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Résumé

Nous présentons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de modèles de développement néocortical basés sur des cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) 2D et 3D, ainsi que des méthodologies complémentaires permettant une analyse qualitative et quantitative de la biogenèse et de la fonction du cilium primaire (PC).

Résumé

Les cils primaires (PC) sont des organites dynamiques non mobiles à base de microtubules qui dépassent de la surface de la plupart des cellules de mammifères. Ils émergent du centriole plus ancien pendant la phase G1/G0 du cycle cellulaire, tandis qu’ils se désassemblent lorsque les cellules rentrent dans le cycle cellulaire à la limite de phase G2/M. Ils fonctionnent comme des hubs de signaux, en détectant et en transduisant des signaux extracellulaires cruciaux pour de nombreux processus cellulaires. Comme pour la plupart des types de cellules, il a été démontré que toutes les cellules souches et progénitrices neurales néocorticales (NSPC) hébergent un PC leur permettant de détecter et de transduire des signaux spécifiques nécessaires au développement cortical cérébral normal. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour générer et caractériser des modèles cellulaires bidimensionnels (2D) et tridimensionnels (3D) à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hIPSC) afin de disséquer davantage l’implication du PC au cours du développement néocortical. En particulier, nous présentons des protocoles pour étudier la biogenèse et la fonction du PC dans les NSPC dérivés de rosettes neurales 2D, y compris la transduction de la voie Sonic Hedgehog (SHH). Pour tirer parti de l’organisation tridimensionnelle (3D) des organoïdes cérébraux, nous décrivons une méthode simple d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés. Après nettoyage optique, l’acquisition rapide d’organoïdes entiers permet la détection des centrosomes et du PC sur les progéniteurs néocorticaux et les neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous détaillons la procédure d’immunocoloration et de nettoyage des sections organoïdes épaisses flottantes en préservant un degré significatif d’informations spatiales 3D et en permettant l’acquisition à haute résolution nécessaire à l’analyse qualitative et quantitative détaillée de la biogenèse et de la fonction des PC.

Introduction

Les cils primaires (PC) sont des organites à base de microtubules qui détectent et transduisent une pléthore de signaux chimiques et mécaniques de l’environnement extracellulaire. En particulier, le PC est l’organite central pour la transduction de la voie de signalisation du hérisson chez les vertébrés1,2. Alors que la plupart des cellules neurales ont longtemps été montrées abritant un PC, la contribution de cet organite dans la formation du système nerveux central a longtemps été sous-évaluée. Des études sur le développement néocortical ont conduit à la découverte de multiples cellules souches neurales et progénitrices (NSPC), toutes abritant un PC, dont l’emplacement a été proposé comme crucial pour la détermination du devenir du progéniteur3,4,5,6,7. La PC s’est avérée cruciale pour les mécanismes cellulaires nécessaires au développement cortical cérébral normal, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la polarité apicobasale de l’échafaudage glial radial soutenant la migration neuronale13. De plus, les PC sont nécessaires lors de la migration tangentielle des interneurones vers la plaque corticale14,15. Enfin, un rôle pour le PC a été proposé dans l’établissement des connexions synaptiques des neurones dans le cortex cérébral16,17. Dans l’ensemble, ces résultats plaident en faveur d’un rôle crucial de la PC aux étapes majeures du développement cortical cérébral18,19 et soulèvent la nécessité d’étudier leur implication dans les mécanismes pathologiques sous-jacents aux anomalies du développement cortical cérébral.

Des études récentes ont largement amélioré notre compréhension des différences cellulaires et moléculaires importantes entre le développement cortical dans les modèles humains et animaux, soulignant la nécessité de développer des systèmes modèles humains. De ce point de vue, les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSEh) représentent une approche prometteuse pour étudier la pathogenèse de la maladie dans un contexte génétique et cellulaire pertinent. Les modèles cellulaires bidimensionnels adhérents (2D) ou les rosettes neurales contiennent des NSPC similaires à ceux observés dans le cortex cérébral en développement, qui s’organisent en structures en forme de rosette montrant une polarité apicobasale correcte20,21,22. De plus, le système de culture tridimensionnelle (3D) permet la génération d’organoïdes dorsaux du cerveau antérieur qui récapitulent de nombreuses caractéristiques du développement cortical cérébral humain23,24,25,26. Ces deux approches complémentaires de modélisation cellulaire offrent des perspectives passionnantes pour disséquer l’implication du PC au cours du développement normal et pathologique du cortex cérébral.

Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour la génération et la caractérisation de rosettes neurales et de NSPC dérivés ainsi que d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal. Nous fournissons également des protocoles détaillés pour analyser la biogenèse et la fonction du PC présent sur les NSPC en testant la transduction de la voie Sonic Hedgehog et en analysant la dynamique des molécules cruciales impliquées dans cette voie. Pour tirer parti de l’organisation 3D des organoïdes cérébraux, nous avons également mis en place une méthode simple et économique d’imagerie 3D d’organoïdes cérébraux in toto immunocolorés permettant l’acquisition rapide, grâce à un microscope à feuille de lumière, de l’organoïde entier, avec une haute résolution permettant de visualiser pc sur tous les types de progéniteurs néocorticaux et de neurones de l’organoïde entier. Enfin, nous avons adapté l’immunohistochimie sur des sections flottantes de 150 μm avec un nettoyage et une acquisition ultérieurs à l’aide d’un microscope confocal à balayage résonant permettant l’acquisition d’images à haute résolution, ce qui est nécessaire pour l’analyse détaillée de la biogenèse et de la fonction du PC. Plus précisément, le logiciel d’imagerie 3D permet la reconstruction 3D du PC avec une analyse ultérieure des paramètres morphologiques, y compris la longueur, le nombre et l’orientation du PC, ainsi que la mesure de l’intensité du signal des composants ciliaires le long de l’axoneme.

Protocole

1. Génération de modèles cellulaires 2D hIPS de développement néocortical

  1. Formation de rosette neurale
    1. Commencez par les cultures hIPSC abritant de grandes colonies régulières, présentant moins de 10% de différenciation et pas plus de 80% de confluence.
    2. Rincez les hIPSC avec 2 mL de PBS.
    3. Ajouter 2 mL de milieu d’induction NSPC complété par l’inhibiteur de Rock (NIM + 10 μM de Y-27632).
    4. Disséquez manuellement chaque colonie hIPSC d’un plat de 35 mm à l’aide d’une aiguille pour couper chaque colonie avec précision dans les directions horizontale et verticale afin de créer un motif de damier divisant chaque colonie en grappes égales.
    5. Détachez la colonie à l’aide d’un grattoir à cellules et transférez-les sur un plat ultra-faible de 35 mm.
    6. Laissez-les flotter pendant la nuit (ON) dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2, afin qu’ils puissent former des corps embryoïdes (EB).
      REMARQUE: Les corps embryoïdes (EB) sont définis comme des amas de sphéroïdes flottants ou des agrégats de csegh.
    7. Transférer les EB dans des boîtes de 35 mm revêtues de poly-L-ornithine/laminine (PO/lam) dans des boîtes de 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
    8. Rafraîchissement quotidien du milieu d’induction NSPC (NIM sans Y-27632) jusqu’à la formation de rosettes neurales qui prend environ 12 à 14 jours. Vérifiez au microscope.
      REMARQUE: Après cette étape, les rosettes neurales peuvent être étendues, différenciées et traitées pour une analyse immunocolorante ou dissociées pour obtenir des cellules souches et progénitrices neurales isolées (NSPC).
  2. Expansion de la rosette neurale et différenciation précoce
    1. Coupez les rosettes neurales en forme de grille avec une aiguille et délogez les grappes à l’aide d’un grattoir cellulaire.
    2. Transférer les rosettes dans une plaque de 4 puits contenant un couvercle en verre revêtu de PO / lam (4-5 rosettes / puits) dans 0,5 mL de support de maintenance NSPC (NMM).
    3. Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
    4. Actualisez NMM tous les deux jours jusqu’au jour 20.
    5. À partir du jour 20, la culture de rosettes neurales dans 0,5 mL de cytokine a épuisé le NMM pour permettre la différenciation. Rafraîchissez le milieu tous les 2-3 jours.
    6. Au jour 30 et au jour 40 (10 ou 20 jours de différenciation), fixez les rosettes avec 0,5 mL de PFA à 4%, 20 min, RT.
  3. Biogenèse du PC et analyse fonctionnelle sur des CSNP isolés
    1. Dissociation des PNJ
      1. Coupez les rosettes neurales de l’étape 1.1.8 selon un motif en forme de grille avec une aiguille et délogez les grappes à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférer les cellules dans des plats de 35 mm revêtus de PO/lam dans 2 mL de NMM et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      2. Actualisez NMM tous les deux jours jusqu’à la confluence (environ 5 à 7 jours).
      3. Après avoir gratté les grandes cellules claires entourant les rosettes neurales, cueillez-les manuellement et transférez-les sur des plats frais de 35 mm enduits de PO / lam pour enrichir les NSPC et épuiser les types de cellules non neurales.
      4. Après un ou deux passages manuels (répétez l’étape 1.3.1.3 si nécessaire) nécessaires pour enlever tous les types de cellules contaminantes, retirer le milieu et rincer avec du PBS.
      5. Ajouter 300 μL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que la plupart des cellules se détachent.
      6. Ajouter 2 mL du milieu contenant 10% de FBS (DMEM + 10% DE FBS) pour inactiver la trypsine. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL. Pipettez doucement la suspension cellulaire de haut en bas trois fois pour briser les amas de cellules.
      7. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min.
      8. Aspirer soigneusement le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le NMN.
      9. Ensemencez les NSPC dissociés sous forme de cellules simples (1 x 105 cellules/cm2) dans du NMM sur des plats enduits de PO/lam et incubez-les dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      10. Développez les NSPC dans NMM en changeant de support tous les deux jours.
        REMARQUE: Les NSPC sont ensemencés à haute densité pour éviter la différenciation.
    2. Analyse de la biogenèse PC
      1. Les semences dissocient les NSPC à 100 000 cellules/cm2 et les incubent dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 dans le NMM pendant 2 jours.
      2. Aspirer le milieu et affamer les NSPC dans un milieu appauvri en cytokines (milieu de famine NSPC, tableau supplémentaire 1) pendant 48 h.
      3. Fixez les NSPC avec 4% de PFA pendant 20 minutes à RT.
      4. Laver deux fois avec du PBS pendant 5 min à TA avant l’immunocoloration.
    3. Analyse de la fonction PC: voie de signalisation SHH
      1. Les semences ont dissocié les NSPC à 100 000 cellules/cm2 sur des lames de chambre à 8 puits revêtues de PO/lam (300 μL) ou des plats T25 (5 mL) et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 dans le NMM pendant 2 jours.
      2. Affamer les NSPC dans un milieu de famine NSPC (300 μL par puits de glissière de chambre à 8 puits et 5 mL dans une fiole de T25) pendant 48 h.
      3. Pour induire la voie SHH, incuber les NSPC avec le milieu de famine complété par du SHH recombinant (100 ng / mL) ou SAG (500 nM); (150 μL par puits d’une lame de chambre de 8 puits et 2 mL en fiole T25) pendant 24 h.
      4. Fixer les NSPC cultivés sur des lames de chambre à 8 puits dans 250 μL de PFA à 4 % par puits pendant 20 min à TA et les laver deux fois avec 250 μL de PBS pendant 5 min à RT avant l’analyse immunocolorante.
      5. Retirez le milieu et lavez les NSPC cultivés dans des plats T25 avec du PBS.
      6. Ajouter 500 μL de trypsine à 0,05 % et incuber pendant 5 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se détachent.
      7. Ajouter 2 mL de milieu contenant 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) pour inactiver la trypsine et recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL.
      8. Centrifugez à 300 x g pendant 5 min et aspirez soigneusement le surnageant pour obtenir des pastilles NSPC qui peuvent être cryoconservées à -80 °C avant l’extraction de l’ARN et l’analyse RT-PCR.

2. Génération d’organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Culture unicellulaire de csisptiques
    1. Commencez par les cultures hIPSC abritant de grandes colonies régulières présentant moins de 10% de différenciation et qui ont été adoptées presque une fois. Assurez-vous que les cellules ne sont pas confluentes à plus de 80%.
    2. Laver les colonies avec 2 mL de PBS.
    3. Ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber pendant 5 à 7 min à 37 °C.
    4. Aspirer le GCDR et ajouter 2 mL de milieu mTeRS1 complété par 5 μM de Y-27632.
    5. Pipettez doucement les cellules de haut en bas 10 fois pour dissocier toutes les colonies en cellules uniques.
    6. Transférer les cellules sur des plats enduits de vitronectine et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2.
      REMARQUE: Effectuer au moins 1 passage des hSIC à l’aide de GCDR avant l’expérience de différenciation pour adapter les hIPSC aux conditions de culture unicellulaire.
  2. Au jour 0, permettre aux cSEh de former des corps embryonnaires dans un milieu EB contenant une faible concentration de FGF2 et une concentration élevée d’inhibiteur de roche nécessaire à la survie du hIPSC. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Laver les colonies avec 2 mL de PBS.
    2. Ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire douce (GCDR) et incuber pendant 5 à 7 min à 37 °C.
    3. Aspirer le GCDR et ajouter 1 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632; Utilisez une pipette de 1 mL pour détacher doucement les cellules et les transférer dans un tube conique de 15 mL.
    4. Rincer à nouveau avec 2 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632, transférer les cellules restantes dans le tube conique de 15 mL. Ajouter immédiatement 3 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632 au tube conique et homogénéiser doucement la solution à l’aide d’une pipette de 5 mL.
    5. Centrifuger les cellules dissociées à 100 x g pendant 5 min.
    6. Aspirer doucement le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 6 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632.
    7. Centrifuger les cellules à 100 x g pendant 5 min.
    8. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632. Utilisez une pipette de 1 mL pour dissocier doucement les cellules en une suspension à cellule unique.
    9. Immédiatement après avoir réutilisé les cellules, diluez-les et comptez-les.
    10. Diluer le volume approprié de la suspension cellulaire (contenant 900 000 cellules) dans 30 mL de milieu EB complété par 50 μM de Y-27632 et 4 ng/mL de bFGF et mélanger doucement la solution.
    11. Plaque 9 000 cellules/puits dans une plaque 96U à fixation ultra-basse (300 μL/puits). Pour éviter de perturber la formation d’EB, incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5% de CO2 jusqu’au jour 3 sans changement de milieu.
  3. Induction neuronale (inhibition SMAD double)
    1. Le jour 3, assurez-vous que les EB mesurent entre 300 et 400 μm et affichent des bordures régulières. Si les deux critères sont atteints, remplacer la moitié du milieu (150 μL) par un milieu d’induction-1 contenant des inhibiteurs de Dual SMAD, ce qui entraîne un éclaircissement du contour des EB du jour 6 au jour 7 indiquant une différenciation neuroectodermique (tableau supplémentaire 2).
    2. Le jour 4, remplacer les 3/4 du milieu (225 μL) par un milieu d’induction-1.
    3. Jour 6 et Jour 8 : Rafraîchissez la moitié du milieu d’induction-1 (150 μL).
  4. Intégration d’organoïdes dans la matrice de la membrane basale (Jour 10)
    1. Le jour 10, intégrez les EB dans la matrice de membrane basale (BMM) à facteur de croissance réduit.
      REMARQUE: À partir de cette étape, utilisez toujours des ciseaux stériles pour couper l’ouverture des embouts de la pipette afin d’éviter d’endommager les organoïdes par pipetage répété.
    2. Premier transfert d’environ 15-17 organoïdes dans des tubes coniques. Laissez les EB se déposer et retirez le milieu. Ajouter 50 μL de milieu d’induction-2 et les transférer dans un tube de microcentrifugation contenant 100 μL de BMM.
    3. Étalez le mélange matrice-EB sur le centre d’un puits d’une plaque à fixation ultra-basse et séparez les EB pour éviter qu’ils ne fusionnent.
    4. Laisser le BMM se solidifier dans l’incubateur à 37 °C pendant 45 min.
    5. Ajouter 3 mL du milieu d’induction-2 dans chaque puits et placer la plaque dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2.
      REMARQUE: Assurez-vous que cette procédure est effectuée le plus rapidement possible car BMM se solidifie à température ambiante.
  5. Culture stationnaire d’organoïdes incorporés dans la matrice de la membrane basale
    1. Jour 12, 14: Rafraîchir le milieu d’induction-2.
    2. Jour 16: Rafraîchir le milieu d’induction 2 et vérifier au microscope l’expansion des boucles neuroépithéliales.
  6. Dissociation et culture de la matrice de membrane basale sur un agitateur orbital
    1. Le jour 17, dissociez les organoïdes du BMM en pipetant de haut en bas 10 fois avec une pipette de 5 mL et transférez-les dans un milieu de différenciation-1 (sans vitamine A). Incuber sur un agitateur orbital à 80 tr/min dans un incubateur humidifié à 37 °C et 5 % de CO2 pour améliorer l’absorption nutritionnelle.
      REMARQUE: Utilisez un incubateur différent pour la culture stationnaire et la culture sur un agitateur orbital pour éviter toute vibration préjudiciable à la croissance des cellules hIPS adhérentes.
    2. Jour 19: Actualiser la différenciation moyen-1.
    3. Jour 21: Changer le milieu de différenciation-1 en milieu de différenciation-2 (avec la vitamine A).
    4. Du jour 23 au jour 35: Rafraîchissez le milieu avec la différenciation moyen-2 tous les 2-3 jours.
    5. Du jour 35 au jour 70: Actualisez la différenciation moyen-2 avec 1% de BMM et rafraîchissez tous les 2-3 jours.
    6. Recueillir les organoïdes après 28, 42 et 70 +/- 2 jours de différenciation et les fixer pendant la nuit à 4 °C, dans 5 mL 4 % de PFA sur un tube conique de 15 mL.
    7. Pour une analyse immunologique ultérieure in toto ou flottante, les organoïdes sont ensuite rincés deux fois dans du PBS et conservés à 4 °C dans du PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
    8. Pour l’analyse immunocolorante sur des sections congelées, immerger 4 % d’organoïdes fixes PFA dans 10 mL 30 % de saccharose à +4 °C ON (ou jusqu’à ce que les organoïdes coulent). Intégrez-les dans une matrice d’intégration congelée et stockez-les à -80 °C jusqu’à la cryosection.

3. Immunomarquage in toto , nettoyage et acquisition par feuille de lumière des organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Fixation
    1. Recueillir les organoïdes dans des plaques à 6 puits, retirer le milieu et les fixer avec 2 mL de PFA à 4 %, à 4 °C, pendant la nuit.
    2. Effectuer trois lavages dans 2 mL de PBS à température ambiante.
    3. Transférer les organoïdes dans des tubes de 2 mL et conserver à 4 °C dans 2 mL de PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
  2. Perméabilisation
    1. Incuber des organoïdes dans 1 mL de PBS contenant 0,2% de Triton X100 à RT pendant 1 h. Faites-le deux fois.
    2. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Triton X100 et 20 % de DMSO, à 37 °C, pendant la nuit.
    3. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,1 % de Tween20, 0,1 % de Triton X100, 0,1 % de désoxycholate, 0,1 % de NP40 et 20 % de DMSO, à 37 °C, pendant la nuit.
    4. Incuber dans 1 mL de PBS contenant 0,2% de Triton-X100, à RT, pendant 1 h. Faites-le deux fois.
  3. Blocage et immunoétiquetage
    1. Bloquer dans 1 mL de solution bloquante (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Sérum d’âne, 10% DMSO), à 37 °C, ON.
    2. Incuber avec des anticorps primaires dilués dans 250 μL de PBS, 0,2 % de Tween20, 0,1 μg/mL d’héparine, 5 % de DMSO et 3 % de sérum d’âne, à 37 °C, pendant 2 jours.
    3. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant 1 h, à 37 °C. Faites-le quatre fois.
    4. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant la nuit, à 37 °C.
    5. Incuber avec des anticorps secondaires dilués dans 250 μL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20, 0,1 μg/mL d’héparine et 3 % de sérum d’âne, à 37 °C, pendant 2 jours.
    6. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant 1 h, sur une roue, à RT. Faites-le quatre fois.
    7. Laver dans 1 mL de PBS contenant 0,2 % de Tween 20 et 0,1 μg/mL d’héparine, pendant la nuit, sur une roue, à TA.
    8. Laver dans 1 mL de PBS, pendant 24 h, à RT.
    9. Stocker à +4 °C dans 1 mL de PBS et 0,05 % d’azoture de sodium jusqu’à élimination.
  4. Clairière en TDE (2,2′ -Thiodiéthanol)
    1. Incuber les organoïdes dans 1 mL de TDE à 30% (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
    2. Incuber dans 1 mL de TDE à 60% (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
    3. Incuber dans 1 mL de 80% de TDE (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), pendant 24 h, à RT.
  5. Intégration d’organoïdes avant l’acquisition de feuilles lumineuses
    REMARQUE: Utilisez un système sur mesure; fabriqué avec une seringue de 1 mL avec la pointe coupée avec un scalpel.
    1. Préparer 100 mL d’agarose à faible fusion à 4 % dans une solution de TDE à 60 % et aliquote dans des tubes de 2 mL. Conserver à +4 °C.
    2. Avant l’incorporation organoïde, préchauffer un tube contenant 1,5 mL d’agarose à faible fusion à 4 % dans 60 % de TDE au bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il se liquéfie.
    3. Pendant ce temps, préparez un système de moulage sur mesure fabriqué à partir d’une seringue de 1 mL dont l’extrémité est coupée à l’aide d’un scalpel.
    4. Pompez dans la seringue 600 μL de la solution de gel à l’aide du piston.
    5. Positionnez l’échantillon à l’aide d’une pointe de pipette agrandie dont l’ouverture a été coupée à l’aide de ciseaux stériles.
    6. Remplissez la seringue avec 400 μL de solution de gel afin que l’échantillon soit positionné dans le tiers inférieur de la seringue.
    7. Laisser le gel polymériser et conserver dans une solution de TDE à 80 % à 4 °C à l’abri de la lumière jusqu’à l’acquisition.
    8. Pour l’acquisition de feuilles de lumière, utilisez un objectif 20x immergé dans une solution de TDE à 80% ajoutée dans la chambre d’échantillonnage pour permettre un ajustement précis à l’indice de réfraction de la méthode de nettoyage.
    9. Insérez la seringue contenant l’organoïde incorporé à l’agarose dans le plus grand porte-échantillon conçu pour accueillir une seringue de 1 mL dont le piston peut être actionné pour positionner l’organoïde devant l’objectif.
      REMARQUE: L’acquisition d’une feuille de lumière d’un organoïde entier prend environ 5 à 10 minutes.

4. Immunocoloration et élimination des sections flottantes des organoïdes du cerveau antérieur dorsal

  1. Fixation, incorporation d’agarose et sectionnement des organoïdes
    1. Recueillir les organoïdes après 28, 42 et 70 +/- 2 jours de différenciation dans une plaque à 6 puits et fixer pendant la nuit à 4 °C dans 2 mL de PFA à 4 %.
    2. Rincer deux fois dans 2 mL de PBS et conserver à 4 °C dans 2 mL de PBS + 0,05 % d’azoture de sodium.
    3. Incorporer les organoïdes fixes dans 4% d’agarose à faible fusion dans un moule d’encastrement en plastique (7 x 7 mm). Retirez soigneusement le bloc d’agarose du moule en plastique et collez-le à l’étage vibratome.
    4. Couper les organoïdes incorporés à l’aide d’un vibratome pour obtenir des sections flottantes de 150 μm transférées dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 500 μL de PBS à l’aide d’un pinceau pour éviter d’endommager les sections.
      REMARQUE: L’agarose à faible fusion est recommandée car sa température de fusion n’est que d’environ 60 ° C. Préparer l’agarose à faible teneur en fusion à 4 % dans une solution de PBS et laisser refroidir juste au-dessus de 37 °C au bain-marie avant l’incorporation d’organoïdes.
  2. Perméabilisation, blocage et immunocoloration
    1. Incuber les sections dans 500 μL de PBS contenant 0,3% de Triton X100, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le trois fois.
    2. Incuber les sections dans 500 μL de PBS contenant 0,3% de Triton X100 et 5% de lait écrémé, à TA, sous agitation, pendant 2 h.
    3. Incuber les sections dans 250 μL de solution d’anticorps primaires (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de lait non gras), sous agitation, à +4 °C, pendant la nuit.
    4. Laver les sections dans 500 μL de PBS, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le quatre fois.
    5. Incuber les sections dans 250 μL de solution d’anticorps secondaires (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de lait écrémé), à TA, sous agitation, pendant 2 h.
    6. Laver les sections dans 500 μL de PBS, à RT, sous agitation, pendant 20 min. Faites-le quatre fois.
    7. Stocker les sections dans 500 μL de PBS, à +4° C jusqu’à ce qu’elles soient dégagées.
  3. Clairière en TDE (2,2′ -Thiodiéthanol)
    1. Incuber les sections dans 500 μL de 30% et 60% de TDE pendant 1 h chacune à RT, puis dans 500 μL de 80% TDE pendant la nuit, à RT.
    2. Conserver les sections nettoyées dans 500 μL de TDE à 80 % jusqu’à l’acquisition à +4 °C.
  4. Montage de sections flottantes avant l’acquisition avec un balayage confocal résonant
    1. Montez une section flottante dans une chambre scellée permettant de maintenir l’échantillon en solution TDE à 80% et conçue pour s’adapter sur un étage XY motorisé de microscopes confocaux.
    2. Mettez un couvercle rond dans le système de chambre.
    3. Transférez soigneusement la section immunocolorée nettoyée à l’aide d’un pinceau.
    4. Remplissez la chambre avec une solution de TDE à 80%.
    5. Ajoutez deux couvercles standard plus un deuxième couvercle rond et un joint en silicone.
    6. Vissez l’anneau de vissage de la chambre pour sceller parfaitement le système.

5. Feuille de lumière et analyse confocale à balayage résonant

  1. Traitez les acquisitions de feuilles lumineuses et de balayage résonant à l’aide d’un logiciel qui permet la visualisation et l’analyse 3D de l’ensemble de l’échantillon immunocoloré.
    REMARQUE: Un tel logiciel permet d’ouvrir rapidement d’énormes données pour créer facilement des instantanés et des animations. Il permet de déplacer l’échantillon dans différentes orientations et de générer des vues 2D grâce à un outil de slicer 2D dans différentes orientations, XY et YZ par exemple.
  2. Pour la détection automatique des centrosomes et des cils primaires, utilisez un assistant ponctuel permettant de quantifier leur nombre dans des conditions pathologiques ou de contrôle.
  3. Pour la reconstruction 3D du PC permettant une mesure précise de leur longueur, utilisez un assistant de filament pour fixer manuellement le point de départ du PC et le logiciel utilise le signal de fluorescence pour reconstruire le PC avec précision.

Résultats

Modèles cellulaires hIPS 2D pour étudier la biogenèse et la fonction du cilium primaire
Le protocole détaillé ici a été adapté d’études publiées précédemment20,21,22. Ce protocole permet la génération de structures de rosettes neurales qui contiennent des progéniteurs néocorticaux et des neurones similaires à ceux observés dans le néocortex en développement. Une validation détaillée pe...

Discussion

Les PC sont maintenant considérés comme des organites clés régulant les étapes cruciales du développement cortical cérébral normal18,19,31, y compris l’expansion et l’engagement des NSPC8,9,10,11,12 ainsi que la migration neuronale13,14

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de l’Agence Nationale de la Recherche (ANR) à S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) et N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 et ANR-19-CE16-0002-01). LB est soutenu par l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01) et la Fondation Bettencourt Schueller (programme MD-PhD). L’Institut Imagine est soutenu par un financement public de l’ANR dans le cadre du programme Investissements d’avenir (ANR-10-IAHU-01, projets CrossLab) et dans le cadre du deuxième programme Investissements d’Avenir (ANR-17-RHUS-0002).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

Références

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