Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Resumo

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Resumo

Cilia primária (PC) são organelas dinâmicas de microtúbulos não motil que se projetam da superfície da maioria das células mamíferas. Eles emergem do centríclulo mais antigo durante a fase G1/G0 do ciclo celular, enquanto desmontam à medida que as células reentram no ciclo celular no limite da fase G2/M. Eles funcionam como hubs de sinal, detectando e transduzindo sinais extracelulares cruciais para muitos processos celulares. Semelhante à maioria dos tipos de células, todas as células-tronco neurais neocorticais e progenitoras (NSPCs) têm sido mostradas abrigando um PC permitindo-lhes sentir e transduzir sinais específicos necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal. Aqui, fornecemos protocolos detalhados para gerar e caracterizar modelos bidimensionais (2D) e tridimensionais (3D) baseados em células-tronco de células-tronco induzidas por humanos (hIPSCs) para dissecar ainda mais o envolvimento do PC durante o desenvolvimento neocortical. Em particular, apresentamos protocolos para estudar a biogênese do PC e funcionar em NSPCs derivados de roseta neural 2D, incluindo a transdução da via Sonic Hedgehog (SHH). Para aproveitar a organização tridimensional (3D) de organoides cerebrais, descrevemos um método simples para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos. Após a limpeza óptica, a rápida aquisição de organoides inteiros permite a detecção de centrossomos e PC em progenitores neocorticais e neurônios de todo o organoide. Por fim, detalhamos o procedimento de imunostenção e compensação de seções organoides de flutuação livre espessa preservando um grau significativo de informações espaciais 3D e permitindo a aquisição de alta resolução necessária para a análise qualitativa e quantitativa detalhada da biogênese e função do PC.

Introdução

Cílios primários (PC) são organelas à base de microtúbulos que sentem e transduzem uma infinidade de pistas químicas e mecânicas do ambiente extracelular. Em particular, pc é a organela central para a transdução da via de sinalização hedgehog em ^{vertebrados1,2}. Embora a maioria das células neurais tenham sido mostradas há muito tempo abrigando um PC, a contribuição desta organela na formação do sistema nervoso central tem sido há muito desvalorizada. Estudos sobre desenvolvimento neocortical levaram à descoberta de múltiplas células-tronco neurais e progenitoras (NSPCs), todas abrigando um PC, local que foi proposto para ser crucial para a determinação do destino progenitora3,4,5,6,7. O PC tem sido mostrado crucial para os mecanismos celulares necessários para o desenvolvimento cortical cerebral normal, incluindo a expansão do NSPC e o compromisso ^de 8,9,10,11,12, bem como a polaridade apicobasal do andaime glial radial que suporta a migração ^neuronal13. Além disso, pc são necessários durante a migração tangencial de interneurons para a placa ^{cortical14,15}. Finalmente, foi proposto um papel para o PC no estabelecimento de conexões sinápticas de neurônios no córtex ^{cerebral16,17}. Ao todo, esses achados defendem um papel crucial do PC nas principais etapas do desenvolvimento cortical ^{cerebral18,19} e levantam a necessidade de investigar seu envolvimento nos mecanismos patológicos subjacentes às anomalias do desenvolvimento cortical cerebral.

Estudos recentes melhoraram em grande parte nossa compreensão de importantes diferenças celulares e moleculares entre o desenvolvimento cortical em modelos humanos e animais, enfatizando a necessidade de desenvolver sistemas de modelos humanos. Nessa visão, as células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (hIPSCs) representam uma abordagem promissora para estudar a patogênese da doença em um contexto genético e celular relevante. Modelos bidimensionais aderentes (2D) ou rosetas neurais contêm NSPCs semelhantes aos vistos no córtex cerebral em desenvolvimento, que se organizam em estruturas em forma de roseta mostrando polaridade apicobasal correta20,21,22. Além disso, o sistema de cultura tridimensional (3D) permite a geração de organoides forebraínicos dorsais que recapitulam muitas características do desenvolvimento cortical cerebral humano23,24,25,26. Essas duas abordagens complementares de modelagem baseada em células oferecem perspectivas interessantes para dissecar o envolvimento do PC durante o desenvolvimento normal e patológico do córtex cerebral.

Aqui, fornecemos protocolos detalhados para a geração e caracterização de rosetas neurais e NSPCs derivadas, bem como organoides forebraínicos dorsais. Também fornecemos protocolos detalhados para analisar a biogênese e a função do PC presente nos NSPCs, testando a transdução da via Sonic Hedgehog e analisando a dinâmica das moléculas cruciais envolvidas nesse caminho. Para aproveitar a organização 3D dos organoides cerebrais, também criamos um método simples e econômico para imagens 3D de organoides cerebrais imunossuídos permitindo a rápida aquisição, graças a um microscópio de folha de luz, de todo o organoide, com alta resolução permitindo visualizar PC em todos os tipos de progenitores neocorticais e neurônios de todo o órgãoide. Finalmente, adaptamos a imunohistoquímica em seções flutuantes livres de 150 μm com compensação e aquisição subsequentes usando microscópio confocal de varredura ressonante permitindo a aquisição de imagens de alta resolução, o que é necessário para a análise detalhada da biogênese e função do PC. Especificamente, o software de imagem 3D permite a reconstrução 3D do PC com análise subsequente de parâmetros morfológicos, incluindo comprimento, número e orientação do PC, bem como medição da intensidade do sinal de componentes ciliares ao longo do axoneme.

Protocolo

1. Geração de modelos baseados em células 2D hIPS de desenvolvimento neocortical

1. Formação de roseta neural
   1. Comece com as culturas do HIPSC abrigando grandes colônias regulares, exibindo menos de 10% de diferenciação e não mais de 80% de confluência.
   2. Enxágüe os hIPSCs com 2 mL de PBS.
   3. Adicione 2 mL de meio de indução NSPC complementado com o inibidor de rocha (NIM + 10 μM de Y-27632).
   4. Dissecar manualmente cada colônia hIPSC de um prato de 35 mm usando uma agulha para cortar cada colônia precisamente em direções horizontais e verticais para criar um padrão de tabuleiro de verificador dividindo cada colônia em aglomerados iguais.
   5. Retire a colônia usando um raspador de células e transfira-os para um prato de 35 mm de ultra-baixo.
   6. Deixe-os flutuar durante a noite (ON) em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2, para que possam formar corpos embrionários (EBs).
      NOTA: Os corpos embrióides (EBs) são definidos como aglomerados esferoides flutuantes ou agregados de hIPSCs.
   7. Transfira os EBs para pratos poli-L-ornithine/laminin (PO/lam)-coated 35 mm em 2 mL NIM + 10 μM de Y-27632.
   8. Atualização diária Meio de indução NSPC (NIM sem Y-27632) até a formação de rosetas neurais que leva aproximadamente 12 a 14 dias. Verifique sob o microscópio.
      NOTA: Após esta etapa, as rosetas neurais podem ser expandidas, diferenciadas e processadas para análise de imunosstaining ou dissociadas para obter células neurais e progenitoras isoladas (NSPCs).
2. Expansão de roseta neural e diferenciação precoce
   1. Corte as rosetas neurais em um padrão de grade com uma agulha e desaloja os aglomerados usando um raspador de células.
   2. Transfira as rosetas para uma placa de 4 poços contendo tampas de vidro revestidas de PO/lam (4-5 rosetas/bem) em 0,5 mL de meio de manutenção NSPC (NMM).
   3. Incubar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2.
   4. Atualize nmm a cada dois dias até o dia 20.
   5. A partir do dia 20, as rosetas neurais da cultura em 0,5 mL de citocina esgotadas NMM para permitir a diferenciação. Atualize o meio a cada 2-3 dias.
   6. Nos dias 30 e dia 40 (10 ou 20 dias de diferenciação), fixe as rosetas com 0,5 mL de 4% PFA, 20 min, RT.
3. Biogênese do PC e análise de funções em NSPCs isolados
   1. Dissociação do NSPC
      1. Corte as rosetas neurais do passo 1.1.8 em um padrão de grade com uma agulha e desaloja os clusters usando um raspador de células. Transfira as células para pratos de 35 mm revestidos de PO/lam em 2 mL de NMM e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2.
      2. Atualize nmm a cada dois dias até a confluência (aproximadamente 5-7 dias).
      3. Depois de raspar as células grandes e claras ao redor das rosetas neurais, escolha-as manualmente e transfira-as para pratos frescos revestidos de PO/lam de 35 mm para enriquecer para NSPCs e esgotar tipos de células não neurais.
      4. Após uma ou duas passagens manuais (repetir a etapa 1.3.1.3, se necessário) necessárias para remover todos os tipos de células contaminantes, remova o meio e enxágue com PBS.
      5. Adicione 300 μL de trippsina de 0,05% e incubar por 5 min a 37 °C até que a maioria das células se desprendem.
      6. Adicione 2 mL do meio contendo 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) para inativar a trippsina. Colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL. Pipete suavemente a suspensão da célula para cima e para baixo três vezes para quebrar os aglomerados celulares.
      7. Centrifugar a 300 x g por 5 min.
      8. Aspire cuidadosamente o supernatante e resuspense as células em NMN.
      9. Semear os NSPCs dissociados como células únicas (1 x ¹⁰⁵ células/^cm2) em NMM em pratos revestidos de PO/lam e incuba-los em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2.
      10. Expanda os NSPCs em NMM alterando o meio a cada dois dias.
          NOTA: Os NSPCs são semeados em alta densidade para evitar diferenciação.
   2. Análise de biogênese do PC
      1. As sementes dissociaram os NSPCs a 100.000 células/^cm2 e incubam-nas em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2 em NMM por 2 dias.
      2. Aspire os NSPCs médios e famintos em meio empobrecido de citocina (meio de fome NSPC, Tabela Suplementar 1) por 48 h.
      3. Corrigir NSPCs com 4% de PFA por 20 min na RT.
      4. Lave duas vezes com PBS por 5 minutos no RT antes de imunossuagem.
   3. Análise da função do PC: caminho de sinalização SHH
      1. As NSPCs dissociadas por 100.000 células/^cm2 em lâminas de câmara de 8 poços revestidas de PO/lam (300 μL) ou T25 (5 mL) e incubam em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2 em NMM por 2 dias.
      2. Starve NSPCs em NSPC meio de fome (300 μL por poço de 8-well slide de câmara e 5 mL em frasco T25) por 48 h.
      3. Para induzir a via SHH, incubar os NSPCs com o meio de fome suplementado com SHH recombinante (100 ng/mL) ou SAG (500 nM); (150 μL por poço de um escorregador de câmara de 8 poços e 2 mL em frasco T25) por 24 h.
      4. Corrija NSPCs cultivados em slides de câmara de 8 poços em 250 μL de 4% pfa por poço por 20 min em RT e lave-os duas vezes com 250 μL de PBS por 5 min na RT antes da análise imunosstaining.
      5. Remova os NSPCs médios e lavem cultivados em pratos T25 com PBS.
      6. Adicione 500 μL de 0,05% de trippsina e incubar por 5 min a 37 °C até que as células se desprendem.
      7. Adicione 2 mL de meio contendo 10% de FBS (DMEM + 10% FBS) para inativar a trippsina e coletar a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mL.
      8. Centrifugar a 300 x g por 5 min e aspirar cuidadosamente o supernante para obter pelotas NSPC que podem ser criopreservadas a -80 °C antes da extração de RNA e análise RT-PCR.

2. Geração de organoides de forebraína dorsal

1. Cultura unicelular de hIPSCs
   1. Comece com as culturas do HIPSC que abrigam grandes colônias regulares que exibem menos de 10% de diferenciação e que foram passagemdas quase uma vez. Certifique-se de que as células não são mais do que 80% confluentes.
   2. Lave as colônias com 2 mL de PBS.
   3. Adicione 500 μL de Reagente de Dissociação Celular Suave (GCDR) e incubar por 5 a 7 min a 37 °C.
   4. Aspire o GCDR e adicione 2 mL de mTeRS1 médio suplementado com 5 μM de Y-27632.
   5. Pipeta as células suavemente para cima e para baixo 10 vezes para dissociar todas as colônias em células únicas.
   6. Transfira as células em pratos revestidos de vitronectina e incubar em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2.
      NOTA: Realize pelo menos 1 passagem dos hIPSCs usando GCDR antes do experimento de diferenciação para adaptar os hIPSCs às condições de cultura unicelular.
2. No dia 0, permitam que os hIPSCs formem corpos embrionários em meio EB contendo uma baixa concentração de FGF2 e uma alta concentração de inibidor de rochas necessária para a sobrevivência do HIPSC. Para isso, siga os passos abaixo.
   1. Lave as colônias com 2 mL de PBS.
   2. Adicione 500 μL de Reagente de Dissociação Celular Suave (GCDR) e incubar por 5 a 7 min a 37 °C.
   3. Aspire o GCDR e adicione 1 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632; Use uma pipeta de 1 mL para desprender suavemente as células e transferi-las para um tubo cônico de 15 mL.
   4. Enxágüe mais uma vez com 2 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632, transfira as células restantes para o tubo cônico de 15 mL. Adicione imediatamente 3 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632 ao tubo cônico e homogeneize suavemente a solução usando uma pipeta de 5 mL.
   5. Centrifugar as células dissociadas a 100 x g por 5 min.
   6. Aspire suavemente o supernasce e resuspenque as células em 6 mL de meio EB suplementado com 50 μM de Y-27632.
   7. Centrifugar as células a 100 x g por 5 min.
   8. Aspire o supernasal e resuspense as células em 1 mL de EB médio suplementado com 50 μM de Y-27632. Use uma pipeta de 1 mL para dissociar suavemente as células em uma suspensão de célula única.
   9. Imediatamente após resususuco as células, diluir e contá-las.
   10. Diluir o volume adequado de suspensão celular (contendo 900.000 células) em 30 mL de meio EB complementado com 50 μM de Y-27632 e 4 ng/mL de bFGF e misturar suavemente a solução.
   11. Placa 9.000 células/bem em uma placa de fixação ultra-baixa 96U (300 μL/well). Para evitar perturbações na formação do EB, incubar a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2 até o dia 3 sem alteração média.
3. Indução neural (inibição dual SMAD)
   1. No dia 3, assegure-se de que os EBs medem 300-400 μm e mostram fronteiras regulares. Se ambos os critérios forem alcançados, substitua metade do meio (150 μL) por indução média-1 contendo inibidores dual SMAD, levando ao brilho do contorno dos EBs pelo dia 6 ao dia 7 indicando diferenciação neuroectodérmica (Tabela Suplementar 2).
   2. No dia 4, substitua 3/4 do médio (225 μL) por meio de indução-1.
   3. Nos dias 6 e 8: Refresque metade do meio de indução-1 (150 μL).
4. Organoide incorporando em matriz de membrana do porão (Dia 10)
   1. No dia 10, incorporar EBs no fator de crescimento reduziu a matriz de membrana do porão (BMM).
      NOTA: A partir desta etapa, use sempre uma tesoura estéril para cortar a abertura das pontas da pipeta para evitar danificar os organoides por meio de tubulações repetidas.
   2. Primeira transferência em torno de 15-17 organoides em tubos cônicos. Deixe os EBs se acomodarem e removam o meio. Adicione 50 μL de indução média-2 e transfira-os para um tubo de microcentrifusagem contendo 100 μL de BMM.
   3. Espalhe a mistura matriz-EB no centro de um poço de uma placa de ultra-baixa fixação e separe os EBs para evitar que eles se fundam.
   4. Deixe o BMM solidificar na incubadora a 37 °C por 45 min.
   5. Adicione 3 mL do meio-2 de indução em cada poço e coloque a placa em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2.
      NOTA: Certifique-se de que este procedimento seja feito o mais rápido possível, pois o BMM se solidifica à temperatura ambiente.
5. Cultura estacionária de organoides incorporados na matriz da membrana do porão
   1. Dia 12, 14: Atualizar a indução média-2.
   2. Dia 16: Refrescar a indução média-2 e verificar sob um microscópio a expansão de laços neuroepiteliois.
6. Dissociação da matriz da membrana do porão e cultura em um agitador orbital
   1. No dia 17, dissociar organoides da BMM por pipetar para cima e para baixo 10 vezes com uma pipeta de 5 mL e transferi-los para a diferenciação média-1 (sem vitamina A). Incubar em um agitador orbital a 80 rpm em uma incubadora umidificada a 37 °C e 5% de _CO2 para melhorar a absorção nutricional.
      NOTA: Use uma incubadora diferente para cultura estacionária e cultura em um agitador orbital para evitar vibrações prejudiciais ao crescimento de células hIPS aderentes.
   2. Dia 19: Atualizar a diferenciação média-1.
   3. Dia 21: Alterar a diferenciação média-1 para diferenciar o médio-2 (com vitamina A).
   4. Do dia 23 ao dia 35: Atualizar o meio com diferenciação média-2 a cada 2-3 dias.
   5. Do dia 35 ao dia 70: Atualize a diferenciação média-2 com 1% de BMM e atualize a cada 2-3 dias.
   6. Colete os organoides após 28, 42 e 70 +/- 2 dias de diferenciação e fixe-os durante a noite a 4 °C, em 5 mL 4% PFA em um tubo cônico de 15 mL.
   7. Para análise suplementar ou de imunostaining flutuante livre, os organoides são então enxaguados duas vezes em PBS e conservados a 4 °C em PBS + 0,05% de azida de sódio.
   8. Para análise de imunossuagem em seções congeladas, mergulhe 4% de organoides fixos PFA em 10 mL 30% de sacarose a +4 °C ON (ou até que os organoides afundem). Incorpore-os em uma matriz de incorporação congelada e armazene a -80°C até que se cryosectioning.

3. Na aquisição de imunolabeling, compensação e folha de luz de organoides forebraínticos dorsais

1. Fixação
   1. Colete os organoides em placas de 6 poços, remova o meio e fixe-os com 2 mL de 4% PFA, a 4 °C, durante a noite.
   2. Realizar três lavagens em 2 mL de PBS em temperatura ambiente.
   3. Transfira os organoides em tubos de 2 mL e armazene a 4 °C em 2 mL de PBS + 0,05% de azida de sódio.
2. Permeabilização
   1. Incubar organoides em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton X100 em RT por 1 h. Faça isso duas vezes.
   2. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton X100 e 20% DMSO, a 37 °C, durante a noite.
   3. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,1% Tween20, 0,1% Triton X100, 0,1% Desoxicolado, 0,1% NP40 e 20% DMSO, a 37 °C, durante a noite.
   4. Incubar em 1 mL de PBS contendo 0,2% Triton-X100, na RT, por 1h. Faça isso duas vezes.
3. Bloqueio e imunolabelamento
   1. Bloco em 1 mL de solução de bloqueio (PBS, 0,2% Triton X100, 6% Donkey Serum,10% DMSO), a 37 °C, ON.
   2. Incubar com anticorpos primários diluídos em 250 μL de PBS, 0,2% Tween20, 0,1 μg/mL de Heparina, 5% DMSO e 3% De Soro de Burro, a 37 °C, por 2 dias.
   3. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween20 e 0,1 μg/mL de Heparina, por 1h, a 37 °C. Faça isso quatro vezes.
   4. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween20 e 0,1 μg/mL de Heparina, durante a noite, a 37 °C.
   5. Incubar com anticorpos secundários diluídos em 250 μL de PBS contendo 0,2% Tween 20, 0,1 μg/mL de Heparina e 3% De Soro de Burro, a 37 °C, durante 2 dias.
   6. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL de Heparina, por 1h, em uma roda, na RT. Faça isso quatro vezes.
   7. Lave em 1 mL de PBS contendo 0,2% Tween 20 e 0,1 μg/mL de Heparina, durante a noite, em uma roda, na RT.
   8. Lave em 1 mL de PBS, por 24 h, na RT.
   9. Estoque a +4 °C em 1 mL de PBS e 0,05% azida de sódio até a compensação.
4. Limpeza em TDE (2,2′ -Thiodietanol)
   1. Incubar os organoides em 1 mL de 30% TDE (3 mL de TDE + 7 mL de PBS), por 24 h, na RT.
   2. Incubar em 1 mL de 60% TDE (6 mL de TDE + 4 mL de PBS), por 24 h, na RT.
   3. Incubar em 1 mL de 80% TDE (8 mL de TDE + 2 mL de PBS), por 24 h, na RT.
5. Incorporação organoide antes da aquisição de folha de luz
   NOTA: Use um sistema personalizado; feito com uma seringa de 1 mL com a ponta cortada com um bisturi.
   1. Prepare 100 mL de 4% de Agarose de Baixo Derretimento em solução TDE de 60% e alíquota em tubos de 2 mL. Conservar a +4 °C.
   2. Antes da incorporação organoide, pré-aqueça um tubo contendo 1,5 mL de 4% de baixa fusão em 60% de TDE em um banho de água a 37 °C até que liquefaça.
   3. Enquanto isso, prepare um sistema de moldagem feito sob medida feito a partir de uma seringa de 1 mL da qual a ponta é cortada usando um bisturi.
   4. Bombeie na seringa 600 μL da solução gel usando o êmbolo.
   5. Posicione a amostra usando uma ponta de pipeta ampliada, a abertura da qual foi cortada usando uma tesoura estéril.
   6. Preencha a seringa com 400 μL de solução de gel para que a amostra esteja posicionada dentro do terço inferior da seringa.
   7. Deixe o gel polimerizar e armazenar em solução 80% TDE a 4 °C protegido da luz até a aquisição.
   8. Para aquisição de folha light, use um objetivo de 20x imerso em 80% de solução TDE adicionada na câmara de amostra para permitir ajustar com precisão o índice de refração do método de compensação.
   9. Insira a seringa contendo o organoide incorporado agarose no maior suporte de amostra projetado para acomodar uma seringa de 1 mL do qual o êmbolo pode ser operado para posicionar o organoide na frente do objetivo.
      NOTA: A aquisição de uma folha de luz de um organoide inteiro leva aproximadamente 5 a 10 minutos.

4. Imunostaining e limpeza de seções flutuantes livres de organoides forebraínticos dorsais

1. Fixação, incorporação de ágaroses e secção dos organoides
   1. Coletar organoides após 28, 42 e 70 +/- 2 dias de diferenciação em uma placa de 6 poços e fixar durante a noite a 4 °C em 2 mL de 4% PFA.
   2. Enxágüe duas vezes em 2 mL de PBS e conservar a 4 °C em 2 mL de PBS + 0,05% de azida de sódio.
   3. Incorporar os organoides fixos em 4% de baixa derretimento surgiu em um molde de incorporação de plástico (7 x 7 mm). Remova cuidadosamente o bloco de agarose do molde plástico e cole-o ao estágio vibratome.
   4. Se se se section os organoides incorporados usando um vibratome para obter seções flutuantes livres de 150 μm transferidas em um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 μL de PBS usando uma escova de tinta para evitar danificar as seções.
      NOTA: Recomenda-se a agarose de baixo derretimento, pois sua temperatura de fusão é de apenas aproximadamente 60 °C. Prepare 4% de baixa derretimento na solução PBS e deixe esfriar um pouco acima de 37 °C em um banho de água antes da incorporação organoide.
2. Permeabilização, bloqueio e imunossaturação
   1. Incubar as seções em 500 μL de PBS contendo 0,3% Triton X100, na RT, sob agitação, por 20 min. Faça isso três vezes.
   2. Incubar as seções em 500 μL de PBS contendo 0,3% Triton X100 e 5% leite sem gordura, em RT, sob agitação, por 2h.
   3. Incubar as seções em 250 μL de solução de anticorpos primários (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de leite sem gordura), sob agitação, a +4 °C, durante a noite.
   4. Lave as seções em 500 μL de PBS, na RT, sob agitação, por 20 minutos. Faça isso quatro vezes.
   5. Incubar as seções em 250 μL de solução secundária de anticorpos (PBS + 0,3% Triton X100 + 1% de leite sem gordura), na RT, sob agitação, por 2h.
   6. Lave as seções em 500 μL de PBS, na RT, sob agitação, por 20 minutos. Faça isso quatro vezes.
   7. Armazene as seções em 500 μL de PBS, a +4° C até a limpeza.
3. Limpeza em TDE (2,2′ -Thiodietanol)
   1. Incubar as seções em 500 μL de 30% e 60% de TDE para 1h cada na RT e, em seguida, em 500 μL de 80% TDE durante a noite, na RT.
   2. Armazene as seções desmatadas em 500 μL de 80% de TDE até a aquisição a +4 °C.
4. Montagem de seções flutuantes livres antes da aquisição com confocal de varredura ressonante
   1. Monte uma seção flutuante em uma câmara selada permitindo manter a amostra em solução TDE de 80% e projetada para se adaptar em um estágio XY motorizado de microscópios confocal.
   2. Coloque uma tampa redonda no sistema de câmara.
   3. Transfira cuidadosamente a seção imunossuada limpa usando um pincel.
   4. Encha a câmara com 80% de solução TDE.
   5. Adicione duas tampas padrão mais uma tampa redonda de segunda e uma vedação de silicone.
   6. Enrosque o anel de parafuso da câmara para selar perfeitamente o sistema.

5. Folha de luz e análise confocal de varredura ressonante

1. Folha de luz de processo e aquisições de varredura ressonante usando software que permitem visualização e análise 3D de toda a amostra imunostained.
   NOTA: Esse software permite abrir rapidamente dados enormes para fazer facilmente instantâneos e animações. Ele permite mover a amostra em diferentes orientações e gerar visualizações 2D graças a uma ferramenta fatiadora 2D em diferentes orientações, XY e YZ, por exemplo.
2. Para detecção automática de centrosmosos e cilias primárias, use um assistente de ponto que permita quantificar seu número em condições patológicas versus de controle.
3. Para a reconstrução 3D do PC permitindo uma medição precisa de seu comprimento, use um assistente de filamento para corrigir manualmente o ponto de partida do PC e o software usa o sinal de fluorescência para reconstruir o PC com precisão.

Resultados

Modelos baseados em células 2D hIPS para estudar biogênese e função do círio primário
O protocolo aqui detalhado foi adaptado de estudos publicados anteriormente20,21,22. Este protocolo permite a geração de estruturas de roseta neural que contêm progenitores neocorticais e neurônios semelhantes aos vistos no neocórtex em desenvolvimento. A validação detalhada pode ser realizada por meio de análi...

Discussão

O PC é agora considerado como organelas-chave que regulam etapas cruciais durante o desenvolvimento cortical cerebral ^{normal18,19,31}, incluindo a expansão e o compromisso do NSPC ^8,9,10,11,12, bem como migração ^{neuronal13,14}

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoéthanol (50 mM)	ThermoFisher Scientific	31350010
6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Multiple Well Plates	Corning	3471
96-well Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Microplate	Corning	7007
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	ThermoFisher Scientific	12587010
B-27 Supplement (50X), serum free	ThermoFisher Scientific	17504044
CellAdhere Dilution Buffer	StemCell Technologies	7183
DMEM/F-12, Glutamax	ThermoFisher Scientific	31331028
DMSO	ATCC	4-X
Dorsomorphin	StemCell Technologies	72102
Easy Grip 35 10mm	Falcon	353001
EDTA	ThermoFisher Scientific	15575020
EGF , 25µg	Thermofischer	PHG0315
FGF2 , 25µg	Thermofischer	PHG0264
Gentle Cell Dissociation Reagent	StemCell Technologies	7174
Insulin	ThermoFisher Scientific	12585014
KnockOut Serum	ThermoFisher Scientific	10828028
Laminin (1mg)	Thermofischer	23017015
LDN193189	StemCell Technologies	72147
Matrigel Growth Factor Reduced	Corning	354230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	ThermoFisher Scientific	11140050
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381-250G
mTeSR1	StemCell Technologies	85850
Neural Basal Medium	Thermofischer	21103049
Orbital shaker	Dutscher	995002
PBS	ThermoFisher Scientific	14190094
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
PFA 32%	Electron Microscopy Sciences	15714
Poly-L-Ornithine (PO)	Sigma	P4957
Recombinant human BDNF 10 µg	Stem Cell Technologies	78005
Recombinant Human FGF-basic	Peprotech	100-18B
rSHH	R&D Systems	8908-SH
SAG	Santa Cruz	Sc-202814
SB431542	StemCell Technologies	72232
Stembeads FGF2	StemCulture	SB500
Sucrose	Sigma Aldrich	S7903-250G
Superfrost Plus Adhesion Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Supplément N2- (100X)	ThermoFisher Scientific	17502048
TDE 2,2’-Thiodiethanol	Sigma Aldrich	166782-500G
Vitronectin	StemCell Technologies	7180
Y-27632	StemCell Technologies	72304
Primary Antibodies
ARL13B	Abcam	Ab136648	1/200e
ARL13B	Proteintech	17711-1-AP	1/500e
CTIP2	Abcam	Ab18465	1/500e
GLI2	R&D Systems	AF3526	1/100
GPR161	Proteintech	13398-1-AP	1/100
N-Cadherin	BD Transduction Lab	610921	1/500e
P-Vimentin	MBL	D076-3	1/500e
PAX6	Biolegend	PRB-278P	1/200e
PCNT	Abcam	Ab4448	1/1000e
S0X2	R&D Systems	MAB2018	1/200e
SATB2	Abcam	Ab51502	1/200e
TBR2	Abcam	Ab216870	1/400e
TPX2	NovusBio	NB500-179	1/500e
γTUBULIN	Sigma Aldrich	T6557	1/500e
Secondary Antibodies
Donkey anti-rabbit AF488	ThermoFisher Scientific	A21206	1/500e
Goat anti-mouse AF555	ThermoFisher Scientific	A21422	1/500e
Goat anti-mouse AF647	ThermoFisher Scientific	A21236	1/500e
Goat anti-rat AF555	ThermoFisher Scientific	A21434	1/500e