提高了我们对人类和动物模型中皮质发育之间重要细胞和分子差异的理解，强调了开发人类模型系统的必要性。根据这种观点，人类诱导多能干细胞（hIPSCs）代表了在相关遗传和细胞背景下研究疾病发病机制的一种有前途的方法。贴壁二维（2D）基于细胞的模型或神经玫瑰花含有类似于发育中大脑皮层中看到的NSPC，其组织成玫瑰花形结构，显示出正确的耳基极性20，21，22。此外，三维（3D）培养系统允许产生背前脑类器官，这些类器官概括了人类大脑皮质发育的许多特征23，24，25，26。这两种互补的基于细胞的建模方法提供了令人兴奋的视角，以剖析PC在大脑皮层正常和病理发育过程中的参与。

在这里，我们为神经玫瑰花和衍生的NSPC以及背前脑类器官的生成和表征提供了详细的方案。我们还提供了详细的方案，通过测试声波刺猬途径的转导并分析该途径中涉及的关键分子的动力学，来分析NSPC上存在的PC的生物发生和功能。为了利用大脑类器官的3D组织，我们还建立了一种简单且具有成本效益的方法，用于 对免疫 染色的大脑类器官进行3D成像，通过光学片显微镜可以快速采集整个类器官，具有高分辨率，能够可视化所有类型的新皮质祖细胞和整个类器官神经元上的PC。最后，我们在150μm自由浮动切片上调整了免疫组织化学，随后使用共振扫描共聚焦显微镜进行清除和采集，从而实现高分辨率图像采集，这是详细分析PC生物发生和功能所必需的。具体而言，3D成像软件允许对PC进行3D重建，随后分析形态参数，包括PC的长度，数量和方向，以及沿轴线测量纤毛成分的信号强度。

研究方案

1. 基于2D hIPS细胞的新皮质发育模型的生成

  1. 神经玫瑰花纹形成
    1. 从含有大型规则菌落的 hIPSC 培养开始，表现出小于 10% 的分化和不超过 80% 的汇合度。
    2. 用 2 mL PBS 冲洗 hIPSC。
    3. 加入2mL补充岩石抑制剂的NSPC诱导培养基（NIM + 10μM的Y-27632）。
    4. 使用针头从一个35毫米培养皿中手动解剖每个hIPSC菌落，以在水平和垂直方向上精确地切割每个菌落，以创建棋盘图案，将每个菌落分成相等的簇。
    5. 使用细胞刮刀分离菌落，并将其转移到超低附着的35mm培养皿中。
    6. 让它们在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中漂浮过夜（ON），以便它们可以形成胚胎体（EB）。
      注:类胚胎体（EB）被定义为漂浮的球状簇或hIPSC的聚集体。
    7. 将EB转移到聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PO / lam）包覆的35mm培养皿中，放入2 mL NIM + 10μM的Y-27632中。
    8. 每日刷新NSPC诱导培养基（NIM无Y-27632），直到形成神经玫瑰花，大约需要12至14天。在显微镜下检查。
      注意:在此步骤之后，可以扩增，分化和处理神经花环以进行免疫染色分析或解离以获得分离的神经干和祖细胞（NSPCs）。
  2. 神经玫瑰花扩张和早期分化
    1. 用针将神经玫瑰花切成网格状图案，并使用细胞刮刀移开簇。
    2. 将玫瑰花转移到含有PO /lam涂层玻璃盖玻片（4-5朵/孔）的4孔板中，加入0.5 mL NSPC维持培养基（NMM）。
    3. 将板在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中孵育。
    4. 每隔一天刷新 NMM，直到第 20 天。
    5. 从第20天开始，在0.5mL细胞因子耗尽的NMM中培养神经玫瑰花以允许分化。每 2-3 天刷新一次培养基。
    6. 在第30天和第40天（分化10或20天），用0.5mL的4%PFA固定玫瑰花，20分钟，室温。
  3. 分离NSPC的PC生物发生和功能分析
    1. 国家自然人大解离
      1. 用针将步骤1.1.8中的神经玫瑰花以网格状图案切割，并使用细胞刮刀移开簇。将细胞转移到PO / lam包被的35mm培养皿中，在2mL NMM中，并在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中孵育。
      2. 每隔一天刷新一次 NMM，直到汇合（约 5-7 天）。
      3. 刮掉神经玫瑰花周围的大而透明的细胞后，手动采摘它们并将其转移到新鲜的PO / lam包被的35毫米培养皿中，以丰富NSPC并消耗非神经细胞类型。
      4. 在需要一次或两次手动传代（如果需要，请重复步骤1.3.1.3）以除去所有污染细胞类型后，取出培养基并用PBS冲洗。
      5. 加入300μL0.05%胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟，直到大多数细胞分离。
      6. 加入2mL含有10%FBS（DMEM + 10%FBS）的培养基以灭活胰蛋白酶。将细胞悬浮液收集在15 mL锥形管中。轻轻地上下移液细胞悬浮液三次，以分解细胞团块。
      7. 以300× g 离心5分钟。
      8. 小心地吸出上清液并将细胞重悬于NMN中。
      9. 将解离的NSPC作为单细胞（1×10 5 个细胞/ cm 2）接种在NMM中的PO / lam包被培养皿中，并在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中孵育。
      10. 通过每隔一天更换介质来扩展 NMM 中的 NSPCs。
        注:NSPC以高密度播种，以避免分化。
    2. PC 生物发生分析
      1. 以100，000个细胞/ cm 2 的种子解离NSPC，并在37°C和NMM中5%CO 2 的加湿培养箱中孵育2天。
      2. 吸出培养基，使NSPC在细胞因子耗尽的培养基（NSPC饥饿培养基， 补充表1）中饿死48小时。
      3. 在室温下修复PFA为4%的NSPC20分钟。
      4. 在免疫染色之前，用PBS在室温下洗涤两次5分钟。
    3. PC 功能分析:SHH 信号通路
      1. 在PO / lam包衣的8孔室载玻片（300μL）或T25 培养皿（5 mL）上以100，000个细胞/ cm 2的种子解离NSPC，并在37°C和5%CO 2 的NMM中在潮湿的培养箱中孵育2天。
      2. 在NSPC饥饿培养基（每孔8孔室载玻片300μL，T25烧瓶中5 mL）中饿死NSPC48小时。
      3. 为了诱导SHH途径，用补充有重组SHH（100ng / mL）或SAG（500nM）的饥饿培养基孵育NSPC;（每孔150μL的8孔室载玻片和2mL在T25培养瓶中）24小时。
      4. 将培养在8孔室载玻片上的NSPC固定在每孔250μL4%PFA中，在室温下20分钟，并在免疫染色分析之前用250μLPBS在室温下洗涤两次5分钟。
      5. 取出培养基并用PBS洗涤在T25培养皿中培养的NSPC。
      6. 加入500μL0.05%胰蛋白酶，并在37°C下孵育5分钟，直到细胞分离。
      7. 加入2mL含有10%FBS（DMEM + 10%FBS）的培养基以灭活胰蛋白酶并将细胞悬浮液收集在15mL锥形管中。
      8. 以300× g 离心5分钟，并小心地吸出上清液以获得NSPC沉淀，这些沉淀可以在RNA提取和RT-PCR分析之前在-80°C下冷冻保存。

2. 背前脑类器官的产生

  1. hIPSCs的单细胞培养
    1. 从hIPSC培养开始，这些培养物含有表现出小于10%分化的大常规菌落，并且几乎已经通过过一次。确保细胞汇合度不超过80%。
    2. 用2 mL PBS洗涤菌落。
    3. 加入500μL温和细胞解离试剂（GCDR），并在37°C下孵育5至7分钟。
    4. 吸出GCDR并加入2mL mTeRS1培养基，并补充5μM的Y-27632。
    5. 轻轻地上下移液细胞10次，将所有集落解离成单个细胞。
    6. 将细胞转移到玻连蛋白包被的培养皿上，并在37°C和5%CO 2的加湿培养箱中孵育。
      注意:在分化实验之前，使用GCDR对hIPSC进行至少1次传代，以使hIPSC适应单细胞培养条件。
  2. 在第0天，让hIPSC在含有低浓度FGF2和hIPSC存活所需的高浓度岩石抑制剂的EB培养基中形成胚胎体。为此，请按照以下步骤操作。
    1. 用2 mL PBS洗涤菌落。
    2. 加入500μL温和细胞解离试剂（GCDR），并在37°C下孵育5至7分钟。
    3. 吸出GCDR并加入1 mL EB培养基，并补充50μM的Y-27632;使用1 mL移液器轻轻分离细胞并将其转移到15 mL锥形管中。
    4. 用2mL补充有50μMY-27632的EB培养基再次冲洗，将剩余的细胞转移到15mL锥形管中。立即向锥形管中加入3mLEB培养基，并补充有50μM的Y-27632，并使用5 mL移液器轻轻匀浆溶液。
    5. 将解离的细胞以100× g 离心5分钟。
    6. 轻轻吸出上清液，将细胞重悬于6mL EB培养基中，并补充50μM的Y-27632。
    7. 将细胞以100× g 离心5分钟。
    8. 吸出上清液并将细胞重悬于1mL补充有50μMY-27632的EB培养基中。使用1 mL移液器将细胞轻轻解离成单细胞悬浮液。
    9. 重悬细胞后立即稀释并计数。
    10. 将适当体积的细胞悬浮液（含有900，000个细胞）稀释到30mL补充有50μMY-27632和4ng / mLbFGF的EB培养基中，并轻轻混合溶液。
    11. 将9，000个细胞/孔加入超低连接96U板（300μL/孔）中。为避免干扰EB的形成，将板在37°C和5%CO 2 的加湿培养箱中孵育至第3天，无需更换培养基。
  3. 神经诱导（双SMAD抑制）
    1. 在第3天，确保EB测量300-400μm并显示规则边界。如果达到两个标准，则用含有双SMAD抑制剂的诱导培养基-1替换一半的培养基（150μL），从而在第6天至第7天使EB的轮廓变亮，表明神经外胚层分化（补充表2）。
    2. 在第4天，用感应培养基-1替换3/4培养基（225μL）。
    3. 在第6天和第8天:刷新一半的诱导培养基-1（150μL）。
  4. 类器官包埋到基底膜基质中（第10天）
    1. 在第10天，将EB嵌入生长因子减少的基底膜基质（BMM）中。
      注意:从此步骤开始，始终使用无菌剪刀切开移液器吸头的开口，以避免重复移液损坏类器官。
    2. 首先在锥形管中转移约15-17个类器官。让EB沉降并除去培养基。加入50μL感应培养基-2，并将其转移到含有100μLBMM的微量离心管中。
    3. 将基质EB混合物铺展到超低连接板孔的中心，并分离EB以防止它们熔融。
    4. 让BMM在37°C的培养箱中凝固45分钟。
    5. 在每个孔中加入3mL的诱导培养基-2，并将板放入37°C和5%CO 2的加湿培养箱中。
      注意:确保在 BMM 在室温下凝固时尽快完成此过程。
  5. 嵌入基底膜基质的类器官的固定培养
    1. 第12、14天:刷新感应介质-2。
    2. 第16天:刷新诱导培养基-2，并在显微镜下检查神经上皮环的扩张。
  6. 底膜基质在轨道振动台上解离和培养
    1. 在第17天，通过用5 mL移液器上下移液10次，将其从BMM中解离，并将其转移到分化培养基-1（不含维生素A）中。在37°C和5%CO 2 的加湿培养箱中以80rpm孵育到轨道振荡器上，以改善营养吸收。
      注意:使用不同的培养箱进行固定培养并将培养到轨道振荡器上，以避免任何对贴壁hIPS细胞生长有害的振动。
    2. 第19天:刷新差异化中1。
    3. 第21天:将分化培养基-1改为分化培养基-2（含维生素A）。
    4. 从第23天到第35天:每2-3天用分化培养基-2刷新培养基。
    5. 从第35天到第70天:用1%BMM刷新差异化中2，每2-3天刷新一次。
    6. 在分化28，42和70 +/- 2天后收集类器官，并在4°C下将其固定在5 mL 4%PFA中15mL锥形管上过夜。
    7. 为了进一步 进行toto 或自由浮动的免疫染色分析，然后在PBS中冲洗两次类器官，并在PBS + 0.05%叠氮化钠中在4°C下保守。
    8. 对于冷冻切片的免疫染色分析，将4%PFA固定类器官浸入10 mL 30%蔗糖中，在+4°C ON下（或直到类器官下沉）。将它们嵌入冷冻包埋基质中，并储存在-80°C直至冷冻切片。

3 . 背前脑类器官的免疫标记、清除和光片采集

  1. 固定
    1. 将类器官收集在6孔板中，除去培养基，并在4°C下用2mL的4%PFA固定它们过夜。
    2. 在室温下用 2 mL PBS 进行三次洗涤。
    3. 将类器官转移到2 mL管中，并在4°C下储存在2mL PBS + 0.05%叠氮化钠中。
  2. 渗透
    1. 将类器官孵育在1 mL含有0.2%Triton X100的PBS中，室温1小时。请执行此操作两次。
    2. 在37°C下孵育1 mL含有0.2%Triton X100和20%DMSO的PBS过夜。
    3. 在1 mL含有0.1%吐温20，0.1%Triton X100，0.1%脱氧胆酸盐，0.1%NP40和20%DMSO的PBS中孵育，在37°C下过夜。
    4. 在1 mL含有0.2%Triton-X100的PBS中孵育，室温下孵育1小时。请执行此操作两次。
  3. 阻断和免疫标记
    1. 在37°C下阻断1mL封闭溶液（PBS，0.2%Triton X100，6%驴血清，10%DMSO）。
    2. 将一抗稀释在250μLPBS，0.2%吐温20，0.1μg/ mL肝素，5%DMSO和3%驴血清中，在37°C下孵育2天。
    3. 在1mL含有0.2%吐温20和0.1μg/ mL肝素的PBS中洗涤，在37°C下洗涤1小时。 这样做四次。
    4. 在1mL含有0.2%吐温20和0.1μg/ mL肝素的PBS中洗涤，在37°C下过夜。
    5. 将稀释在250μLPBS中，在37°C下孵育二抗，其中含有0.2%吐温20，0.1μg/ mL肝素和3%驴血清，持续2天。
    6. 在1毫升含有0.2%吐温20和0.1微克/毫升肝素的PBS中洗涤，在轮子上，在室温下洗涤1小时。这样做四次。
    7. 在1毫升含有0.2%吐温20和0.1微克/毫升肝素的PBS中洗涤过夜，在轮子上，在室温下。
    8. 在1 mL PBS中洗涤，在室温下洗涤24小时。
    9. 在+4°C下加入1 mL PBS和0.05%叠氮化钠，直至清除。
  4. 在TDE中清除（2，2′ -硫代二乙醇）
    1. 在室温下将类器官孵育在1 mL 30%TDE（3 mL TDE + 7 mL PBS）中24小时。
    2. 在1 mL 60%TDE（6 mL TDE + 4 mL PBS）中孵育24小时，室温。
    3. 在1 mL 80%TDE（8 mL TDE + 2 mL PBS）中孵育24小时，室温。
  5. 获得光片前的类器官包埋
    注意:使用定制系统;用1 mL注射器制成，尖端用手术刀切割。
    1. 在60%TDE溶液中制备100 mL 4%低熔点琼脂糖，并在2 mL管中等分试样。保存在 +4 °C。
    2. 在类器官包埋之前，在37°C的水浴中预热一管含有1.5mL 4%低熔点琼脂糖的60%TDE，直到其液化。
    3. 同时，准备一个由1 mL注射器制成的定制成型系统，其尖端使用手术刀切断。
    4. 使用柱塞泵入注射器中600μL凝胶溶液。
    5. 使用放大的移液器吸头定位样品，其开口已使用无菌剪刀切割。
    6. 用400μL凝胶溶液填充注射器，使样品位于注射器的下三分之一内。
    7. 让凝胶聚合并储存在80%TDE溶液中，在4°C下避光，直到获得。
    8. 对于光片采集，使用20倍物镜浸入样品室中加入的80%TDE溶液中，以便精确调整到清除方法的折射率。
    9. 将含有琼脂糖包埋的类器官的注射器插入最大的样品架中，该样品架设计用于容纳1 mL注射器，其柱塞可以操作以将类器官定位在物镜前方。
      注意:整个类器官的光片采集大约需要5到10分钟。

4. 免疫染色和清除背前脑类器官的自由漂浮部分

  1. 固定、琼脂糖包埋和切除类器官
    1. 在 6 孔板中分化 28、42 和 70 +/- 2 天后收集类器官，并在 4 °C 下固定过夜，加入 2 mL 4% PFA。
    2. 在2 mL PBS中冲洗两次，并在4°C下保存在2 mL PBS + 0.05%叠氮化钠中。
    3. 将固定的类器官嵌入塑料包埋模具（7 x 7 mm）中的4%低熔点琼脂糖中。小心地从塑料模具中取出琼脂糖块，并将其粘在振动阶段。
    4. 使用振动切片机对嵌入的类器官进行切片，以获得150μm自由浮动切片，该切片转移到含有500μLPBS的24孔板的孔中，以避免损坏切片。
      注意:建议使用低熔点琼脂糖，因为它的熔化温度仅为约60°C。 在PBS溶液中制备4%的低熔点琼脂糖，并在类器官包埋之前将其在水浴中冷却至37°C以上。
  2. 透化、阻断和免疫染色
    1. 将切片在含有0.3%Triton X100的500μLPBS中孵育，在室温下搅拌，20分钟。这样做三次。
    2. 将切片在含有0.3%Triton X100和5%脱脂牛奶的500μLPBS中孵育，在室温下搅拌下孵育2小时。
    3. 将切片孵育在250μL一抗溶液（PBS + 0.3%Triton X100 + 1%脱脂牛奶）中，搅拌，在+4°C下过夜。
    4. 在500μLPBS中洗涤切片，在室温下，在搅拌下，20分钟。这样做四次。
    5. 将切片孵育在250μL二抗溶液（PBS + 0.3%Triton X100 + 1%脱脂牛奶）中，在室温下搅拌，2小时。
    6. 在500μLPBS中洗涤切片，在室温下，在搅拌下，20分钟。这样做四次。
    7. 将切片储存在500μLPBS中，在+4°C下直至清除。
  3. 在TDE中清除（2，2′ -硫代二乙醇）
    1. 在室温下将切片在500μL的30%和60%TDE中孵育1小时，然后在室温下在500μL的80%TDE中过夜。
    2. 将清除的切片储存在500 μL的80%TDE中，直到在+4°C下获得。
  4. 采集前使用共聚焦共振扫描安装自由浮动部分
    1. 在密封室中安装自由浮动切片，使样品保持在80%TDE溶液中，并设计用于在共聚焦显微镜的电动XY载物台上进行调整。
    2. 将一个圆形盖玻片放入腔室系统中。
    3. 使用画笔小心地转移清除的免疫染色部分。
    4. 用80%TDE溶液填充腔室。
    5. 添加两个标准盖玻片，外加一个第二轮盖玻片和硅胶密封件。
    6. 拧紧腔室的拧紧环以完美密封系统。

5. 光片与共振扫描共聚焦分析

  1. 使用软件处理光片和共振扫描采集，实现整个免疫染色样品的3D可视化和分析。
    注意:此类软件允许快速打开大量数据，以便轻松制作快照和动画。它允许在不同方向上移动样品，并通过不同方向（例如XY和YZ）的2D切片器工具生成2D视图。
  2. 为了自动检测中心体和原发纤毛，请使用点向导来量化它们在病理与对照条件下的数量。
  3. 对于PC的3D重建，可以精确测量其长度，请使用灯丝向导手动固定PC的起点，软件使用荧光信号精确地重建PC。

结果

基于 2D hIPS 细胞的模型，用于研究原发性纤毛生物发生和功能
此处详述的方案改编自先前发表的研究20，21，22。该协议允许产生神经玫瑰花结构，其中包含类似于发育中的新皮层祖和神经元的新皮质祖和神经元。可以使用特定制造商进行常规免疫染色分析来执行详细验证3。例如，顶端祖细胞?...

讨论

PC现在被认为是调节正常大脑皮质发育过程中关键步骤的关键细胞器18，19，31 包括NSPC扩增和承诺8，9，10，11，12 以及神经元迁移13，14 和突触发生

披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

这项工作得到了国家研究机构（ANR）对S.T.（ANR-17-CE16-0003-01）和N.B.B（ANR-16-CE16-0011和ANR-19-CE16-0002-01）的赠款的支持。LB由ANR在Investissments d'avenir计划（ANR-10-IAHU-01）和Bettencourt Schueller基金会（MD-PhD计划）下提供支持。Imagine Institute由ANR根据Investissments d'avenir计划（ANR-10-IAHU-01，CrossLab项目）获得国家资助，并作为第二个Investissd'Avenir计划（ANR-17-RHUS-0002）的一部分。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

参考文献

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