Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von 2D- und 3D-Modellen für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSC) der neokortikalen Entwicklung sowie ergänzende Methoden, die eine qualitative und quantitative Analyse der primären Cilium (PC) -Biogenese und -Funktion ermöglichen.

Zusammenfassung

Primäre Zilien (PC) sind nicht bewegliche dynamische Organellen auf Mikrotubulibasis, die aus der Oberfläche der meisten Säugetierzellen herausragen. Sie treten während der G1/G0-Phase des Zellzyklus aus dem älteren Zentriole aus, während sie sich zerlegen, wenn die Zellen an der G2/M-Phasengrenze wieder in den Zellzyklus eintreten. Sie fungieren als Signalknotenpunkte, indem sie extrazelluläre Signale erkennen und transduzieren, die für viele Zellprozesse entscheidend sind. Ähnlich wie bei den meisten Zelltypen wurde gezeigt, dass alle neokortikalen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) einen PC beherbergen, der es ihnen ermöglicht, spezifische Signale zu erfassen und zu übertragen, die für die normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind. Hier stellen wir detaillierte Protokolle zur Verfügung, um zweidimensionale (2D) und dreidimensionale (3D) zellbasierte Modelle aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hIPSCs) zu generieren und zu charakterisieren, um die Beteiligung von PC während der neokortikalen Entwicklung weiter zu analysieren. Insbesondere stellen wir Protokolle vor, um die PC-Biogenese und -Funktion in 2D-neuronalen Rosetten-abgeleiteten NSPCs zu untersuchen, einschließlich der Transduktion des Sonic Hedgehog (SHH) -Signalwegs. Um die dreidimensionale (3D) Organisation von zerebralen Organoiden zu nutzen, beschreiben wir eine einfache Methode zur 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden. Nach dem optischen Clearing ermöglicht die schnelle Erfassung ganzer Organoide den Nachweis von Zentrosomen und PC auf neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids. Schließlich beschreiben wir das Verfahren zur Immunfärbung und Klärung dicker frei schwebender Organoidabschnitte, die ein erhebliches Maß an räumlicher 3D-Information erhalten und die hochauflösende Erfassung ermöglichen, die für die detaillierte qualitative und quantitative Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist.

Einleitung

Primäre Zilien (PC) sind auf Mikrotubuli basierende Organellen, die eine Fülle von chemischen und mechanischen Hinweisen aus der extrazellulären Umgebung wahrnehmen und übertragen. Insbesondere ist PC die zentrale Organelle für die Transduktion des Hedgehog-Signalwegs bei Wirbeltieren1,2. Während die meisten Nervenzellen seit langem gezeigt wurden, dass sie einen PC beherbergen, wurde der Beitrag dieser Organelle bei der Gestaltung des zentralen Nervensystems lange Zeit unterschätzt. Studien zur neokortikalen Entwicklung haben zur Entdeckung mehrerer neuraler Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) geführt, die alle einen PC beherbergen, dessen Standort als entscheidend für die Bestimmung des Schicksals des Vorläufers angesehen wurde3,4,5,6,7. PC hat sich als entscheidend für Zellmechanismen erwiesen, die für eine normale zerebrale kortikale Entwicklung erforderlich sind, einschließlich NSPC-Expansion und -Engagement8,9,10,11,12 sowie apikobasaler Polarität des radialen Gliagerüsts zur Unterstützung der neuronalen Migration13. Darüber hinaus werden PC während der tangentialen Wanderung von Interneuronen zur kortikalen Platte benötigt14,15. Schließlich wurde eine Rolle für den PC bei der Herstellung synaptischer Verbindungen von Neuronen in der Großhirnrinde vorgeschlagen16,17. Insgesamt sprechen diese Ergebnisse für eine entscheidende Rolle von PC bei wichtigen Schritten der zerebralen kortikalen Entwicklung18,19 und erhöhen die Notwendigkeit, ihre Beteiligung an den pathologischen Mechanismen zu untersuchen, die Anomalien der zerebralen kortikalen Entwicklung zugrunde liegen.

Jüngste Studien haben unser Verständnis wichtiger zellulärer und molekularer Unterschiede zwischen kortikaler Entwicklung in menschlichen und tierischen Modellen erheblich verbessert und die Notwendigkeit der Entwicklung menschlicher Modellsysteme betont. Aus dieser Sicht stellen humane induzierte pluripotente Stammzellen (hIPSCs) einen vielversprechenden Ansatz dar, um die Krankheitspathogenese in einem relevanten genetischen und zellulären Kontext zu untersuchen. Adhärente zweidimensionale (2D) zellbasierte Modelle oder neuronale Rosetten enthalten NSPCs, die denen in der sich entwickelnden Großhirnrinde ähneln, die sich in rosettenförmigen Strukturen organisieren, die eine korrekte apikobasale Polarität aufweisen20,21,22. Darüber hinaus ermöglicht das dreidimensionale (3D) Kultursystem die Erzeugung dorsaler Organoide des Vorderhirns, die viele Merkmale der menschlichen zerebralen kortikalen Entwicklung rekapitulieren23,24,25,26. Diese beiden komplementären zellbasierten Modellierungsansätze bieten spannende Perspektiven, um die Beteiligung von PC während der normalen und pathologischen Entwicklung der Großhirnrinde zu analysieren.

Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Erzeugung und Charakterisierung von neuronalen Rosetten und abgeleiteten NSPCs sowie dorsalen Vorderhirn-Organoiden zur Verfügung. Wir bieten auch detaillierte Protokolle zur Analyse der Biogenese und Funktion von PCs auf NSPCs, indem wir die Transduktion des Sonic Hedgehog-Signalwegs testen und die Dynamik entscheidender Moleküle analysieren, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Um die Vorteile der 3D-Organisation der zerebralen Organoide zu nutzen, haben wir auch eine einfache und kostengünstige Methode für die 3D-Bildgebung von in toto immungefärbten zerebralen Organoiden eingerichtet, die dank eines Lichtblattmikroskops eine schnelle Erfassung des gesamten Organoids mit hoher Auflösung ermöglicht, die es ermöglicht, PC auf allen Arten von neokortikalen Vorläufern und Neuronen des gesamten Organoids zu visualisieren. Schließlich passten wir die Immunhistochemie auf 150 μm frei schwebenden Schnitten mit anschließender Klärung und Erfassung mit resonanten Scanning-Konfokalmikroskopen an, die eine hochauflösende Bildaufnahme ermöglichten, die für die detaillierte Analyse der PC-Biogenese und -Funktion erforderlich ist. Insbesondere ermöglicht die 3D-Bildgebungssoftware die 3D-Rekonstruktion des PCs mit anschließender Analyse morphologischer Parameter einschließlich Länge, Anzahl und Ausrichtung des PCs sowie die Messung der Signalintensität von Ziliarkomponenten entlang des Axonems.

Protokoll

1. Generierung von 2D hIPS zellbasierten Modellen der neokortikalen Entwicklung

  1. Neuronale Rosettenbildung
    1. Beginnen Sie mit hIPSC-Kulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, weniger als 10% Differenzierung und nicht mehr als 80% Konfluenz aufweisen.
    2. Spülen Sie die hIPSCs mit 2 ml PBS ab.
    3. Fügen Sie 2 ml NSPC-Induktionsmedium hinzu, das mit dem Rock-Inhibitor (NIM + 10 μM Y-27632) ergänzt wird.
    4. Sezieren Sie jede hIPSC-Kolonie manuell von einer 35-mm-Schüssel mit einer Nadel, um jede Kolonie präzise in horizontaler und vertikaler Richtung zu schneiden, um ein Schachbrettmuster zu erzeugen, das jede Kolonie in gleiche Cluster unterteilt.
    5. Lösen Sie die Kolonie mit einem Zellschaber und übertragen Sie sie auf eine 35-mm-Schüssel mit extrem niedrigem Aufsatz.
    6. Lassen Sie sie über Nacht (ON) in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 schweben, damit sie embryoide Körper (EBs) bilden können.
      HINWEIS: Embryoide Körper (EBs) sind definiert als schwimmende Sphäroidcluster oder Aggregate von hIPSCs.
    7. Übertragen Sie die EBs in Poly-L-Ornithin/Laminin (PO/lam)-beschichtete 35 mm Schalen in 2 ml NIM + 10 μM Y-27632.
    8. Tägliche Aktualisierung des NSPC-Induktionsmediums (NIM ohne Y-27632) bis zur Bildung von neuronalen Rosetten, die etwa 12 bis 14 Tage dauert. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop.
      HINWEIS: Nach diesem Schritt können neuronale Rosetten erweitert, differenziert und für die Immunfärbungsanalyse verarbeitet oder dissoziiert werden, um isolierte neurale Stamm- und Vorläuferzellen (NSPCs) zu erhalten.
  2. Neuronale Rosettenerweiterung und frühe Differenzierung
    1. Schneiden Sie neuronale Rosetten in einem gitterartigen Muster mit einer Nadel und entfernen Sie die Cluster mit einem Zellschaber.
    2. Übertragen Sie die Rosetten in eine 4-Well-Platte mit PO / lam-beschichtetem Glasdeckglas (4-5 Rosetten / Well) in 0,5 ml NSPC-Wartungsmedium (NMM).
    3. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
    4. Aktualisieren Sie NMM jeden zweiten Tag bis zum 20. Tag.
    5. Ab Tag 20 kultivierten neuronale Rosetten in 0,5 ml Zytokin erschöpftes NMM, um eine Differenzierung zu ermöglichen. Aktualisieren Sie das Medium alle 2-3 Tage.
    6. An Tag 30 und Tag 40 (10 oder 20 Tage der Differenzierung) fixieren Sie die Rosetten mit 0,5 ml 4% PFA, 20 min, RT.
  3. PC-Biogenese und Funktionsanalyse an isolierten NSPCs
    1. NSPC-Dissoziation
      1. Schneiden Sie neuronale Rosetten aus Schritt 1.1.8 in einem gitterartigen Muster mit einer Nadel und entfernen Sie die Cluster mit einem Zellschaber. Die Zellen in PO/lam-beschichtete 35 mm Schalen in 2 mL NMM überführen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
      2. Aktualisieren Sie NMM jeden zweiten Tag bis zur Konfluenz (ca. 5-7 Tage).
      3. Nachdem Sie die großen, klaren Zellen, die neuronale Rosetten umgeben, abgekratzt haben, pflücken Sie sie manuell und übertragen Sie sie auf frische PO / lam-beschichtete 35-mm-Schalen, um sich für NSPCs anzureichern und nicht-neurale Zelltypen zu erschöpfen.
      4. Nach ein oder zwei manuellen Passagen (bei Bedarf Schritt 1.3.1.3 wiederholen), die erforderlich sind, um alle kontaminierenden Zelltypen zu entfernen, entfernen Sie das Medium und spülen Sie es mit PBS ab.
      5. 300 μL 0,05% Trypsin zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die meisten Zellen lösen.
      6. Fügen Sie 2 ml des Mediums hinzu, das 10% FBS (DMEM + 10% FBS) enthält, um das Trypsin zu inaktivieren. Sammeln Sie die Zellsuspension in einem konischen 15-ml-Röhrchen. Pipettieren Sie die Zellsuspension vorsichtig dreimal nach oben und unten, um die Zellklumpen aufzubrechen.
      7. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min.
      8. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspen sie die Zellen in NMN.
      9. Die dissoziierten NSPCs als Einzelzellen (1 x 105 Zellen/cm2) in NMM auf PO/lam-beschichtete Schalen aussäen und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 inkubieren.
      10. Erweitern Sie NSPCs in NMM, indem Sie das Medium jeden zweiten Tag wechseln.
        HINWEIS: NSPCs werden mit hoher Dichte ausgesät, um eine Differenzierung zu vermeiden.
    2. PC-Biogenese-Analyse
      1. Saatgut dissoziierte NSPCs bei 100.000 Zellen/cm2 und inkubierte sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in NMM für 2 Tage.
      2. Aspirieren Sie das Medium und verhungern Sie NSPCs in zytokinarmem Medium (NSPC-Hungermedium, Supplemental Table 1) für 48 h.
      3. Fixieren Sie NSPCs mit 4% PFA für 20 min bei RT.
      4. Vor der Immunfärbung zweimal mit PBS für 5 min bei RT waschen.
    3. PC-Funktionsanalyse: SHH-Signalweg
      1. Saatgut dissoziierte NSPCs bei 100.000 Zellen/cm2 auf PO/lam-beschichteten 8-Well Chamber Slides (300 μL) oder T25 Schalen (5 ml) und inkubiert in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 in NMM für 2 Tage.
      2. Verhungern von NSPCs im NSPC-Hungermedium (300 μL pro Vertiefung des 8-Well-Kammerobjektträgers und 5 ml im T25-Kolben) für 48 h.
      3. Um den SHH-Signalweg zu induzieren, inkubieren Sie die NSPCs mit dem Hungermedium, das mit rekombinantem SHH (100 ng / ml) oder SAG (500 nM) ergänzt wird. (150 μL pro Vertiefung eines 8-Well-Kammerobjektträgers und 2 ml im T25-Kolben) für 24 h.
      4. Fixieren Sie NSPCs, die auf 8-Well-Kammerobjektträgern kultiviert wurden, in 250 μL 4% PFA pro Vertiefung für 20 min bei RT und waschen Sie sie zweimal mit 250 μL PBS für 5 min bei RT, bevor Sie die Immunfärbungsanalyse durchführen.
      5. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie NSPCs, die in T25-Schalen kultiviert wurden, mit PBS.
      6. 500 μL 0,05% Trypsin zugeben und 5 min bei 37 °C inkubieren, bis sich die Zellen lösen.
      7. Fügen Sie 2 ml Medium mit 10% FBS (DMEM + 10% FBS) hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren, und sammeln Sie die Zellsuspension in einem 15 mL konischen Röhrchen.
      8. Zentrifugiere 300 x g für 5 min und sauge den Überstand vorsichtig ab, um NSPC-Pellets zu erhalten, die vor der RNA-Extraktion und RT-PCR-Analyse bei -80 °C kryokonserviert werden können.

2. Bildung von dorsalen Vorderhirn-Organoiden

  1. Einzelzellkultur von hIPSCs
    1. Beginnen Sie mit hIPSC-Kulturen, die große regelmäßige Kolonien beherbergen, die weniger als 10% Differenzierung aufweisen und fast einmal durchquert wurden. Stellen Sie sicher, dass die Zellen nicht mehr als 80% konfluent sind.
    2. Waschen Sie die Kolonien mit 2 ml PBS.
    3. 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) zugeben und 5 bis 7 min bei 37 °C inkubieren.
    4. Aspirieren Sie das GCDR und fügen Sie 2 ml mTeRS1-Medium hinzu, das mit 5 μM Y-27632 ergänzt wird.
    5. Pipettieren Sie die Zellen vorsichtig 10 Mal auf und ab, um alle Kolonien in einzelne Zellen zu dissoziieren.
    6. Übertragen Sie die Zellen auf vitronectin-beschichtete Schalen und inkubieren Sie sie in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2.
      HINWEIS: Führen Sie vor dem Differenzierungsexperiment mindestens 1 Passage der hIPSCs mit GCDR durch, um die hIPSCs an Einzelzellkulturbedingungen anzupassen.
  2. Lassen Sie hIPSCs an Tag 0 embryonale Körper in EB-Medium bilden, die eine niedrige Konzentration von FGF2 und eine hohe Konzentration an Gesteinsinhibitor enthalten, die für das Überleben von hIPSC erforderlich ist. Führen Sie dazu die folgenden Schritte aus.
    1. Waschen Sie die Kolonien mit 2 ml PBS.
    2. 500 μL Gentle Cell Dissociation Reagent (GCDR) zugeben und 5 bis 7 min bei 37 °C inkubieren.
    3. Aspirieren Sie den GCDR und fügen Sie 1 ml EB-Medium hinzu, ergänzt mit 50 μM Y-27632; Verwenden Sie eine 1-ml-Pipette, um die Zellen vorsichtig zu lösen und in ein konisches 15-ml-Rohr zu übertragen.
    4. Spülen Sie noch einmal mit 2 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, und übertragen Sie die verbleibenden Zellen in das konische 15-ml-Rohr. Sofort 3 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632, in das konische Rohr geben und die Lösung mit einer 5-ml-Pipette vorsichtig homogenisieren.
    5. Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 100 x g für 5 min.
    6. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig und resuspenieren Sie die Zellen in 6 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632.
    7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 100 x g für 5 min.
    8. Aspirieren Sie den Überstand und resuspenieren Sie die Zellen in 1 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632. Verwenden Sie eine 1 ml Pipette, um die Zellen sanft in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren.
    9. Unmittelbar nach der Wiederverwendung der Zellen verdünnen und zählen.
    10. Verdünnen Sie das richtige Volumen der Zellsuspension (mit 900.000 Zellen) auf 30 ml EB-Medium, ergänzt mit 50 μM Y-27632 und 4 ng/ml bFGF, und mischen Sie die Lösung vorsichtig.
    11. Platte 9.000 Zellen/Well in eine 96U-Platte mit extrem niedrigem Aufsatz (300 μL/Well). Um eine störende EB-Bildung zu vermeiden, inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO2 bis Tag 3 ohne mittlere Veränderung.
  3. Neuronale Induktion (Duale SMAD-Hemmung)
    1. Stellen Sie an Tag 3 sicher, dass EBs 300-400 μm messen und regelmäßige Grenzen anzeigen. Wenn beide Kriterien erreicht sind, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums (150 μL) durch Induktionsmedium-1, das Dual-SMAD-Inhibitoren enthält, was zu einer Aufhellung der Kontur der EBs an Tag 6 bis Tag 7 führt, was auf eine neuroektodermale Differenzierung hinweist (ergänzende Tabelle 2).
    2. Ersetzen Sie an Tag 4 3/4 des Mediums (225 μL) durch Induktionsmedium-1.
    3. An Tag 6 und Tag 8: Die Hälfte des Induktionsmediums-1 (150 μL) auffrischen.
  4. Organoid-Einbettung in die Basalmembranmatrix (Tag 10)
    1. Am Tag 10 betten EBs in die wachstumsfaktorreduzierte Basalmembranmatrix (BMM) ein.
      HINWEIS: Verwenden Sie in diesem Schritt immer eine sterile Schere, um die Öffnung der Pipettenspitzen zu schneiden, um eine Beschädigung der Organoide durch wiederholtes Pipettieren zu vermeiden.
    2. Zunächst werden etwa 15-17 Organoide in konische Röhrchen übertragen. Lassen Sie die EBs sich absetzen und entfernen Sie das Medium. 50 μL Induktionsmedium-2 zugeben und in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μL BMM überführen.
    3. Verteilen Sie das Matrix-EB-Gemisch auf die Mitte einer Vertiefung einer Ultra-Low-Attachment-Platte und trennen Sie die EBs, um ein Verschmelzen zu verhindern.
    4. Lassen Sie das BMM im Inkubator bei 37 °C für 45 min erstarren.
    5. Fügen Sie 3 ml des Induktionsmediums-2 in jede Vertiefung hinzu und legen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass dieser Vorgang so schnell wie möglich durchgeführt wird, da BMM bei Raumtemperatur erstarrt.
  5. Stationäre Kultur von Organoiden, die in die Basalmembranmatrix eingebettet sind
    1. Tag 12, 14: Induktion mittel-2 auffrischen.
    2. Tag 16: Induktionsmedium-2 aktualisieren und unter dem Mikroskop die Ausdehnung neuroepithelialer Schleifen überprüfen.
  6. Basalmembranmatrixdissoziation und Kultur auf einem Orbitalschüttler
    1. Dissoziieren Sie an Tag 17 Organoide von BMM, indem Sie 10 Mal mit einer 5-ml-Pipette auf und ab pipettieren und in differenzierungsmedium-1 (ohne Vitamin A) übertragen. Inkubieren Sie auf einem Orbitalschüttler mit 80 U / min in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO2 , um die Nährstoffaufnahme zu verbessern.
      HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Inkubator für die stationäre Kultur und die Kultur auf einem Orbitalschüttler, um Vibrationen zu vermeiden, die für das Wachstum der anhaftenden hIPS-Zellen schädlich sind.
    2. Tag 19: Differenzierung mittel-1 auffrischen.
    3. Tag 21: Differenzierungsmedium-1 in Differenzierungsmedium-2 (mit Vitamin A) ändern.
    4. Von Tag 23 bis Tag 35: Erfrischen Sie Medium mit Differenzierung Medium-2 alle 2-3 Tage.
    5. Von Tag 35 bis Tag 70: Differenzierungsmedium-2 mit 1% BMM auffrischen und alle 2-3 Tage auffrischen.
    6. Sammeln Sie die Organoide nach 28, 42 und 70 +/- 2 Tagen der Differenzierung und fixieren Sie sie über Nacht bei 4 ° C, in 5 ml 4% PFA auf einem 15 ml konischen Röhrchen.
    7. Für eine weitere Toto - oder freischwebende Immunstaining-Analyse werden Organoide dann zweimal in PBS gespült und bei 4 °C in PBS + 0,05% Natriumazid konserviert.
    8. Für die Immunfärbungsanalyse an gefrorenen Abschnitten tauchen Sie 4% PFA-fixierte Organoide in 10 ml 30% Saccharose bei +4 °C ON (oder bis die Organoide sinken). In eine gefrorene Einbettungsmatrix einbetten und bis zur Kryosektion bei -80°C lagern.

3. In toto Immunomarkierung, Clearing und Lightsheet-Akquisition von dorsalen Vorhirn-Organoiden

  1. Fixierung
    1. Sammeln Sie die Organoide in 6-Well-Platten, entfernen Sie das Medium und fixieren Sie sie mit 2 ml 4% PFA bei 4 ° C über Nacht.
    2. Führen Sie drei Wäschen in 2 ml PBS bei Raumtemperatur durch.
    3. Die Organoide in 2 ml Röhrchen überführen und bei 4 °C in 2 mL PBS + 0,05% Natriumazid lagern.
  2. Permeabilisierung
    1. Inkubieren Sie Organoide in 1 ml PBS mit 0,2% Triton X100 bei RT für 1 h. Tun Sie dies zweimal.
    2. Über Nacht in 1 ml PBS mit 0,2 % Triton X100 und 20 % DMSO bei 37 °C inkubieren.
    3. Über Nacht in 1 ml PBS mit 0,1 % Tween20, 0,1 % Triton X100, 0,1 % Desoxycholat, 0,1 % NP40 und 20 % DMSO inkubieren.
    4. Inkubieren in 1 ml PBS mit 0,2% Triton-X100, bei RT, für 1 h. Tun Sie dies zweimal.
  3. Blockierung und Immunmarkierung
    1. Blockierung in 1 ml Blockierungslösung (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Eselserum, 10% DMSO), bei 37 °C, ON.
    2. Inkubieren Sie mit primären Antikörpern, verdünnt in 250 μL PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/ml Heparin, 5% DMSO und 3% Eselserum, bei 37 °C, für 2 Tage.
    3. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween20 und 0,1 μg/ml Heparin wird für 1 h bei 37 °C gewaschen. Tun Sie dies viermal.
    4. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween20 und 0,1 μg/ml Heparin über Nacht bei 37 °C waschen.
    5. Inkubieren Sie mit sekundären Antikörpern, verdünnt in 250 μL PBS, die 0,2% Tween 20, 0,1 μg/ml Heparin und 3% Eselserum enthalten, bei 37 °C, für 2 Tage.
    6. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween 20 und 0,1 μg/ml Heparin wird für 1 h auf einem Rad bei RT gewaschen. Tun Sie dies viermal.
    7. 1 ml PBS mit 0,2 % Tween 20 und 0,1 μg/ml Heparin über Nacht auf einem Rad bei RT waschen.
    8. Waschen Sie in 1 ml PBS, für 24 h, bei RT.
    9. Bei +4 °C in 1 ml PBS und 0,05% Natriumazid bis zur Klärung lagern.
  4. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkubieren Sie die Organoide in 1 ml 30% TDE (3 ml TDE + 7 ml PBS) für 24 h bei RT.
    2. Inkubieren sie in 1 ml 60% TDE (6 ml TDE + 4 ml PBS) für 24 h bei RT.
    3. Inkubieren Sie in 1 ml 80% TDE (8 ml TDE + 2 ml PBS) für 24 h bei RT.
  5. Organoideinbettung vor der Erfassung von Lichtblechen
    HINWEIS: Verwenden Sie ein maßgeschneidertes System; hergestellt mit einer 1 ml Spritze mit der Spitze, die mit einem Skalpell geschnitten ist.
    1. 100 ml 4% ige niedrigschmelzende Agarose in 60% TDE-Lösung und Aliquot in 2 mL Röhrchen zubereiten. Konservieren bei +4 °C.
    2. Vor der Organoideinbettung ein Röhrchen mit 1,5 ml 4% niedrigschmelzender Agarose in 60% TDE in einem Wasserbad bei 37 °C vorheizen, bis es sich verflüssigt.
    3. Bereiten Sie in der Zwischenzeit ein maßgeschneidertes Formsystem aus einer 1-ml-Spritze vor, deren Spitze mit einem Skalpell abgeschnitten wird.
    4. Pumpen Sie die Spritze 600 μL der Gellösung mit dem Kolben ein.
    5. Positionieren Sie die Probe mit einer vergrößerten Pipettenspitze, deren Öffnung mit einer sterilen Schere geschnitten wurde.
    6. Füllen Sie die Spritze mit 400 μL Gellösung, so dass die Probe im unteren Drittel der Spritze positioniert ist.
    7. Lassen Sie das Gel polymerisieren und lagern Sie es in 80% iger TDE-Lösung bei 4 °C lichtgeschützt bis zur Aufnahme.
    8. Verwenden Sie für die Erfassung von Lichtbögen ein 20-faches Objektiv, das in 80% TDE-Lösung eingetaucht ist, die in die Probenkammer gegeben wird, um eine genaue Anpassung an den Brechungsindex der Clearing-Methode zu ermöglichen.
    9. Führen Sie die Spritze, die das in Agarose eingebettete Organoid enthält, in den größten Probenhalter ein, der für eine 1-ml-Spritze ausgelegt ist, deren Kolben betätigt werden kann, um das Organoid vor dem Objektiv zu positionieren.
      HINWEIS: Die Erfassung eines ganzen Organoids durch lichte Blätter dauert ca. 5 bis 10 min.

4. Immunfärbung und Beseitigung frei schwebender Abschnitte dorsaler Organoide des Vorderhirns

  1. Fixierung, Agarose-Einbettung und Schnittung der Organoide
    1. Organoide nach 28, 42 und 70 +/- 2 Tagen der Differenzierung in einer 6-Well-Platte sammeln und über Nacht bei 4 °C in 2 ml 4% PFA fixieren.
    2. Zweimal in 2 mL PBS abspülen und bei 4 °C in 2 mL PBS + 0,05% Natriumazid konservieren.
    3. Die fixierten Organoide in 4% niedrigschmelzende Agarose in einer Kunststoffeinbettungsform (7 x 7 mm) einbetten. Entfernen Sie den Agaroseblock vorsichtig aus der Kunststoffform und kleben Sie ihn auf die Vibratomstufe.
    4. Schneiden Sie die eingebetteten Organoide mit einem Vibratom, um 150 μm freischwebende Abschnitte zu erhalten, die in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte mit 500 μL PBS mit einem Pinsel übertragen werden, um eine Beschädigung der Abschnitte zu vermeiden.
      HINWEIS: Niedrigschmelzende Agarose wird empfohlen, da ihre Schmelztemperatur nur etwa 60 °C beträgt. 4% niedrigschmelzende Agarose in PBS-Lösung zubereiten und vor der Organoideinbettung knapp über 37 °C in einem Wasserbad abkühlen lassen.
  2. Permeabilisierung, Blockierung und Immunfärbung
    1. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, die 0,3% Triton X100 enthalten, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies dreimal.
    2. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, die 0,3% Triton X100 und 5% fettfreie Milch enthalten, bei RT, unter Rühren, für 2 h.
    3. Inkubieren Sie die Abschnitte in 250 μL primärer Antikörperlösung (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fettfreie Milch) unter Rühren bei +4 °C über Nacht.
    4. Waschen Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies viermal.
    5. Inkubieren Sie die Abschnitte in 250 μL sekundärer Antikörperlösung (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% fettfreie Milch) bei RT unter Rühren für 2 h.
    6. Waschen Sie die Abschnitte in 500 μL PBS, bei RT, unter Rühren, für 20 min. Tun Sie dies viermal.
    7. Lagern Sie die Abschnitte in 500 μL PBS bei +4 ° C bis zur Klärung.
  3. Clearing in TDE (2,2′ -Thiodiethanol)
    1. Inkubieren Sie die Abschnitte in 500 μL von 30% und 60% TDE für jeweils 1 h bei RT und dann in 500 μL von 80% TDE über Nacht bei RT.
    2. Lagern Sie die geräumten Abschnitte in 500 μL 80% TDE bis zur Aufnahme bei +4 °C.
  4. Montage von frei schwebenden Abschnitten vor der Erfassung mit resonanter Konfokalkamera
    1. Montieren Sie einen frei schwebenden Abschnitt in einer versiegelten Kammer, die es ermöglicht, die Probe in 80% TDE-Lösung zu halten, und die so konzipiert ist, dass sie sich an eine motorisierte XY-Stufe konfokaler Mikroskope anpasst.
    2. Legen Sie einen runden Deckglas in das Kammersystem.
    3. Übertragen Sie den geklärten immungefärbten Abschnitt vorsichtig mit einem Pinsel.
    4. Füllen Sie die Kammer mit 80% TDE-Lösung.
    5. Fügen Sie zwei Standard-Deckgläser sowie einen zweiten runden Deckglas und eine Silikondichtung hinzu.
    6. Schrauben Sie den Schraubring der Kammer auf, um das System perfekt abzudichten.

5. Lichtblatt- und Resonanz-Scanning-Konfokalanalyse

  1. Verarbeiten Sie Lichtblatt- und Resonanzscanning-Aufnahmen mit einer Software, die eine 3D-Visualisierung und -Analyse der gesamten immungefärbten Probe ermöglicht.
    HINWEIS: Eine solche Software ermöglicht es, schnell riesige Daten zu öffnen, um auf einfache Weise Schnappschüsse und Animationen zu erstellen. Es ermöglicht das Verschieben der Probe in verschiedenen Ausrichtungen und das Generieren von 2D-Ansichten dank eines 2D-Slicer-Werkzeugs in verschiedenen Ausrichtungen, z. B. XY und YZ.
  2. Für die automatische Erkennung von Zentrosomen und primären Zilien verwenden Sie einen Spot-Assistenten, der es ermöglicht, ihre Anzahl unter pathologischen im Vergleich zu Kontrollbedingungen zu quantifizieren.
  3. Für die 3D-Rekonstruktion des PCs, die eine präzise Messung ihrer Länge ermöglicht, verwenden Sie einen Filamentassistenten, um den Ausgangspunkt des PCs manuell zu fixieren, und die Software verwendet das Fluoreszenzsignal, um den PC präzise zu rekonstruieren.

Ergebnisse

Zellbasierte 2D-hIPS-Modelle zur Untersuchung der primären Cilium-Biogenese und -Funktion
Das hier beschriebene Protokoll wurde aus zuvor veröffentlichten Studien angepasst20,21,22. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung von neuronalen Rosettenstrukturen, die neokortikale Vorläufer und Neuronen enthalten, die denen im sich entwickelnden Neokortex ähneln. Eine detaillierte Validierung kann durch konven...

Diskussion

PC werden heute als Schlüsselorganellen angesehen, die entscheidende Schritte während der normalen zerebralen kortikalen Entwicklung regulieren18,19,31 einschließlich NSPC-Expansion und -Engagement8,9,10,11,12 sowie neuronale Migration13,14

Offenlegungen

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Agence Nationale de la Recherche (ANR) an S.T. (ANR-17-CE16-0003-01) und N.B.B. (ANR-16-CE16-0011 und ANR-19-CE16-0002-01) unterstützt. LB wird vom ANR im Rahmen des Programms Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01) und der Fondation Bettencourt Schueller (MD-PhD-Programm) unterstützt. Das Imagine Institute wird durch staatliche Mittel des ANR im Rahmen des Programms Investissements d'avenir (ANR-10-IAHU-01, CrossLab-Projekte) und im Rahmen des zweiten Programms Investissements d'Avenir (ANR-17-RHUS-0002) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)ThermoFisher Scientific31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well PlatesCorning3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment MicroplateCorning7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AThermoFisher Scientific12587010
B-27 Supplement (50X), serum freeThermoFisher Scientific17504044
CellAdhere Dilution BufferStemCell Technologies7183
DMEM/F-12, GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
Easy Grip 35 10mmFalcon353001
EDTAThermoFisher Scientific15575020
EGF , 25µgThermofischerPHG0315
FGF2 , 25µgThermofischerPHG0264
Gentle Cell Dissociation ReagentStemCell Technologies7174
InsulinThermoFisher Scientific12585014
KnockOut SerumThermoFisher Scientific10828028
Laminin (1mg)Thermofischer23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
Matrigel Growth Factor ReducedCorning354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)ThermoFisher Scientific11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
Neural Basal MediumThermofischer21103049
Orbital shakerDutscher995002
PBSThermoFisher Scientific14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
PFA 32%Electron Microscopy Sciences15714
Poly-L-Ornithine (PO)SigmaP4957
Recombinant human BDNF 10 µgStem Cell Technologies78005
Recombinant Human FGF-basicPeprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2StemCultureSB500
SucroseSigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus Adhesion SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
Supplément N2- (100X)ThermoFisher Scientific17502048
TDE 2,2’-ThiodiethanolSigma Aldrich166782-500G
VitronectinStemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
Primary Antibodies
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-CadherinBD Transduction Lab6109211/500e
P-VimentinMBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000e
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γTUBULINSigma AldrichT65571/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488ThermoFisher ScientificA212061/500e
Goat anti-mouse AF555ThermoFisher ScientificA214221/500e
Goat anti-mouse AF647ThermoFisher ScientificA212361/500e
Goat anti-rat AF555ThermoFisher ScientificA214341/500e

Referenzen

  1. Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
  2. Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. Genetics. 11 (5), 331-344 (2010).
  3. Hansen, D. V., Lui, J. H., Parker, P. R. L., Kriegstein, A. R. Neurogenic radial glia in the outer subventricular zone of human neocortex. Nature. 464 (7288), 554-561 (2010).
  4. Lui, J. H., Hansen, D. V., Kriegstein, A. R. Development and evolution of the human neocortex. Cell. 146 (1), 18-36 (2011).
  5. Nonaka-Kinoshita, M., et al. Regulation of cerebral cortex size and folding by expansion of basal progenitors. The EMBO Journal. 32 (13), 1817-1828 (2013).
  6. Taverna, E., Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis: toward an understanding of the development and evolution of the neocortex. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 465-502 (2014).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Spear, P. C., Erickson, C. A. Apical movement during interkinetic nuclear migration is a two-step process. Developmental Biology. 370 (1), 33-41 (2012).
  9. Wilsch-Bräuninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution - from cell biology to single genes. Current Opinion in Neurobiology. 39, 122-132 (2016).
  10. Anderson, C. T., Stearns, T. Centriole age underlies asynchronous primary cilium growth in mammalian cells. Current Biology: CB. 19 (17), 1498-1502 (2009).
  11. Paridaen, J. T. M. L., Wilsch-Bräuninger, M., Huttner, W. B. Asymmetric inheritance of centrosome-associated primary cilium membrane directs ciliogenesis after cell division. Cell. 155 (2), 333-344 (2013).
  12. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. The EMBO Journal. 35 (8), 803-819 (2016).
  13. Higginbotham, H., et al. Arl13b-regulated cilia activities are essential for polarized radial glial scaffold formation. Nature Neuroscience. 16 (8), 1000-1007 (2013).
  14. Baudoin, J. -. P., et al. Tangentially migrating neurons assemble a primary cilium that promotes their reorientation to the cortical plate. Neuron. 76 (6), 1108-1122 (2012).
  15. Higginbotham, H., et al. Arl13b in primary cilia regulates the migration and placement of interneurons in the developing cerebral cortex. Developmental Cell. 23 (5), 925-938 (2012).
  16. Kumamoto, N., et al. A role for primary cilia in glutamatergic synaptic integration of adult-born neurons. Nature Neuroscience. 15 (3), 399-405 (2012).
  17. Guadiana, S. M., et al. Arborization of dendrites by developing neocortical neurons is dependent on primary cilia and type 3 adenylyl cyclase. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (6), 2626-2638 (2013).
  18. Thomas, S., Boutaud, L., Reilly, M. L., Benmerah, A. Cilia in hereditary cerebral anomalies. Biology of the Cell. 111 (9), 217-231 (2019).
  19. Hasenpusch-Theil, K., Theil, T. The multifaceted roles of primary cilia in the development of the cerebral cortex. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 630161 (2021).
  20. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  21. Boissart, C., et al. Differentiation from human pluripotent stem cells of cortical neurons of the superficial layers amenable to psychiatric disease modeling and high-throughput drug screening. Translational Psychiatry. 3, 294 (2013).
  22. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  23. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  24. Qian, X., et al. Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor. Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).
  25. Krefft, O., Jabali, A., Iefremova, V., Koch, P., Ladewig, J. Generation of standardized and reproducible forebrain-type cerebral organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  26. Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
  27. Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. A guide to generating and using hiPSC derived NPCs for the study of neurological diseases. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (96), e52495 (2015).
  28. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nature Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  29. Hansen, J. N., et al. Multifocal imaging for precise, label-free tracking of fast biological processes in 3D. bioRxiv. , (2020).
  30. Pașca, S. P. The rise of three-dimensional human brain cultures. Nature. 553 (7689), 437-445 (2018).
  31. Andreu-Cervera, A., Catala, M., Schneider-Maunoury, S. Cilia, ciliopathies and hedgehog-related forebrain developmental disorders. Neurobiology of Disease. 150, 105236 (2021).
  32. Christensen, S. T., Morthorst, S. K., Mogensen, J. B., Pedersen, L. B. Primary cilia and coordination of Receptor Tyrosine Kinase (RTK) and Transforming Growth Factor β (TGF-β) signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (6), (2017).
  33. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the primary cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  34. Sivitilli, A. A., et al. Robust production of uniform human cerebral organoids from pluripotent stem cells. Life Science Alliance. 3 (5), (2020).
  35. Quelennec, E., et al. Generation of two induced pluripotent stem cell lines IMAGINi004-A and IMAGINi005-A from healthy donors. Stem Cell Research. 48, 101959 (2020).
  36. Belle, M., et al. Tridimensional visualization and analysis of early human development. Cell. 169 (1), 161-173 (2017).
  37. Vigouroux, R. J., Belle, M., Chédotal, A. Neuroscience in the third dimension: shedding new light on the brain with tissue clearing. Molecular Brain. 10 (1), 33 (2017).
  38. Lallemant, L., Lebreton, C., Garfa-Traoré, M. Comparison of different clearing and acquisition methods for 3D imaging of murine intestinal organoids. Journal of Biological Methods. 7 (4), 141 (2020).
  39. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PloS One. 10 (1), 0116280 (2015).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

Developmental Biologyprim res Ciliumhumane induzierte pluripotente StammzellenhIPSCsneurale Stamm und Vorl uferzellenhumane zerebrale kortikale Entwicklungneuronale Rosettendorsale Vorderhirnorganoide2D und 3D hIPSC basierte Modelle der neokortikalen Entwicklungzerebrale OrganoideSonic HedgehogWhole Mount Immunostainingoptisches ClearingLichtblattmikroskop

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten