A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
تكشف الأعمال الحديثة عن تأثير الخلايا العصبية على خلايا الورم الدبقي للأطفال عالية الجودة (pHGG) وتفاعلاتها المتبادلة. يظهر العمل الحالي تطور نموذج في المختبر يشارك في زراعة خلايا pHGG والخلايا العصبية الغلوتاماترجية وسجل تفاعلاتها الكهربية لمحاكاة تلك التفاعلات.
تمثل الأورام الدبقية عالية الجودة لدى الأطفال (pHGG) سرطان الدماغ في مرحلة الطفولة والمراهقة التي تحمل تشخيصا كئيبا سريعا. نظرا لوجود حاجة للتغلب على مقاومة العلاجات الحالية وإيجاد طريقة جديدة للعلاج ، فإن نمذجة المرض في أقرب وقت ممكن في وضع المختبر لاختبار أدوية جديدة وإجراءات علاجية أمر صعب للغاية. دراسة العمليات البيولوجية المرضية الأساسية، بما في ذلك فرط حساسية الخلايا العصبية الغلوتاماترجية، سيكون تقدما حقيقيا في فهم التفاعلات بين الدماغ البيئي وخلايا pHGG. لذلك، لإعادة التفاعلات الخلية الخلايا العصبية / pHGG، وهذا العمل يظهر تطوير نموذج وظيفي في المختبر المشاركة في زراعة الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPS) المستمدة من الخلايا العصبية القشرية الجلوتاماترجية خلايا pHGG في أجهزة microfluidic مجزأة وعملية لتسجيل التعديلات الكهربية. كانت الخطوة الأولى هي التمييز وتوصيف الخلايا العصبية الجلوتاماترجية البشرية. ثانيا، تم استزراع الخلايا في أجهزة ميكروفلويديك مع خطوط الخلايا المشتقة من pHGG. ثم تم تضمين البيئة الدقيقة في الدماغ ونشاط الخلايا العصبية في هذا النموذج لتحليل التأثير الكهربائي لخلايا pHGG على هذه الخلايا العصبية البيئية الدقيقة. وتقترن التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الأقطاب (MEA) لهذه الأجهزة microfluidic لمحاكاة الظروف الفسيولوجية وتسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها. تم التأكيد على زيادة كبيرة في استثارة الخلايا العصبية في وجود الخلايا السرطانية.
الأطفال جليوما عالية الجودة (pHGG) معرض التنوع الجيني الموسعة و phenotypic اعتمادا على عمر المريض, موقع الورم التشريحية وتمديد, والسائقين الجزيئية1. وهي أورام الدماغ العدوانية التي يتم التحكم فيها بشكل سيئ مع خيارات العلاج المتاحة حاليا، وهي السبب الرئيسي للوفاة المتعلقة بسرطان الدماغ في الأطفال والمراهقين2. لذلك ، أكثر من 80 ٪ من المرضى يندبون في غضون عامين بعد تشخيصهم ، ومتوسط بقائهم على قيد الحياة هو 9-15 شهرا ، اعتمادا على مواقع الدماغ والطفرات السائق. غياب العلاج العلاجي هو الدافع الرئيسي للبحوث المختبرية ويسلط الضوء على الحاجة الفورية لنهج علاجية مبتكرة جديدة. لهذا الغرض، تم تطوير خطوط الخلايا المشتقة من المريض (PDCL) على أمل توفير التنوع pHGG3 في خطوط ثنائية الأبعاد (2D) و / أو ثلاثي الأبعاد (3D) الأعصاب. ومع ذلك، فإن تلك الثقافات المشتقة من المريض في الخلايا المختبرية لا تحاكي جميع الحالات المتغيرة في الدماغ. لا تأخذ هذه النماذج في الاعتبار البيئات التشريحية العصبية المجهرية والمجهرية الموصوفة عادة في pHGG.
عادة، يتطور pHGG في الأطفال الأصغر سنا بشكل رئيسي في مناطق بونتين والثالامي، في حين يركز HGG للمراهقين والشباب في المناطق القشرية، وخاصة في الفصوص الجبهية الصدغية1. هذه الخصائص الموقع عبر أعمار الأطفال ويبدو أن تنطوي على بيئات مختلفة تؤدي إلى تكوين الدبقية وشبكة علاج بين الخلايا السرطانية ونشاط الخلايا العصبية محددة4,5,6. على الرغم من أن الآليات لا تزال غير محددة، يتطور pHGG بشكل رئيسي من الخلايا السليفة العصبية على طول مسار التمايز من الأنساب الفلكية والأوليغوديندروغليال. في حين أن دور هذه الأنساب الدبقية كان لفترة طويلة يقتصر على الدعم الهيكلي البسيط للخلايا العصبية ، فمن الواضح الآن أنها تتكامل تماما في الدوائر العصبية وتظهر تفاعلات معقدة ثنائية الاتجاه بين الخلايا العصبية الدبقية القادرة على إعادة تنظيم المناطق الهيكلية للدماغ وإعادة تشكيل الدوائر العصبية4،7،8 . وعلاوة على ذلك، تشير قطع متزايدة من الأدلة إلى أن الجهاز العصبي المركزي (CNS) يلعب دورا حاسما في بدء سرطان الدماغ وتطوره. ركزت الأعمال الأخيرة على نشاط الخلايا العصبية ، والذي يبدو أنه يدفع نمو وداء العث من الأورام الخبيثة الدبقية من خلال عوامل النمو المفرزة والاتصالات الكهروكيميائية المباشرة6،9. على نحو متبادل، يبدو أن الخلايا الدبقية عالية الجودة تؤثر على وظيفة الخلايا العصبية مع زيادة نشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وتعديل تشغيل الدوائر التي يتم دمجها فيها هيكليا وكهربائيا9. لذا، أظهرت الدراسات التي تستخدم نماذج مشتقة من المريض وأدوات علم الأعصاب الجديدة التي تتحكم في عمل الخلايا العصبية تأثيرا خاصا بالدائرة لنشاط الخلايا العصبية على موقع الورم الدبقي والنمو والتقدم. معظم هذه التوقعات العصبية المشاركة في الأورام الدبقية هي الجلوتاماترجية والتواصل من خلال إفرازات الغلوتامات. المؤشرات الحيوية الجلوتاماترجية المحددة مثل mGluR2 أو vGlut1/2 توصف عادة6.
ومن المثير للاهتمام، على الرغم من عدم التجانس الجزيئي، الأطفال والكبار جليوماس عالية الجودة تظهر استجابة التكاثر نموذجية لنشاط الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وغيرها من العوامل المفرزة مثل neuroligin-3 أو BDNF (عامل العصبية المشتقة من الدماغ)4،6،10،11،12،13 . في المناطق القشرية, الأطفال والكبار HGGs يمكن أن تحفز فرط الخلايا العصبية من خلال زيادة إفراز الغلوتامات وتمنع الخلايا الداخلية GABA مما يؤدي إلى الأورام الدبقية المرتبطة نشاط شبكة الصرع14,15. وعلاوة على ذلك، يمكن إعادة تشكيل الدوائر العصبية من قبل الأورام الدبقية دفع مهام عصبية محددة، على سبيل المثال، اللغة، ويمكن الاستيلاء على نشاط الخلايا العصبية المنظمة إضافية9.
وبناء على هذا الأساس المنطقي، يجب توضيح وتعزيز فهم الاتصالات ثنائية الاتجاه بين خلايا الورم الدبقي والخلايا العصبية بشكل كامل ودمجها مع المراحل المبكرة من نهج pHGG في المختبر. مثل هذه النمذجة المبتكرة أمر بالغ الأهمية في فهم وقياس تأثير النشاط الكهربائي العصبي أثناء اختبار المخدرات وتوقع استجابة pHGG في دوائر الدماغ. التطورات الأخيرة في أدوات علم الأعصاب، مثل الأجهزة microfluidic وأعمال البحوث pHGG، هي السرير لتطوير نهج النمذجة الجديدة وتكون قادرة الآن على دمج البيئة الدقيقة في الدماغ في نماذج pHGG المختبر3،16،17،18،19. إلى جانب التسجيلات الكهربية باستخدام صفائف متعددة الإلكترونات (MEA) ، توفر الأجهزة الدقيقة 20،21،22 إمكانية محاكاة الظروف الفسيولوجية أثناء تسجيل النشاط الكهربائي للشبكة العصبية بأكملها واستخراج معلمات اتصال الشبكة في ظل عدة ظروف. يسمح هذا الجهاز23,24 أولا بالترسب الدقيق للخلايا في غرفة مباشرة على MEA. تمكن هذه التكنولوجيا من التحكم في كثافة وبذر الخلايا والتجانس على MEA والتحكم الدقيق في تبادل الوسائط ، وهي خطوة حاسمة لتمايز السلف العصبي البشري مباشرة إلى أجهزة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون البذور غرفة الترسيب الحالية مع خلايا متعددة في نقاط زمنية مختلفة.
لذلك، تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج وظيفي في المختبر يشارك في زراعة الخلايا العصبية القشرية المشتقة من الجلوتاماترجية البشرية (hiPS) والخلايا المشتقة من pHGG في أجهزة microfluidic وتسجيل نشاطها الكهربائي لتقييم التفاعلات الكهربائية بين مجموعتي الخلايا. أولا، تم الحصول على الخلايا العصبية الغلوتاماترجية القشرية المشتقة من hiPS وتتميز في الأجهزة الدقيقة فلوريدية في مراحل مختلفة من الثقافة [اليوم 4 (D4)، كخلايا hiPS، واليوم 21 (D21) واليوم 23 (D23)، والخلايا العصبية نضجت الجلوتاماترجية]. للخطوة الثانية من الثقافة المشتركة، تم استخدام نموذجين pHGG: خط UW479 الأطفال التجارية وخلايا pHGG بدأت من ورم المريض (BT35)3، تحمل طفرة سائق K27M H3.3. وأخيرا، قمنا بإجراء تسجيلات كهربية للخلايا الجلوتاماترجية في D21 قبل بذر خلايا pHGG وD23 بعد 48 ساعة من الثقافة المشتركة في نفس الجهاز microfluidic. تميزت التفاعلات بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا pHGG بزيادة كبيرة في النشاط الكهربي المسجل.
بالنسبة لهذا البروتوكول، فإن رقم الاعتماد المتعلق باستخدام المواد البشرية هو DC-2020-4203.
1. تصنيع الجهاز microfluidic، وإعداد والعلاج
2. إعداد الخلية وبذر في الجهاز microfluidic
3. بروتوكول الثقافة المشتركة
4. التسجيل الكهروفيزيولوجي
5. معالجة البيانات الكهربية
قبل دراسة التفاعلات الكهربائية بين الخلايا العصبية الغلوتاماترجية وخلايا الورم الدبقي، تم وصف الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS للتحقق من جدوى زراعة هذه الخلايا في الأجهزة الدقيقة (الشكل 1A). تم تقييم توصيفها باستخدام نستين، Sox2، mGlurR2 (مستقبلات الغلوتامات...
يصف هذا العمل نموذجا وظيفيا دقيقا في المختبر لتقييم التفاعل بين الخلايا العصبية القشرية المشتقة من hiPS البشرية والخلايا السرطانية في الدماغ في الأجهزة الدقيقة. واحدة من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول كان التمايز hiPS في الخلايا العصبية الجلوتاماترجية، والتي أكدت من خلال انخفاض تلط...
AB، MG، JR، LM، ML، JV، DD يعملون من قبل NETRI، FL هو الرئيس التنفيذي للتكنولوجيا في NETRI، وTH هو الرئيس العلمي في NETRI. وليس لدى المؤلفين الآخرين ما يكشفون عنه.
وقد دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج سات كونيكوس، ومؤسسة جامعة ستراسبورغ، و«J'ai demandé la lune»، و«Une roulade pour Charline»، و«LifePink»، و«فرانك، وريون دي سوليه» و«Semeurs d'Etoile». نشكر الأطفال والأسر المتضررة من مجموعات HG على مساهماتهم في هذا البحث ودعمهم.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
256MEA100/30iR-ITO-w/o | MCS | 256MEA100/30iR-ITO-w/o | |
40 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 53750 | |
60 µm probe for Scepter counter | Dutscher | 51999 | |
Accutase | Sigma | A6964 | |
Ala -Gln (GlutaMAX) | Sigma | G8541 | |
Axel Observer 7 Microscope | Zeiss | 431007-9904-000 | |
Cell culture flask with cap with filter membrane 70 mL Falcon® | Dutscher | 353109 | |
Class II Biological Safety Cabinet | Thermo Scientific | HERASafe type KS12 | |
Colibri 7 LED | Zeiss | 4230529710-000 | |
Cortical Glutamatergic Neurons | BrainXell | BX-0300 | |
DMEM/F-12 (1:1) GlutaMAX | Gibco | 31331-028 | |
DMEM/F12 Medium | Sigma | D8437 | |
DPBS 1X | Dutscher | L0615-500 | |
EasYFlaskTM cell culture flasks 75cm3 | Nunc | 156499 | |
Foetal Bovine Serum (FBS) | Dutscher | 500105 | |
GDNF | Peprotech | 450-10 | |
Geltrex | Life Technologies | A1413201 | |
Human BDNF | Peprotech | 450-02 | |
Incubator | Memmert | IC0150med | |
MCS InterFace Boarder | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
MEA2100 | MCS | 181205-MEA2100-11240 | |
Micropipette P10 | Sartorius | LH-729020 | |
Micropipette P100 | Sartorius | LH-729050 | |
Micropipette P1000 | Sartorius | LH-729070 | |
Micropipette P200 | Sartorius | LH-729060 | |
Microtube Eppendorf 1,5 ml Safe-Lock | Dutscher | 33290 | |
MultiChannel Experimenter | MCS | - | |
N2 Supplement-A | StemCell | 7152 | |
Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
Neurocult SM1 neuronal supplement | StemCell | 5711 | |
Non filter tip 0.1 - 10 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 030570ACL | |
Non filter tip 1 - 200 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 032260CL | |
Non filter tip 50 - 1250 µl ClearLine® sterile in removable-lid rack | Dutscher | 134760CL | |
Non-essential amino acids (NEAA) without L-glutamine | Dutscher | X0557-100 | |
Pipeteur Pipet-Aid XP Gravity | Drummond | 4000202/4038202 | |
Pipette for cell culture 10 mL Falcon® | Dutscher | 357551 | |
Pipette for cell culture 5 mL Falcon® | Dutscher | 357543 | |
Plaque chauffante (CultureTemp) | Belart | 370151000 | |
Poly-D-Lysine | Sigma | P6407 | |
Primovert microscope | Zeiss | 415510-1100-000 | |
Scepter (Handheld Automated Cell Counter) | Millipore | PHCC00000 | |
TGF-β1 | Peprotech | 100-21C | |
Tube with conical bottom 15 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352096 | |
Tube with conical bottom 50 mL (bulk) Falcon® | Dutscher | 352070 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved